إدارة خارجية من المجاميع المرتبطة ميكروسوميس ألفا-سينوكلين إلى الخلايا العصبية الأولية كنموذج خلية قوية لتشكيل ييفات
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو توفير نظام يستند إلى الخلية أن يعيد تشكيل ألفا سينوكلين المجاميع في فيفو. هي تبذر تضمينات سينوكلين ألفا داخل الخلايا في الخلايا العصبية الأولية بالاستيعاب ونشر خارجية تدار المجاميع الأصلية المرتبطة ميكروسوميس ألفا-سينوكلين المعزولة من المريضة ألفا-سينوكلين الفئران المعدلة وراثيا.
Abstract
لسنوات، قد عجز عن تكرار تشكيل إدراجات غير قابلة للذوبان ألفا-سينوكلين (αS) في الثقافات الخلية قيد كبير في الدراسة من αS التجميع في مرض باركنسون (PD). في الآونة الأخيرة، أعطت تطوير نماذج حيوانية جديدة عن طريق تطعيم خارجية الدماغ مقتطفات من الفئران المحورة وراثيا αS مريضة أو المرضى PD آمال جديدة لإمكانية إنشاء نماذج الخلية أكثر ملائمة لتجميع αS. لسوء الحظ، عندما يتعلق الأمر بالخلايا في الثقافات، لم تثبت إدارة مستخلصات الدماغ الخام ناجحاً كما هو الحال في الفئران ومصدر اختيار المجاميع الخارجية لا تزال في المختبر بريفورميد ييفات αS.
قمنا بتطوير أسلوب للحث على تشكيل تضمينات αS داخل الخلايا في الخلايا العصبية الأولية من خلال إدارة خارجية المجاميع الأصلية αS المرتبطة ميكروسوميس، أنواع شديدة سمية αS معزولة عن المناطق المريضة من الفئران المعدلة وراثيا. هذا جزء من αS المجاميع المرتبطة مع الحويصلات ميكروسوميس، متغللة بكفاءة والحث على تشكيل تضمينات داخل الخلايا إيجابية ل αS مجمعة وفوسفوريلاتيد. مقارنة في المختبر-ييفات بريفورميد التي تصنع من αS المؤتلف، لدينا طريقة أسرع وضمانات أن بذر المسببة للأمراض مع المجاميع αS أصيلة المستخرجة من نماذج الحيوانات المريضة من PD، محاكاة أكثر عن كثب النوع حصل تضمينات في فيفو. نتيجة لذلك توافر أنسجة غنية بتضمينات αS إلزامي.
ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب سوف تقدم نموذجا يستند إلى الخلية تنوعاً لدراسة الجوانب المجهرية αS التجميع والفيزيولوجيا المرضية الخلوية ذات الصلة في فيفو وستكون نقطة انطلاق لإنشاء خلية دقيقة ومتطورة أكثر نموذج للمشتريات.
Introduction
تراكم من تضمينات البروتينية ألفا-سينوكلين (αS) ميزة بارزة وهامة من باركنسون مرض (PD) وألفا-سينولسينوباثيس1. ولسوء الحظ، في حين قادرة على توفير بيئة الخلوية والكيمياء الحيوية كافية للحث على اتخاذ الخطوات اللازمة لتشكيل البروتين ييفات2تجميع نماذج حيوانية، تكرار تشكيل من جسم ليوى المعقدة (رطل)-مثل المجاميع في الثقافات الخلية صعوبة وتحديا.
هنا يصف لنا وسيلة للحث على تشكيل تضمينات αS، مماثلة للمجاميع البروتين التي تم الحصول عليها في نماذج حيوانية والمرضى PD، في الخلايا المستزرعة، استخدام الدماغ معزولة الماوس الخلايا العصبية الأولية. ويستند لدينا بروتوكول إدارة خارجية للمجاميع المرتبطة microsomes αS معزولة من αS أعراض الفئران (تيراغرام) المعدلة وراثيا للماوس هيبوكامبال أو القشرية الخلايا العصبية الأولية. يأخذ هذا الأسلوب ميزة على إشاعة ونشر قدرة αS الأنواع السامة التي، بمجرد إضافة إلى متوسط الثقافة، يمكنها أن تصبح استيعابه، والحث على تشكيل المجاميع αS-الإيجابية الناضجة3،4، 5،6،،من78.
