Una medida de la cromatografía líquida de alto rendimiento de quinurenina y ácido quinurénico: relacionados con la bioquímica cognición y sueño en ratas
Summary
Alteraciones en los metabolitos de quinurenina vía (KP) neuroactivos implicados en enfermedades psiquiátricas. Investigar los resultados funcionales de un alterado quinurenina vía metabolismo en vivo en los roedores puede ayudar a elucidar nuevos enfoques terapéuticos. El protocolo actual combina enfoques bioquímicos y de comportamiento para investigar el impacto de un desafío de quinurenina aguda en ratas.
Abstract
La vía de la quinurenina (KP) de la degradación de triptófano ha sido implicada en trastornos psiquiátricos. Específicamente, el metabolito derivado de astrositos ácido quinurénico (KYNA), un antagonista en ambos N-metil-d-aspartato (NMDA) y α7 los receptores nicotínicos de la acetilcolina (α7nACh), se ha implicado en procesos cognitivos en la salud y la enfermedad. Como los niveles KYNA son elevados en los cerebros de pacientes con esquizofrenia, un mal funcionamiento en los receptores colinérgicos y glutamatérgicos se cree que la causal se relaciona con disfunción cognitiva, un dominio de base de la psicopatología de la enfermedad. KYNA puede jugar un papel patofisiológico importante en individuos con esquizofrenia. Es posible elevar el KYNA endógena en el cerebro de roedor por tratar a los animales con la quinurenina bioprecursor directa y estudios preclínicos en ratas han demostrado que elevaciones agudas en KYNA pueden afectar sus procesos de aprendizaje y la memoria. El protocolo actual describe este acercamiento experimental en detalle y combina a) un análisis bioquímico del nivel de quinurenina y cerebro formación KYNA (utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento), b) comportamiento de prueba para probar la memoria contextual dependiente de hipocampo (paradigma de evitación pasiva) y c) una evaluación de comportamiento de sueño y vigilia [grabaciones telemétricas combinar señales de electromiografía (EMG) y Electroencefalografía (EEG)] en ratas. Tomados en conjunto, se estudia una relación entre el elevado KYNA, sueño y cognición, y este protocolo describe en detalle un enfoque experimental para comprender los resultados de la función de elevación de la quinurenina y KYNA formación en vivo en ratas. Resultados obtenidos a través de las variaciones de este protocolo pondrá a prueba la hipótesis que el KP y KYNA sirven papeles fundamentales en la modulación de sueño y cognición en Estados de salud y enfermedad.
Introduction
El KP es responsable de degradar casi el 95% del aminoácido esencial triptófano1. En el cerebro mamífero, quinurenina en los astrocitos se metaboliza en la molécula pequeña neuroactivos KYNA principalmente por la enzima aminotransferasa (KAT) quinurenina II2. KYNA actúa como un antagonista en los receptores NMDA y α7nACh en el cerebro2,3,4, y también objetivos de señalización como el receptor de hidrocarburo de arilo (AHR) y la proteína G de receptores juntados receptor 35 (GPR35)5 ,6. En animales de experimentación, elevaciones en cerebro KYNA han demostrado para deteriorar su rendimiento cognitivo en una matriz de análisis conductual2,7,8,9,10 . Una hipótesis emergente sugiere que KYNA desempeña un papel integral en la modulación de las funciones cognitivas afectando sueño-vigilia comportamiento11, apoyando así aún más el papel de moléculas derivadas de astrositos en la modulación de la neurobiología del sueño y 12de la cognición.
Clínicamente, se han encontrado elevaciones en KYNA en líquido cefalorraquídeo y tejido fino del cerebro post mortem de pacientes con esquizofrenia13,14,15,16, un debilitante trastorno psiquiátrico caracterizado por debilitaciones cognoscitivas. Pacientes con esquizofrenia a menudo se ven afectados por trastornos del sueño que pueden exacerbar la enfermedad17. Entender el papel del metabolismo de KP y KYNA en la modulación de una relación entre el sueño y cognición, particularmente entre el aprendizaje y la memoria, puede conducir al desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento de estos pobres resultados en la esquizofrenia y otros enfermedades psiquiátricas.
