이 프로토콜의 목표는 vivo에서집계 하는 알파 synuclein의 형성을 복제 하는 셀 기반 시스템을 제공 하는입니다. 세포내 알파 synuclein 포함은 국제화에 의해 주 뉴런에 시드는 고 세의 전파 관리 네이티브 microsomes 관련 알파 synuclein 집계 병 알파 synuclein 유전자 변형 쥐에서 분리.
년, 셀 문화 흠도 불용 성 알파 synuclein (αS)의 형성을 복제의 무 능력 αS 집계에서 파 킨 슨 병 (PD)의 연구에 큰 제한 되었습니다. 최근, 질병 αS 유전자 변형 쥐 또는 PD 환자에서 뇌 추출의 외 인 접종을 통해 새로운 동물 모델의 개발 αS 집계의 더 적절 한 셀 모델의 가능성을 새로운 희망을 부여 하고있다. 불행히도, 셀 문화에 관해서, 원시 뇌 추출의 쥐에서 성공적으로 입증 되지 않은 그리고 exogenous 집계의 선택의 소스는 아직 생체 외에서 preformed αS 소.
매우 독성 αS 종 유전자 변형 생쥐의 병에 걸리는 지역에서 고립의 네이티브 microsomes 관련 된 αS, 외 인 관리를 통해 기본 신경 세포에서 세포내 αS 포함의 형성을 유도 하는 방법을 개발 했습니다. Microsomes 소포와 연결 되는 αS의이 분수 효율적으로 내 면화 하 고 세포내 포함 집계 및 phosphorylated αS에 대 한 긍정적인의 형성을 유도 한다. 생체 외에서에 비해-재조합 αS, 우리의 방법에서에서 만든 미리 형성한 소 빠릅니다 및 정통 αS 집계로 만든 병원 성 시드 보장 더를 흉내 낸 PD의 질병 동물 모델에서 추출의 종류 밀접 하 게 포함에 비보를 얻을. 그 결과, 조직 αS 포함 풍부한의 가용성은 필수입니다.
우리 믿고이 방법은 αS 집계 및 비보에 관련된 세포 이상의 미세한 측면을 연구 하는 다양 한 셀 기반 모델을 제공 합니다 더 정확 하 고 정교한 세포의 창조를 위한 출발점이 될 것입니다. PD의 패러다임입니다.
알파 synuclein (αS) 배치할 포함의 축적은 Parkinson의 질병 (PD)와 알파-synulceinopathies1의 유명 하 고 중요 한 기능입니다. 불행히도, 동물 모델 유도 집계 단계 단백질 소2의 형성에 필요한 충분 한 셀룰러 및 생 화 확 적인 환경을 제공할 수 있습니다, 하는 동안 복제 복잡 한 Lewy 몸 (파운드)의 형성-같은 집계 세포 배양에서 어렵고 도전 이다입니다.
여기는 αS 포함, 유사한 동물 모델 및 PD 환자, 경작된 한 세포에 고립 된 두뇌 마우스 기본 뉴런을 사용 하 여 얻은 단백질 집계의 형성을 유도 하는 방법에 설명 합니다. 우리의 프로토콜 αS 증상 유전자 변형 (Tg) 마우스에서 마우스 hippocampal 또는 대뇌 피 질의 기본 신경 격리 microsomes 관련 된 αS의 외 인 관리를 기반으로 합니다. 이 메서드는 αS 독성 종, 문화 매체에 추가 내 면 되 고 성숙 αS-긍정적인 집계3,4,의 형성을 유발 수 있습니다 확산 및 전파 능력의 활용 5,6,,78.