في الأصل، استندت الأساليب القياسية للحصول على تشكيل ييفات αS في الثقافات الخلية overexpression كدنا αS المقابلة من خلال بروتوكولات تعداء العادية أو العدوى الفيروسية بوساطة9. بينما في الحالة الأولى الحصول على αS رطل مثل المجاميع كانت عارضة، أظهرت انخفاض الكفاءة، ويتوقف على نوع الخلية، البروتوكول الثاني أدى إلى تشكيل ييفات غير قابلة للذوبان، بما في ذلك الأنواع عالية الوزن الجزيئي (حمو) في ح 24-48 من الإصابة 10. في هذه الأساليب، تشكيل المجاميع ربما كان نتيجة الإفراط وغير المتوازنة في كمية البروتين αS التي تصبح غير قابلة للذوبان بدلاً من تحويل مرضية لتكيف αS يملي التجميع. بدلاً من ذلك، الأسلوب الذي نقدمه هنا لا يغير من مستوى التعبير αS لكن الحث على تجميع البروتين على نطاق واسع بسبب استيعاب ييفات الخارجية. وعلاوة على ذلك، تشكيل المجاميع αS من خلال إدارة ييفات الخارجية هو عملية طويلة تتطلب أيام أو أسابيع لتصبح شاملة مما يسمح لنا بدراسة المراحل المبكرة والمتوسطة من αS تضمينات تشكيل بطريقة الوقت الفاصل بين و لربط ذلك مع التغييرات البيوكيميائية الخلوية. وهكذا، لدينا أسلوب هو تطبيق قيمة لإنشاء نماذج التجميع αS الخلوية التي قد تكون مفيدة لدراسة تشكيل فيبريل αS مجهريا بالنسبة للهاتف الخلوي الفيزيولوجيا المرضية.
وبالإضافة إلى ذلك على الرغم من أن إدارة الدماغ الخام يستخرج من الفئران المريضة αS ترانسجينيك (تيراغرام)11،12 أو6،العقول PD البشرية13 قادرة على حمل αS ترسب في تيراغرام أو الحيوانات البرية من نوع (وزن)، والتطبيق لنفس الإجراء للثقافات الخلية لم يثبت أن تكون ناجحة، ربما بسبب انخفاض كمية من المجاميع في العينات المستخدمة وعدم وجود إجراءات موحدة لعزل الأنواع السامة αS الأصلي14. وبسبب هذا، كانت مصدرا المجاميع المفضلة حتى الآن لاستحثاث تضمينات αS في الخلايا في المختبر بريفورميد ييفات (بفس) من αS والنماذج الحيوانية3،،من46،7 ،،من1516. مع أن البروتوكول، إلا أن نظهر أن الأنواع المجمعة المرتبطة microsomes αS المعزولة من αS تيراغرام الفئران يمكن أن يستحث كفاءة تراكم تضمينات αS مثل رطل داخل الخلايا في الخلايا العصبية الأولية.
في المختبر لدينا، الأنواع المجمعة المرتبطة microsomes αS معزولة من أنسجة النخاع الشوكي (SpC) من الفئران تيراغرام المريضة معربا عن A53T αS الجينات البشرية تحت سيطرة الماوس بريون البروتين (PrP) المروج [الحزب الثوري A53T البشرية αS تيراغرام الفئران، خط G2-317]. تظهر هذه الفئران النمط الظاهري الأعصاب تعتمد على سن يتضمن الخلل موتور قوي وتشكيل المشمولات في الجهاز العصبي المركزي مصنوعة من فوسفوريلاتيد، أوبيكويتيناتيد، وغير قابلة للذوبان αS، تبدأ بعد 9 أشهر عمر. حالما يظهر الخلل في السيارات، يتطور النمط الظاهري سرعة إلى الشلل، بدءاً من أطرافه الخلفية، والتي تؤدي إلى الوفاة في 2-3 أسابيع. تراكم من المجاميع αS يوازي مظاهر المرض. إظهار الفئران ضحى بداية الخلل الحركي بدرجة قوية من αS التجميع في توافق آراء ساو باولو وجذع الدماغ والمخيخ. ليست هناك حاجة الانتظار لحين تعيين الشلل إلى التضحية بالماوس. وتؤخذ الفئران بريسيمبتوماتيك في 9 أشهر من العمر الحيوانات التي لا تعرض الخلل في السيارات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفت لنا طريقة الحصول على تشكيل تضمينات αS في الثقافات الخلايا العصبية الأولية المستمدة من الدماغ من وزن الفئران، عن طريق إضافة مجاميع المنقي αS المرتبطة ميكروسوميس المعزولة من αS تيراغرام نماذج حيوانية.