Un método confiable y consistente para la medición de metabolitos de KP es importante para garantizar que la investigación de distintas instituciones puede ser integrada en la comprensión científica de la biología de KP. En la actualidad, se describe la metodología para medir la quinurenina en plasma de rata y KYNA en el cerebro de la rata por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). El presente Protocolo, que hace uso de una detección fluorimétrica en presencia de Zn2 +, primero fue desarrollado por Shibata18 y más recientemente adaptado y optimizado para derivatize con acetato de zinc 500 mM como el reactivo de la columna, lo que permite la detección de endógeno, cantidad nanomolar de KYNA en el cerebro11.
Para estimular la producción endógena de KYNA de novo como se describe en el presente Protocolo, la quinurenina bioprecursor directa se inyecta por vía intraperitoneal (i.p.) en ratas. En combinación con evaluaciones bioquímicas para determinar el grado de producción de KYNA, los impactos de un quinurenina desafían la memoria dependiente del hipocampo (paradigma de evitación pasiva) y la arquitectura de sueño-vigilia (señales de EEG y EMG) es también investigar11. Una combinación de estas técnicas permite el estudio de los efectos bioquímicos y funcionales de un quinurenina reto en vivo en ratas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para una evaluación confiable de KYNA en el cerebro después de una administración periférica de la quinurenina, es fundamental combinar e interpretar experimentos bioquímicos y funcionales. Aquí, presentamos un protocolo detallado que permite a los usuarios nuevos para establecer métodos eficaces para la medición de la quinurenina de plasma y el cerebro KYNA de ratas. La medición de la quinurenina en plasma confirma la inyección precisa y la medición del metabolito KYNA confirma la síntesis de novo e…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El presente estudio fue financiado en parte por los institutos nacionales de salud (R01 NS102209) y una donación de la Clare E. Forbes Trust.
Materials
| Wistar rats | Charles River Laboratories | adult male, 250-350 g | |
| L-kynurenine sulfate | Sai Advantium | ||
| ReproSil-Pur C18 column (4 x 150 mm) | Dr. Maisch GmbH | ||
| EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
| Mounting materials screws | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
| Nonabsorbable Sutures | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12 |
| Absorbable Sutures | Ethicon | J310H | 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
| Dental Cement | Stoelting Co. | 51458 | |
| Drill Bit | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alliance HPLC system | |||
| E2695 separation module | Waters | 176269503 | |
| 2475 fluorescence detector | Waters | 186247500 | |
| post-column reagent manager | Waters | 725000556 | |
| Lenovo computer | Waters | 668000249 | |
| Empower software | Waters | 176706100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Passive avoidance box for rat | |||
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | MedAssociates | ENV-018MD | Interior: 22"W x 22"H x 16"D |
| Center channel modulator shuttle box chamber | MedAssociates | ENV-010MC | |
| Stainless steel grid floor for rat | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
| Auto guillotine door | MedAssociates | ENV-010B-S | |
| Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
| Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel | MedAssociates | ENV-221M | |
| Sonalert module with volume control for rat chamber | MedAssociates | ENV-223AM | |
| SmartCtrl 8 input/16 output package | MedAssociates | DIG-716P2 | |
| 8 Channel IR control for shuttle boxes | MedAssociates | ENV-253C | |
| Infrared source and dectector array strips | MedAssociates | ENV-256 | |
| Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
| Dual range constant current aversive stimulation module | MedAssociates | ENV-410B | |
| Solid state grid floor scrambler module | MedAssociates | ENV-412 | |
| Dual A/B shock control module | MedAssociates | ENV-415 | |
| 2' 3-Pin mini-molex extension | MedAssociates | SG-216A-2 | |
| 10' Shock output cable, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
| Shuttle shock control cable 15', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
| Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
| PCI interface package | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
| Shuttle box avoidance utility package | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sleep-Wake Monitoring Equipment | |||
| Ponehmah software | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
| MX2 8 Source Acquisition interface | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
| Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
| Dell 19" computer monitor | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
| Receivers for plastic cages, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
| Cisco RV130 VPN router | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
| Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
| Network switch | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
| Neuroscore software | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
| Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |
Referenzen
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