원래, 셀 문화에서 αS 소의 형성을 얻기 위해 표준 방법 일반 transfection 프로토콜 또는 중재 바이러스 감염9통해 해당 αS cDNA의 overexpression에 근거 했다. 두 번째 프로토콜 감염 에서에서 24-48 h에 고 분자량 (HMW) 종류를 포함 하 여 불용 성 소의 형성에 주도 동안 파운드 같은 αS를 얻는 첫 번째 경우 집계 뜻밖, 낮은 효율, 그리고 셀 형식에 의존 10. 이러한 방법의 형성 아마는 과도 한 때문 이었고 αS 단백질 금액 집계를 지시 하는 αS 나 란의 병 적인 변환 보다 불용 성 되는 불균형. 대신, 우리는 여기에서 제시 하는 기술은 αS 식 수준을 변경 하지 않습니다 하지만 세 소의 국제화로 인해 광범위 한 단백질 집계를 유도. 또한, 외 인 소의 관리를 통해 αS의 형성 하는 과정 일 또는 주 되 철저 한 공부 시간 경과 패션에 αS 포함 형성의 초기 및 중간 단계를 필요로 하 고 에 세포 생화학 변화 상관. 따라서, 우리의 방법은 현미경으로 세포 이상에 관하여 αS fibril 형성 연구에 도움이 되는 αS 집계의 휴대 전화 모델을 만드는 유용한 응용 프로그램입니다.
또한 원시 뇌의 병 αS (Tg) Transgenic 쥐11,에서 추출 하는 있지만12 또는 인간의 PD 두뇌6,13 은 Tg 또는 야생-타입 (WT) 동물, 응용 프로그램에서 αS 증 착을 유도 할 수 세포 배양에 동일한 절차의 가능성이 낮은 양의 집계에서 사용 하는 샘플 및 네이티브 αS 독성 종14분리 표준 절차의 부족 때문에 성공적으로 수 입증 되지 않았습니다. 이 때문에, 생체 외에서 미리 형성 된 소 (PFFs) αS의 지금까지 셀에 αS 포함의 유도 대 한 선택의 집계 소스 그리고 동물 모델3,4,6,7 ,,1516. 그러나 우리의 프로토콜,, 우리 αS microsomes 관련 집계 종 αS Tg 마우스에서 분리 세포내 파운드 같은 αS 포함 주 뉴런에서의 축적을 일으킬 수 있는 효율적으로 보여준다.
우리 실험실에서 αS microsomes 관련 집계 종 [Prp 인간 A53T αS Tg 마우스, g 2-317] 마우스 프리온 단백질 (PrP) 발기인의 통제 인간 A53T αS 유전자 표현 질병 안내 쥐의 척수 (SpC) 조직 으로부터 격리 됩니다. 이러한 마우스 표시 중앙 신경 시스템에 강력한 모터 역 기능 및 포함의 형성을 포함 하는 연령에 따라 신경 표현 형의 만든 phosphorylated, ubiquitinated, 및 나이의 9 달 후에 시작 하는 불용 성 αS. 모터 부전 나타나면, phenotype 마비, 후부 사지에서 시작 2-3 주에 죽음에 이르게 하는으로 급속 하 게 진화. ΑS의 축적 질환 징후를 평행 시킨다. 마우스 모터 장애의 발병에 희생 SpC, 뇌 줄기 및 소 뇌에 αS 집계의 강력한 학위를 보여줍니다. 마비 마우스를 희생 하는 설정 할 때까지 기다릴 필요가 없습니다입니다. Presymptomatic 마우스 모터 역 기능을 표시 하지 않는 9 개월 된 동물에서 가져옵니다.
우리를 αS Tg 동물 모델에서 격리 순화 microsomes 관련 된 αS의 추가 통해 WT 쥐에서 신경 주 문화 두뇌 파생 된 αS 포함의 형성을 받는 방법을 설명 합니다.