الخطوات الأساسية لهذا البروتوكول هي التالية: نسبة ميكروغرام من المجاميع المرتبطة microsomes αS/الخلايا العصبية ومصدر αS المجاميع. كما هو موضح في الدورة النتائج، من المهم تحسين نسبة ميكروغرام من المجاميع المرتبطة microsomes αS/عدد الخلايا العصبية حيث يعملون في ظروف دون المستوى الأمثل يمكن أن يؤدي إلى موت الخلية قبل الأوان أو التجميع داخل الخلايا النادرة جداً (انظر مقطع تمثيلي النتائج). وبسبب هذا، من المهم جداً تقييم كثافة ثقافة العصبية في 7 DIV (كما هو موضح في الشكل 1) قبل بدء العلاج. بالإضافة إلى ذلك، قد αS المجاميع يتم تنقيته من αS المريضة تيراغرام الفئران، أي. من النماذج الحيوانية التي تتراكم تميزت تضمينات الشبيهة برطل αS غير قابلة للذوبان فوسفوريلاتيد والمنظفات ييفات همو.
إمكانية إدخال تعديلات على هذا البروتوكول تعتبر الأنسجة، المجمدة أو الطازجة، من ميكروسوميس التي يمكن أن تكون معزولة ومبلغ بداية. بينما كنا “توافق آراء ساو باولو تيراغرام” الفئران بسبب ارتفاع محتوى αS المجاميع غير قابلة للذوبان، البروتوكول مناسبة لعزل المجاميع المرتبطة ميكروسوميس من أي أنسجة، شريطة أن المنطقة محتوى المرتفع في المجاميع αS. يمكن أيضا استخدام العينات المجمدة منذ التجميد لا يؤثر على خطوات تنقية المجاميع المرتبطة ميكروسوميس أو المجاميع في حد ذاتها. بينما الوزن الموصى بها للأنسجة حوالي 100-150 ملغ، هذا البروتوكول مناسبة للحصول على ميكروسوميس من منخفضة تصل إلى 50 ملغم مواد الخام (لا يوجد حد أقصى وزن). في حالة كمية أقل من 100 مغ، ومع ذلك، سيكون نسبة التجانس المناسب 01:20 (w/v) كي يكون على الأقل 1 مل S10 طافية تحميل على زجاجة البولي لهطول الأمطار أولتراسينتريفوجي. وفي الواقع، قد يؤدي تحميل وحدات التخزين أصغر من 1 مل انهيار فقدان الأنبوب وعينه. زيادة حجم التجانس يؤدي إلى المادة طافية مخففة أكثر ولكن تركيز بيليه microsomal سوف تظل غير متأثرة.
حد من هذا البروتوكول تتعلق عدم كفاءة عبر البذر في تشكيل تضمينات αS التي أبلغ عنها مؤخرا في قضية إدارة بفس αS البشرية المنشأ للثقافات العصبية مورين بدلاً من الماوس αS بفس24. نظراً لزيادة كمية ييفات αS خارجية نظراً إلى الثقافات مورين يمكن تجاوز هذه المشكلة، نوصي بأن يوفق ناعما مقدار المجاميع المرتبطة ميكروسوميس في حالة إقامة ييفات التي تم الحصول عليها من متغيرات αS أخرى أو من مختلف أنواع الثقافات الماوس الخلايا العصبية من ما وصفت لنا.
