Summary

Derivação e diferenciação de células-tronco mesenquimais ovário canina

Published: December 16, 2018
doi:

Summary

Aqui, descrevemos um método para o isolamento, expansão e diferenciação de células-tronco mesenquimais de tecido ovariano canina.

Abstract

Interesse em células-tronco mesenquimais (MSCs) aumentou na última década devido a sua facilidade de expansão de isolamento e cultura. Recentemente, estudos têm demonstrado a capacidade de diferenciação de largura que estas células possuem. O ovário representa um candidato promissor para terapias baseadas em células, devido ao fato de que é rica em MSCs e que ela frequentemente é descartada após cirurgias de ovariectomia como resíduos biológicos. Este artigo descreve os procedimentos para o isolamento, a expansão, e diferenciação de MSCs derivado do ovário canino, sem a necessidade de ordenação de células técnicas. Este protocolo representa uma importante ferramenta para a medicina regenerativa devido a ampla aplicabilidade destas células altamente diferenciável em ensaios clínicos e terapêuticos, usa.

Introduction

O número de estudos publicados que foco sobre células-tronco tem aumentado substancialmente na última década, um esforço de investigação que tem sido alimentado pelo objetivo coletivo de descobrir terapias da medicina regenerativa poderosa. Células-tronco têm dois marcadores definição primárias: autorenovação e diferenciação. Células-tronco mesenquimais são responsáveis por volume de negócios de tecido normal e têm uma capacidade mais restrita de diferenciação em comparação com células-tronco embrionárias1. Recentemente, muitos estudos têm mostrado uma vasta gama de diferenciação do MSCs, e um tema em discussão é se existem diferenças entre as células-tronco embrionárias e adultas em todos os2.

O epitélio de superfície ovarium é uma camada não confirmada de células, relativamente menos diferenciada, que expressa ambos os marcadores epiteliais e mesenquimais3, mantendo a capacidade de se diferenciarem em diferentes tipos de células em resposta a sinais ambientais4. A localização exata de células-tronco no ovário não é bem conhecida; no entanto, tem sido proposto que bipotential progenitores na túnica albugínea originar células germinativas5. Estudos imunológicos têm a hipótese de que estas células têm uma origem do estroma6 ou estão localizados em ou proximal para a superfície do ovário7. Uma vez que as células-tronco mesenquimais express numerosos receptores que desempenham um papel importante na aderência de célula8, um experimento foi concebido para testar a hipótese de que a seleção de uma população de células com a rápida adesão iria isolar uma população de células claramente characterizable como mesenquimais na natureza. Recentemente, nosso grupo relatou a derivação de MSCs de tecido ovariano com base na sua capacidade de aderência à superfície plástica do prato cultura nas primeiras 3 horas de cultura, a fim de obter uma população purificada de células exibindo rápida adesão9. Aqui, descrevemos o método desenvolvido por isolamento de células-tronco mesenquimais do tecido do ovário.

Protocol

Esta experiência foi realizada com os ovários de quatro cães femininos rafeiros doados após a cirurgia eletiva em um programa de esterilização canina. Este experimento foi aprovado pelo Comitê de ética no uso de animais da UNESP-FCAV (protocolo n º 026991/13). 1. preparação experimental Preparar ou comprar 500 mL de fosfato salino de estéril Dulbecco (DPBS) sem cálcio ou magnésio. Preparar uma colagenase armazeno solução através da mistura de 40 µ g da enz…

Representative Results

Isolamento de células-tronco mesenquimais de ovário canino: O procedimento de isolamento de MSC ovário está resumido na Figura 1. Após a cirurgia, tecido de picagem, digestão de colagenase e uma mudança de mídia 3 h após o início da cultura, uma população de MSC putativa com propriedades de plástico adesivo rápidas foi com êxito isolada de tecido ovar…

Discussion

Aqui nós fornecemos evidências que MSCs podem ser isolados de tecido ovariano canino, que é considerado lixo biológico após ovariectomia. Devido ao fato de que muitos tipos de células podem ser encontrados no ovário, propusemos um protocolo para selecionar MSCs baseadas sua rápida aderência ao plástico, que com sucesso selecionado células que cresceram em uma monocamada com uma morfologia de fibroblasto tipo.

O primeiro relatório da derivação do MSCs da medula óssea baseou-se na…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem o programa de esterilização canina na UNESP-FCAV para gentilmente fornecendo os ovários. Este trabalho foi financiado por doações da FAPESP (processo n º 2013/14293-0) e a CAPES.

Materials

DPBS  Thermo Fisher 14190144
Collagenase I Thermo Fisher 17100017
Tissue flask Corning CLS3056
DMEM low glucose Thermo Fisher 11054020
FBS Thermo Fisher 12484-010
TrypLE express Thermo Fisher 12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit StemCell 5110
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15070063
CD45 AbD Serotec MCA 2035S
CD34 AbD Serotec MCA 2411GA
CD90 AbD Serotec MCA 1036G
CD44 AbD Serotec MCA 1041
Nestin Milipore MAB353
β-Tubulin  Milipore MAB1637
DDX4 Invitrogen PA5 -23378
IgG- FITC AbD Serotec STAR80F
IgG- FITC AbD Serotec STAR120F

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Hill, A. B., Hill, J. E., Bressan, F. F., Miglino, M. A., Garcia, J. M. Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (142), e58163, doi:10.3791/58163 (2018).

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