이 프로토콜의 중요 한 단계는 다음: αS microsomes 관련 된 집계/뉴런의 µ g과 αS의 소스 비율. 그것은 이후 조 세포 죽음 또는 너무 부족 한 세포내 집계 이어질 수 있는 최적이 조건에서 작업 αS microsomes 관련 된 집계/신경의 수의 µ g의 비율을 최적화 하는 중요 한 결과 세션 같이 (참조는 대표적인 결과 섹션)입니다. 이 때문에, 그것은 매우 치료를 시작 하기 전에 신경 문화 사업부 7 ( 그림 1참조)에서 밀도 평가 하는 것이 중요. 또한, αS 집계 병 αS 안내 쥐, 즉에서 정화 해야 합니다. 누적 된 동물 모델에서 파운드 같은 포함 특징 phosphorylated 세제 불용 성 αS HMW 소.
이 프로토콜에 대 한 가능한 수정에 대해 조직, 냉동 또는 신선한, 어떤 microsomes 격리 될 수 있습니다 및 시작에서. 우리 αS 불 용해성의 높은 내용 때문에 SpC의 안내 마우스를 사용, 지역 αS 집계에 있는 높은 콘텐츠를 프로토콜을 어떤 조직에서 microsomes 관련 집계를 분리 하 적당 하다. 동결의 microsomes 관련 된 집계를 집계 라기보다정화 단계를 영향을 주지 않으므로 냉동된 샘플도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 microsomes에서 얻기를 위해 적합 한 조직에 대 한 권장된 시작 무게는 약 100-150 mg, 원료 (최대 중량 제한 없음)의 50 밀리 그램으로 낮은. 그러나 100 mg 보다 낮은 금액의 경우, 적합 한 균질 비율 있을 것입니다 1:20 (w/v) 적어도 1 mL의 표면에 뜨는 S10 ultracentrifuge 강 수에 대 한 폴 리 탄산염 병에 로드 하는 순서. 사실, 1 mL 보다 작은 볼륨을 로드 튜브 및 샘플 손실의 붕괴 될 수 있습니다. 더 희석된 상쾌한 이어질 것입니다 균질 볼륨 증가 하지만 microsomal 펠 릿의 농도 영향을 받지 유지 됩니다.
이 프로토콜의 한계는 비효율적인 크로스-시드 αS 포함 최근 보고 된 인간 근원의 αS PFFs의 사례 관리에 마우스 αS PFFs24반대 murine 신경 문화 형성에 염려 한다. 다른 αS 변종 또는 다른에서 소의 관리의 경우 microsomes 관련 집계의 양을 정밀 하 게 조정 하는 것이 좋습니다 murine 문화에 주어진 세 αS 소의 양을 늘리면이 문제를 무시할 수 있습니다, 이후 우리가 설명 보다 마우스 신경 문화 종.
문화 미디어에 추가 하는 외 인 αS 집계는 서로 다른 소스에서 수 있습니다. ΑS PFFs 체 외에서 세포 배양, 기본 신경 세포 및 동물 모델3,7,,815에 세포내 αS의 시드 템플릿으로 이전 사용 되었습니다. 어디 αS microsomes 관련 집계는 몇 시간에서 고립 될 수 있다 우리의 방법에 비해 PFFs의 형성은 길고 힘 드는, purifications, αS confomations25 집계 확인 하기 추가 분석 실험에 의해 다음의 여러 단계를 요구 . 또한, PFFs 박테리아 표현 인간 또는 마우스 αS에서 취득 되 고, 즉 부족 posttranslational 수정, 진핵생물의 전형적인 수 다른 conformations와 현재 선택적 시드 병원 성 속성에 따라 nucleation 프로토콜 (예: 리본 vs 소)5,8 다른 결과 및 결론에 따 랐 다. 대신, αS 집계에 vivo에서 정화의 단일 관리 동물 모델 및 PD 환자에서 αS 포함의 형성 과정을 밀접 하 게 흉내 낸 더 본격적인 병원 서식 파일의 전송을 보장 합니다.
이 기술의 미래 응용 프로그램,으로 우리 믿는 것이 프로토콜 사용할 수 있습니다 성공적으로 PD 환자의 뇌 또는 다른 αS Tg 동물 모델에서 αS 병원 성 종자를 격리 하 병에 걸리는 지역에서 microsomes 격리 된 풍부한 αS에 제공 흠입니다.
