Summary

Uma medida de cromatografia líquida de alta performance da Quinurenina e ácido cinurênico: matéria bioquímica de cognição e sono em ratos

Published: August 19, 2018
doi:

Summary

Alterações em metabólitos neuroativos Quinurenina caminho (KP) estão implicadas em doenças psiquiátricas. Investigar os resultados funcionais de um Quinurenina alterado via metabolismo na vivo em roedores pode ajudar a elucidar as novas abordagens terapêuticas. O protocolo atual combina abordagens bioquímicas e comportamentais para investigar o impacto de um desafio de Quinurenina aguda em ratos.

Abstract

O caminho da Quinurenina (KP) de degradação do triptofano tem sido implicado em transtornos psiquiátricos. Especificamente, o metabólito derivado astrocyte cinurênico ácido (KYNA), um antagonista em ambos N-metil-d-aspartato (NMDA) e α7 os receptores nicotínicos de acetilcolina (α7nACh), tem sido implicado em processos cognitivos na saúde e na doença. Como CLAYDSON níveis são elevados no cérebro de pacientes com esquizofrenia, uma avaria no glutamatérgico e receptores colinérgicos é acreditada para ser causalmente relacionadas com disfunção cognitiva, um domínio principal da psicopatologia da doença. CLAYDSON pode desempenhar um papel significativo pathophysiologically em indivíduos com esquizofrenia. É possível elevar CLAYDSON endógena do cérebro de roedor, tratar os animais com o Quinurenina bioprecursor direto, e estudos pré-clínicos em ratos demonstraram que elevações agudas na CLAYDSON podem impactar seus processos de aprendizagem e memória. O atual protocolo descreve esta abordagem experimental em detalhe e combina a) uma análise bioquímica da Quinurenina níveis no sangue e cérebro formação de CLAYDSON (usando cromatografia líquida de alta eficiência), teste b) comportamental para sondar o dependentes do hipocampo memória contextual (paradigma de vacância passiva) e c) uma avaliação do comportamento de sono-vigília [gravações telemetria combinando o eletroencefalograma (EEG) e eletromiografia (EMG) sinais] em ratos. Tomados em conjunto, uma relação entre elevados CLAYDSON, sono e cognição é estudada, e este protocolo descreve detalhadamente uma abordagem experimental para compreender os resultados da função de elevação Quinurenina e CLAYDSON formação na vivo em ratos. Resultados obtidos através de variações deste protocolo irão testar a hipótese de que o KP e CLAYDSON servem papéis pivotal em modulação sono e cognição nos Estados de saúde e na doença.

Introduction

A KP é responsável pela degradação de quase 95% do aminoácido essencial triptofano1. O cérebro de mamíferos, Quinurenina tidas em astrócitos é metabolizada na molécula pequena neuroativos CLAYDSON principalmente pela enzima Quinurenina aminotransferase (KAT) II2. CLAYDSON age como um antagonista nos receptores NMDA e α7nACh no cérebro2,3,4, e também alvos receptores, incluindo receptor aril hidrocarboneto (AHR) e a G-proteína de sinalização acoplado receptor 35 (GPR35)5 ,6. Em animais experimentais, elevações no cérebro CLAYDSON foram mostradas para prejudicar seu desempenho cognitivo em uma matriz de ensaios comportamentais2,7,8,9,10 . Uma hipótese emergente sugere que CLAYDSON desempenha um papel central na modulação de funções cognitivas pelo impacto de vigília-sono comportamento11, assim apoiam o papel das moléculas de derivados astrocyte em modulando a neurobiologia do sono e cognição,12.

Clinicamente, elevações em CLAYDSON foram encontradas no líquido cefalorraquidiano e tecido cerebral de post-mortem de pacientes com esquizofrenia13,14,15,16, um transtorno psiquiátrico debilitante caracterizada por deficiências cognitivas. Pacientes com esquizofrenia são também muitas vezes atormentados por distúrbios de sono que podem agravar a doença17. Compreender o papel do metabolismo de KP e CLAYDSON na modulação de uma relação entre o sono e cognição, particularmente entre a aprendizagem e memória, pode levar ao desenvolvimento de novas terapias para o tratamento destes resultados pobres em esquizofrenia e outros doenças psiquiátricas.

Um método confiável e consistente para a medição de metabólitos de KP é importante assegurar que as pesquisas emergentes de diferentes instituições podem ser integradas a compreensão científica da biologia de KP. Neste momento, descrevemos a metodologia para medir Quinurenina no plasma de ratos e CLAYDSON em cérebro de ratos por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). O presente protocolo, que faz uso de uma detecção fluorimétrica na presença de Zn2 +, foi desenvolvido por Shibata18 e mais recentemente adaptado e otimizado para derivatize com acetato de zinco de 500 mM como o reagente pós-coluna, permitindo a a detecção de endógena, quantidades nanomolar de CLAYDSON no cérebro11.