يمكن أن تكون المجاميع αS الخارجية إضافة إلى ثقافة وسائل الإعلام من مصادر مختلفة. في المختبر بفس αS قد استخدمت سابقا كقالب نثر البذور من المجاميع αS داخل الخلايا في الثقافات الخلية والخلايا العصبية الأولية، ونماذج حيوانية3،،من78،15. بالمقارنة مع أسلوب لدينا حيث يمكن أن تكون معزولة المجاميع المرتبطة microsomes αS في الساعات القليلة، تشكيل بفس طويلة وشاقة، تتطلب خطوات متعددة لتنقية، متبوعاً بفحوصات إضافية للتأكد من المجاميع αS كونفوميشنز25 . وبالإضافة إلى ذلك، يجري الحصول عليها من الإنسان أعربت عن البكتيريا أو الماوس αS بفس، أي تفتقر إلى التعديلات بوستترانسلاشونال نموذجية من حقيقيات النوى، يمكن أن يقدم والتشكلات المختلفة، مع البذور الانتقائي والخصائص المسببة للأمراض، واستنادا إلى يتبع البروتوكولات نويات (أي شرائط مقابل ييفات)5،8 مما يؤدي إلى نتائج مختلفة والاستنتاجات. بدلاً من ذلك، تضمن إدارة واحدة في فيفو تنقية المجاميع αS نقل قوالب الممرضة أكثر واقعية، محاكاة عن كثب عملية تشكيل αS المشمولات في نماذج حيوانية والمرضى PD.
كتطبيق المستقبلية لهذا الأسلوب، ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول يمكن استخدامها بنجاح لعزل البذور αS المسببة للأمراض من الدماغ للمرضى PD أو غيرها αS تيراغرام نماذج حيوانية، شريطة أن تكون غنية في αS المنطقة المصابة التي ميكروسوميس معزولة تضمينات.
على حد علمنا، هذا هو الأسلوب الأول الذي يسمح التنقية الأنواع السامة من αS من نماذج في فيفو PD لاستخدامه كقالب للحصول على تكوين αS المشمولات في الخلايا العصبية الأولية البذر.
ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب هو مرنة للغاية ويمكن أن توفر نموذجا يستند إلى الخلية استثنائية لدراسة الجوانب المختلفة لتجميع αS ونفوذها في الفسيولوجيا المرضية الخلية. نظراً لتشكيل تضمينات αS تمثل عملية معقدة وأن كان من الصعب إجراء نسخ متماثل في الخلايا المستزرعة، ونحن نأمل أن يوفر هذا الطراز الأفكار العظيمة في الآليات المسببة للأمراض الحادة، من الصعب تحديد المزمنة وأكثر تفصيلاً نظم مثل نماذج حيوانية.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
دعمت هذا العمل بالوزارة الإيطالية للجامعة والبحوث (وزارة) من خلال نظام المنح “الإدماج الوظيفي” (RLM البرنامج للباحثين الشباب) ومن مدرسة المعلمين العليا. ونحن نشكر البروفيسور مايكل لي من جامعة مينيسوتا، الولايات المتحدة الأمريكية، لتوفير αS A53T البشرية Prp الفئران تيراغرام، من حيث المجاميع معزولة.
Materials
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | 1M pH=7-7.6 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCO3 | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| NAHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 18 wells | Biorad | 5678094 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | 0.2 μm |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Termo Fisher Scientific | 34077 | |
| Nitric acid | Sigma-Aldrich | 1004411000 | 65% |
| Glass Coverslips | Termo Fisher Scientific | 1014355118NR1 | 18 mm x |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Termo Fisher Scientific | 14170-500 mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Termo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Termo Fisher Scientific | D5796-500 mL | |
| Trypsin-EDTA | Termo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| B27 Supplement | Termo Fisher Scientific | 17504044 | 50X |
| Glutamax | Termo Fisher Scientific | 35050-038 | 100x |
| DNAse | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Fetal bovine serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 1446600-1G | |
| Gentamicin | Termo Fisher Scientific | 15710 | 10 mg/ml |
| Neurobasal Medium | Termo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Cytosine arabinoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Termo Fisher Scientific | 62247 | |
| 90 Ti rotor | Beckman | N/A | Ultracentrifuge rotor |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | N/A | |
| Syn-1 antibody, clone 42 | BD Biosciences | 610786 | anti-mouse WB: 1:5000 |
| Syn303 antibody | BioLegend | 824301 | anti-mouse IF: 1:1000 |
| Tau antibody | Synaptic Systems | 314 002 | anti-rabbit IF: 1:10,000 |
| pser129-αS antibody | A gift from Fujiwara et al, reference 19 | anti-rabbit WB: 1:5000 | |
| pser129-αS antibody | Abcam | ab51253 | anti-rabbit IF: 1:1000 |
| Mouse αS (D37A6) XP | Cell Signaling | 4179 | anti-rabbit IF 1:200 |
| Alexa fluor 555-conjugated anti-rabbit antibody | Termo Fisher Scientific | A27039 | |
| Alexa fluor 488-conjugated anti-mouse antibody | Termo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Microson XL-2000 | Misonix | Sonicator | |
| Ultra Bottles (Oakridge Bottles), PCB, 16x76mm, Assembly, Noryl Cap, Beckman-type | Science Service EU | S4484 | Ultracentrifuge tubes |
| AXIO Observer Inverted Light Microscope | Zeiss | N/A | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Inverted epi-fluorescence microscope | Nikon | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Nonionic surfactant |
Referenzen
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat. Rev. Neurol. 9, 13-24 (2012).