우리의 지식, vivo에서 PD 모델 시드 αS 포함 주 뉴런에서의 형성을 얻기 위해 서식 파일으로 사용할 수에서 αS의 기본 독성의 정화를 허용 하는 첫 번째 방법입니다.
우리는이 방법은 매우 다목적 이며 αS 집계 및 셀 이상에 미치는 영향의 다양 한 측면을 연구 하는 뛰어난 셀 기반 모델을 제공할 수 있습니다 믿습니다. ΑS 포함 형성 대표 배양된 세포에서 복제 하기 어려운 복잡 한 과정, 때문에 우리는이 모델 급성 병원 성 기계 장치, 만성 및 더 정교한 식별 하드에 큰 통찰력을 제공할 것입니다 희망 시스템은과 같은 동물 모델은.
The authors have nothing to disclose.
이 작품 경력 재통합 부여 제도 (젊은 연구원을 위한 RLM 프로그램)를 통해 대학과 연구 (MIUR)의 이탈리아 정부에 의해 지원 되었습니다 학교 어쩔 레에서. 미네소타의 대학, 미국에서 교수 마이클 리는 Prp 인간 A53T αS Tg 마우스는 집계는 격리를 제공 하는 감사 합니다.
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG | |
Hepes | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | 1M pH=7-7.6 |
EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
NaCO3 | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
NAHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 18 wells | Biorad | 5678094 | |
Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | 0.2 μm |
Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Termo Fisher Scientific | 34077 | |
Nitric acid | Sigma-Aldrich | 1004411000 | 65% |
Glass Coverslips | Termo Fisher Scientific | 1014355118NR1 | 18 mm x |
Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
Hank's Balanced Salt Solution | Termo Fisher Scientific | 14170-500 mL | |
Penicillin/Streptomycin | Termo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Termo Fisher Scientific | D5796-500 mL | |
Trypsin-EDTA | Termo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
B27 Supplement | Termo Fisher Scientific | 17504044 | 50X |
Glutamax | Termo Fisher Scientific | 35050-038 | 100x |
DNAse | Sigma-Aldrich | D5025 | |
Fetal bovine serum | Euroclone | EC50182L | |
Glutamate | Sigma-Aldrich | 1446600-1G | |
Gentamicin | Termo Fisher Scientific | 15710 | 10 mg/ml |
Neurobasal Medium | Termo Fisher Scientific | 10888-022 | |
Cytosine arabinoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
DAPI | Termo Fisher Scientific | 62247 | |
90 Ti rotor | Beckman | N/A | Ultracentrifuge rotor |
Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | N/A | |
Syn-1 antibody, clone 42 | BD Biosciences | 610786 | anti-mouse WB: 1:5000 |
Syn303 antibody | BioLegend | 824301 | anti-mouse IF: 1:1000 |
Tau antibody | Synaptic Systems | 314 002 | anti-rabbit IF: 1:10,000 |
pser129-αS antibody | A gift from Fujiwara et al, reference 19 | anti-rabbit WB: 1:5000 | |
pser129-αS antibody | Abcam | ab51253 | anti-rabbit IF: 1:1000 |
Mouse αS (D37A6) XP | Cell Signaling | 4179 | anti-rabbit IF 1:200 |
Alexa fluor 555-conjugated anti-rabbit antibody | Termo Fisher Scientific | A27039 | |
Alexa fluor 488-conjugated anti-mouse antibody | Termo Fisher Scientific | A-11029 | |
Microson XL-2000 | Misonix | Sonicator | |
Ultra Bottles (Oakridge Bottles), PCB, 16x76mm, Assembly, Noryl Cap, Beckman-type | Science Service EU | S4484 | Ultracentrifuge tubes |
AXIO Observer Inverted Light Microscope | Zeiss | N/A | |
TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
Inverted epi-fluorescence microscope | Nikon | N/A | |
Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Nonionic surfactant |