Para estimular a produção de CLAYDSON endógena de novo como descrito no presente protocolo, a Quinurenina bioprecursor direto é injectada intraperitonealmente (i.p.) em ratos. Em combinação com avaliações bioquímicas para determinar o grau de produção CLAYDSON, os impactos de uma Quinurenina desafiam a memória hipocampo-dependente (paradigma de vacância passiva) e a arquitetura de sono-vigília (sinais de EEG e EMG) é também investigadas,11. Uma combinação destas técnicas permite o estudo do impacto bioquímico e funcional de um Quinurenina desafio na vivo em ratos.

Protocol

Nossos protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de utilização e cuidados animais institucionais da Universidade de Maryland e seguiram guia do National Institutes of Health para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Nota: O adulto ratos machos Wistar (250-350 g) foram utilizados em todos os experimentos. Coortes separadas dos animais foram utilizados para análise bioquímica, experimentos comportamentais e gravações de sono-vigília. Os animais foram alojados em insta…

Representative Results

Para validar o uso de uma injeção intraperitoneal Quinurenina como um método para elevar o cérebro CLAYDSON, foi realizada uma análise HPLC de tecido. Curvas padrão (Figura 1) foram construídas usando o software associado e permitido para a quantificação das amostras de tecido. Cromatogramas representativas para Quinurenina e CLAYDSON são apresentadas na Figura 2. Quinurenina foi observada em um tempo de retenção de 6…

Discussion

Para uma avaliação fiável da CLAYDSON no cérebro após uma administração Quinurenina periférica, é fundamental para combinar e interpretar experimentos bioquímicos e funcionais. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que permite que novos usuários para estabelecer métodos eficazes para medir o plasma Quinurenina e cérebro CLAYDSON de ratos. A medição da Quinurenina no plasma confirmou a injeção exata e a medição de um metabólito CLAYDSON confirma a síntese de novo no cérebro. Existem vár…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O presente estudo foi financiado em parte pelo National Institutes of Health (R01 NS102209) e uma doação do Clare E. Forbes Trust.

Materials

Wistar rats Charles River Laboratories adult male, 250-350 g
L-kynurenine sulfate Sai Advantium
ReproSil-Pur C18 column (4 x 150 mm) Dr. Maisch GmbH
EZ Clips Stoelting Co. 59022
Mounting materials screws PlasticsOne 00-96 X 1/16
Nonabsorbable Sutures MedRep Express 699B CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12
Absorbable Sutures Ethicon J310H 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1
Dental Cement Stoelting Co. 51458
Drill Bit Stoelting Co. 514551 0.45 mm
Name Company Catalog Number Comments
Alliance HPLC system
E2695 separation module Waters 176269503
2475 fluorescence detector Waters 186247500
post-column reagent manager Waters 725000556
Lenovo computer Waters 668000249
Empower software Waters 176706100
Name Company Catalog Number Comments
Passive avoidance box for rat
Extra tall MDF sound attenuating cubicle MedAssociates ENV-018MD Interior: 22"W x 22"H x 16"D
Center channel modulator shuttle box chamber MedAssociates ENV-010MC
Stainless steel grid floor for rat MedAssociates ENV-010MB-GF
Auto guillotine door MedAssociates ENV-010B-S
Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat MedAssociates ENV-010MB-QD
Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel MedAssociates ENV-221M
Sonalert module with volume control for rat chamber MedAssociates ENV-223AM
SmartCtrl 8 input/16 output package MedAssociates DIG-716P2
8 Channel IR control for shuttle boxes MedAssociates ENV-253C
Infrared source and dectector array strips MedAssociates ENV-256
Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz MedAssociates SG-6080C
Dual range constant current aversive stimulation module MedAssociates ENV-410B
Solid state grid floor scrambler module MedAssociates ENV-412
Dual A/B shock control module MedAssociates ENV-415
2' 3-Pin mini-molex extension MedAssociates SG-216A-2
10' Shock output cable, DB-9 M/F MedAssociates SG-219G-10
Shuttle shock control cable 15', 6 MedAssociates SG-219SA
Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz MedAssociates SG-6080D
PCI interface package MedAssociates DIG-700P2-R2
Shuttle box avoidance utility package MedAssociates SOF-700RA-7
Name Company Catalog Number Comments
Sleep-Wake Monitoring Equipment
Ponehmah software Data Sciences International (DSI) PNP-P3P-610
MX2 8 Source Acquisition interface Data Sciences International (DSI) PNM-P3P-MX204
Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit Data Sciences International (DSI) 271-0112-013
Dell 19" computer monitor Data Sciences International (DSI) 271-0113-001
Receivers for plastic cages, 8x Data Sciences International (DSI) 272-6001-001
Cisco RV130 VPN router Data Sciences International (DSI) RV130
Matrix 2.0 Data Sciences International (DSI) 271-0119-001
Network switch Data Sciences International (DSI) SG200-08P
Neuroscore software Data Sciences International (DSI) 271-0171-CFG
Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET Data Sciences International (DSI) 270-0134-001

Referenzen

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Baratta, A. M., Viechweg, S. S., Mong, J. A., Pocivavsek, A. A High-performance Liquid Chromatography Measurement of Kynurenine and Kynurenic Acid: Relating Biochemistry to Cognition and Sleep in Rats. J. Vis. Exp. (138), e58129, doi:10.3791/58129 (2018).

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