Preparação de fatias aguda da medula espinhal para a gravação de células inteiras remendo-braçadeira nos neurônios da substância Gelatinosa
Summary
Aqui, descrevemos os passos essenciais para gravações de células inteiras remendo-braçadeira feitas de neurônios da substância gelatinosa (SG) na fatia da medula espinhal em vitro . Esse método permite que as propriedades intrínsecas da membrana, transmissão sináptica e caracterização morfológica dos neurônios SG para ser estudado.
Abstract
Estudos recentes de células inteiras remendo-braçadeira de neurônios da substância gelatinosa (SG) forneceram uma grande quantidade de informações sobre os mecanismos da coluna vertebral subjacente a transmissão sensorial nociceptivo regulamento e desenvolvimento de dor ou coceira crônico. Implementações de gravações eletrofisiológicas juntamente com estudos morfológicos, baseados sobre a utilidade das fatias aguda da medula espinhal têm melhorado ainda mais nossa compreensão das propriedades neuronais e a composição dos circuitos locais em SG. Aqui, apresentamos um guia detalhado e prático para a preparação de fatias da medula espinhal e show de gravação de células inteiras representativa e resultados morfológicos. Este protocolo permite preservação neuronal ideal e pode imitar condições na vivo até certo ponto. Em resumo, a capacidade de obter uma preparação em vitro de medula espinhal fatias permite gravações de braçadeira da tensão e corrente estável e assim poderia facilitar investigações detalhadas sobre as propriedades intrínsecas da membrana, circuitos locais e estrutura neuronal usando diversas abordagens experimentais.
Introduction
A substância gelatinosa (SG, lâmina II do Corno dorsal da coluna vertebral) é um centro de retransmissão indiscutivelmente importante para transmitir e regulamenta a informação sensorial. É composto por interneurônios excitatórios e inibitórios, que recebem entradas das fibras aferentes primárias, interneurônios locais e a endógena de sistema inibitório descendente1. Nas últimas décadas, o desenvolvimento da preparação de fatia aguda da medula espinhal e o advento da gravação de células inteiras remendo-braçadeira permitiram que vários estudos sobre as propriedades intrínsecas eletrofisiológicos e morfológicos da SG neurônios2, 3 , 4 , bem como estudos os circuitos locais em SG5,6. Além disso, usando a preparação de fatia de medula espinhal em vitro , pesquisadores podem interpretar as mudanças no neuronal excitabilities7,8, a função do íon canais9,10, e atividades sinápticas11,12 , sob várias condições patológicas. Estes estudos têm aprofundado nossa compreensão do papel que os neurônios SG desempenham no desenvolvimento e manutenção da dor crônica e coceira neuropática.
Essencialmente, o pré-requisito fundamental para alcançar uma clara visualização da soma neuronal e ideal de células inteiras remendo usando fatias aguda da medula espinhal é para garantir a qualidade excelente de fatias então neurônios saudáveis e patchable podem ser obtidos. No entanto, preparar fatias de medula espinhal envolve várias etapas, como realizando uma laminectomia ventral e remoção da membrana pia-aracnoide, que pode ser obstáculos na obtenção de fatias saudáveis. Embora não seja fácil preparar fatias da medula espinhal, realizar gravações em vitro na medula espinhal fatias tem várias vantagens. Em comparação com preparações da cultura de pilha, fatias da medula espinhal podem preservar parcialmente inerentes conexões sinápticas que estão em uma condição fisiologicamente relevante. Além disso, a célula inteira remendo-braçadeira gravação usando fatias de medula espinhal poderia ser combinado com outras técnicas, tais como remendo duplo grampo13,14, estudos morfológicos15,16 e célula única RT-PCR 17. portanto, esta técnica fornece mais informações sobre caracterizando as diversidades genéticas e anatômicas em uma região específica e permite a investigação da composição do circuito local.
Aqui, nós fornecemos uma descrição básica e detalhada do nosso método para preparar fatias aguda da medula espinhal e adquirir as gravações de células inteiras remendo-braçadeira de neurônios SG.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo detalha as etapas para a preparação de fatias da medula espinhal, que usamos com sucesso ao realizar experimentos de células inteiras remendo-braçadeira na SG neurônios18,19,20,21. Ao implementar esse método, nós informou recentemente que a minociclina, uma segunda geração de tetraciclina, marcadamente poderia reforçar a transmissão sináptica inibitória através de u…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 81560198, 31660289).
Materials
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
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