- Visanji, N. P., et al. α-Synuclein-Based Animal Models of Parkinson’s Disease: Challenges and Opportunities in a New Era. Trends Neurosci. 39, 750-762 (2016).
- Luk, K. C., et al. Pathological α-Synuclein Transmission Initiates Parkinson-like Neurodegeneration in Nontransgenic Mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Rey, N. L., Petit, G. H., Bousset, L., Melki, R., Brundin, P. Transfer of human α-synuclein from the olfactory bulb to interconnected brain regions in mice. Acta Neuropathol. (Berl). 126, 555-573 (2013).
- Guo, J. L., et al. Distinct α-Synuclein Strains Differentially Promote Tau Inclusions in Neurons. Cell. 154, 103-117 (2013).
- Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological α-synuclein in brain. Brain. 136, 1128-1138 (2013).
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous α-Synuclein Fibrils Induce Lewy Body Pathology Leading to Synaptic Dysfunction and Neuron Death. Neuron. 72, 57-71 (2011).
- Peelaerts, W., et al. α-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522, 340-344 (2015).
- Lázaro, D. F., Pavlou, M. A. S., Outeiro, T. F. Cellular models as tools for the study of the role of alpha-synuclein in Parkinson’s disease. Exp. Neurol. 298, 162-171 (2017).
- Lee, H. -. J., Patel, S., Lee, S. -. J. Intravesicular localization and exocytosis of alpha-synuclein and its aggregates. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 25, 6016-6024 (2005).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological α-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative α-synucleinopathy in mice. J. Exp. Med. 209, 975-986 (2012).
- Mougenot, A. -. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol. Aging. 33, 2225-2228 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger α-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys: LB-Induced Pathology. Ann. Neurol. 75, 351-362 (2014).
- Woerman, A. L., et al. Propagation of prions causing synucleinopathies in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 4949-4958 (2015).
- Luk, K. C., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 20051-20056 (2009).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of α-synuclein induces CNS α-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 10732-10737 (2014).
- Lee, M. K., et al. +Thr+mutation+causes+neurodegenerative+disease+with+alpha-synuclein+aggregation+in+transgenic+mice.”>Human alpha-synuclein-harboring familial Parkinson’s disease-linked Ala-53 –> Thr mutation causes neurodegenerative disease with alpha-synuclein aggregation in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 8968-8973 (2002).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3306-3320 (2012).
- Fujiwara, H., et al. alpha-Synuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions. Nat. Cell Biol. 4, 160-164 (2002).
- Colla, E., et al. Toxic properties of microsome-associated alpha-synuclein species in mouse primary neurons. Neurobiol. Dis. 111, 36-47 (2018).
- Colla, E., et al. Accumulation of Toxic -Synuclein Oligomer within Endoplasmic Reticulum Occurs in -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3301-3305 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. -. Y. Addition of exogenous α-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous α-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nat. Protoc. 9, 2135-2146 (2014).
- Li, W., et al. Aggregation promoting C-terminal truncation of alpha-synuclein is a normal cellular process and is enhanced by the familial Parkinson’s disease-linked mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2162-2167 (2005).
- Luk, K. C., et al. Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity. Cell Rep. 16, 3373-3387 (2016).
- Volpicelli-Daley, L. A., Kirik, D., Stoyka, L. E., Standaert, D. G., Harms, A. S. How can rAAV-α-synuclein and the fibril α-synuclein models advance our understanding of Parkinson’s disease. J. Neurochem. 139, 131-155 (2016).
