Drosophila Bein Motoneuronen Axone durch die Erwachsenen Nagelhaut zu visualisieren
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung der axonalen targeting mit ein fluoreszierendes Protein in Erwachsenen Beinen von Drosophila durch Fixierung, Montage, imaging und Post-Bildgebung Schritte.
Abstract
Der Großteil der Arbeit auf der neuronalen Spezifikation wurde in genetisch und physiologisch gefügig Modellen wie z.B. Cdurchgeführt. Elegans, Drosophila Larven und Fische, die alle in Mischstrom Bewegungen (wie kriechen oder Schwimmen) als ihre primäre Form der Fortbewegung zu engagieren. Jedoch eine anspruchsvollere Verständnis der einzelnen Motoneuron (MN) Spezifikation – zumindest in Bezug auf die Information der Krankheit Therapien – erfordert eine ebenso steuerbar System, das besser die komplexen Anhängsel-basierte Fortbewegung Systeme der Modelle Wirbeltiere. Erwachsenen Drosophila Bewegungsapparates verantwortlich für zu Fuß erfüllt alle diese Kriterien mit Leichtigkeit, da in diesem Modell es möglich ist, die Spezifikation einer kleinen Anzahl von leicht unterschieden Bein MNs (ca. 50 MNs pro Bein) zu studieren beide mit einem riesigen Reihe von genetischen Werkzeuge und in der physiologischen Rahmen ein Anhängsel-basierte Fortbewegung. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um das Bein Muskel Innervation in einem Erwachsenen fliegen zu visualisieren.
Introduction
Wie das vertebrate Glied gliedert sich die Drosophila Erwachsenen Bein in Segmente. Jede Fliege Bein enthält 14 Muskeln, von die jeder mehrere Muskelfasern1,2umfasst. Die Zellkörper der Erwachsenen Bein MNs befinden sich in der T1 (prothoracic), T2 (mesothoracic) und T3 (metathoracic) Ganglien auf jeder Seite der ventralen Nervenstrang (VNC), strukturell analog zu den Wirbeltieren Rückenmark (Abbildung 1). In jedem Ganglien, welches Ziel in vier Segmenten des ipsilateralen Beins (Coxa, Trochanter, Femur und Tibia) (Abbildung 1)3Muskeln gibt es etwa 50 MNs. Wichtig ist, hat jedes einzelnen Erwachsenen Bein MN eine eindeutige morphologische Identität, die zwischen Tieren3,4sehr Stereotyp ist. Diese einzigartige MNs stammen aus 11 Stammzellen genannt Neuroblasten (NBs) produzieren Bein MNs während der Larvenstadien3,4. Am Ende alle Larvenstadien unterschieden werden die unreifen postmitotischen MNs während der Metamorphose zu erwerben, ihre spezifischen dendritischer Dorne und axonalen terminal Ziele, die ihre einzigartigen Morphologie3,4definieren. Zuvor haben wir die Hypothese, dass ein kombinatorischer Code von Transkriptionsfaktoren (TFs) die einzigartige Morphologie jedes Drosophila Erwachsenen Bein MN5 gibtgetestet. Als ein Modell haben wir Linie B, einer der 11 NB Linien die sieben von der MNs produziert und hat gezeigt, dass ein kombinatorischer Code von TFs in postmitotischen Erwachsenen Bein MNs ausgedrückt ihre individuelle Morphologien diktiert. Durch Umprogrammieren des TF-Codes des MNs konnten wir MN Morphologien in einer vorhersagbaren Weise wechseln. Wir nennen diese TFs: MTF (morphologische TFs)5.
Eines der schwierigsten Teile der morphologischen Analysen der Erwachsenen MNs ist die Axone durch eine Dicke und Auto-fluoreszierende Kutikula mit hoher Auflösung zu visualisieren. Wir bezeichnen in der Regel Axone mit einer Membran-Tags GFP, die mit einem binären Ausdruck System, wie DVglut-Gal4MNs ausgedrückt wird /FH-mCD8::GFP oder DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, wo DVglut ist ein starker Motor, ausgedrückt in Motoneurone6. Durch die Kombination dieser Tools mit anderen klonalen Techniken wie Mosaik-Analyse mit einem tragen Marker (MARCM)7, Cis-MARCM8oder MARCMbow5, können wir die GFP Ausdruck Subpopulationen von MNs die phänotypische Analyse beschränken. der Axone einfacher. Wir haben ein Protokoll erzeugt, um Bein MN axonalen Morphologie für Bildbearbeitung und anschließende 3D-Rekonstruktion intakt zu halten, durch bestimmte Fragen untrennbar mit den Erwachsenen Drosophila Bein wie (1) Fixierung der internen Strukturen von Erwachsenen Bein ohne Axon Morphologie, endogene fluoreszierende Ausdruck und Beinmuskulatur, (2) Montage des Beines, die gesamte Struktur unter einem Deckgläschen und in der entsprechenden Orientierung für Bildverarbeitungs-Bildgebung und (3) um die Nagelhaut zu erhalten zu bewahren Hintergrund sowie axonalen Fluoreszenzsignal. Während dieses Protokolls für den Nachweis von fluoreszierenden Ausdruck in MN Axone detailliert wurde, kann es angewendet werden, um andere Bestandteile des Bein Neuromusculature in Arthropoden zu visualisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Cuticula von Erwachsenen Drosophila und anderen Arthropoden, die vielen dunklen Pigmente enthält, ist ein großes Hindernis für die Anzeige von Strukturen im Inneren ihres Körpers. Darüber hinaus ist es stark Auto fluoreszierend, durch Fixierung verschlimmert. Diese beiden Funktionen sind sehr problematisch für Beobachtungen von Fluoreszenzfarbstoffen oder Molekülen im Körper von Tieren mit ein Exoskelett.
Das Verfahren, die wir beschrieben haben und dass wir routinemäßig im Labor…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Robert Renard für die Zubereitung von fliegen Essen Medium. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen NIH Grant NS070644, R.S.M und Finanzierung aus dem ALS Association (#256), FRM (#AJE20170537445) und ATIP-Avenir Programm, j.e.
Materials
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100×85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22×22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
Referenzen
- Miller, A., Demerec, M. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. , 420-531 (1950).
- Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons. Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).
- Enriquez, J., Mann, R. S. Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).
- Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila. Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map. PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).
