Microsomes ilişkili Alpha-synuclein toplamları için birincil nöronlar eksojen yönetim olarak güçlü hücre modeli liflerinde oluşumu

WT ve Tg hayvanlar kullanımı onaylanmış ve tam tarafından ulusal ve uluslararası yasa laboratuvar hayvan refahı ve deneme (EEC Konsey 86/609, 12 Aralık 1987 yönergesi ve yönergesi 2010/63/AB, 22 Eylül 2010) için uyulması. Bu raporda açıklanan tüm iletişim kuralları kuruluşumuzun hayvan bakımı yönergeleri izleyin. 1. αS Microsomes ilgili toplamları üzerinden hastalıklı A53T αS Tg fareler yalıtım 250 mM sükroz, 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 2 mM EDTA ve 1 x fosfataz/proteaz-inhibitörleri oluşan homojenizasyon arabellek hazırlayın. Arabellek buz üzerinde tutun. Taze homojenize veya doku 1:10 içinde donmuş buz gibi homojenizasyon arabelleği bir Teflon kullanarak hacmi (w/v) havaneli homogenizer, 10-15 vuruş ile. İlk homogenate (1-2 mL) bir microcentrifuge tüp ve çekirdek ve kesilen hücreleri elde edilen Pelet (P1) kaldırmak için Soğutmalı Santrifüj kullanarak 4 ° C’de 10 dakika 1000 × g, santrifüj aktarın. P1 atmak. Süpernatant (S1) bir temiz microcentrifuge tüp aktarmak ve Soğutmalı Santrifüj ikinci süpernatant (S10) ve Pelet (P10) elde etmek için kullanarak 4 ° C’de 20 dk için 10.000 × g de S1 santrifüj kapasitesi.Not: Mitokondri ve synaptosomes içeren bir ham membran Pelet P10 var. P10 atmak. Polikarbonat şişe süpernatant (S10) aktarım (> 1 mL) ve bir ultracentrifuge ve bir sabit açılı rotor kullanarak 4 ° C’de 1 h için 100.000 × g de S10 santrifüj kapasitesi (90 Ti).Not: Pelet, P100, microsomes ilişkili αS toplamları içeren süpernatant saf sitozol kesir iken. P100 Pelet 500 µL homojenizasyon arabelleği ile resuspend. P100 bir temiz microcentrifuge tüp ve Soğutmalı Santrifüj 4 ° C’de 20 dk için 10.000 × g, santrifüj aktarın. Süpernatant atın ve P100 homojenizasyon arabellek 100 µL ile resuspend.Not: Bu kesir microsomes ilişkili αS toplamları alınır. Örnekleri 2 için solüsyon içeren temizleyicide buz [set çıkış güç 1 watt (RMS)] s. Örnekleri-80 ° C’de depolayın Bir gün sonra BCA analizi ile protein miktarını belirlemek. 2. Western Blot Not: αs microsomes ilgili toplamları biyokimyasal karakterizasyonu Western Blot tarafından değerlendirilir. Bir degrade 4- Tris-glisin polyacrylamide jel dikey Elektroforez cihazları üzerinde döküm. Denaturing örnek arabellekte çözünmüş microsomes ilişkili αS kesirler 1 µg yükleyin. Farklı bir kuyuda protein standart işaretleyicinin 5 µL yükleyin. Jel 100 V bir Tris/glisin/SDS protein marker jel sonuna ulaşana kadar tampon çalıştıran içinde çalıştırın. Bir temel karbonat tampon kullanarak bir nitroselüloz membran proteinleri transfer (10 mM NaCO3, 3 mM NaHCO3, % 20 metanol) O/N 200 4 ° C’de Anne, sürekli. Membran ile PBS-noniyonik yüzey aktif %0,05 (PBS-T) %5 yağsız Kuru süt için 30 dk RT. az bir orbital çalkalayıcı ile engellemek Kısaca, durulama zar ile PBS-T. Syn-1 (1:5, 000) veya pSer129-αS antikor (1:5, 000) PBS-t, O/N bir orbital çalkalayıcı üzerinde 4 ° C’de % 2.5 yağsız Kuru süt membran kuluçkaya. RT PBS-T bir orbital çalkalayıcı ile membran 10 dakika yıkayın. Membran ile Anti-fare ya da anti-tavşan HRP Birleşik ikincil antikor (1:3, 000) % 2.5 yağsız Kuru süt PBS-t RT. 1 h için kuluçkaya RT PBS-T bir orbital çalkalayıcı ile membran 10 dakika yıkayın. 3 x tekrarlayın. Düzenli Kemiluminesan kitleri aracılığıyla sinyal elde edilir. 3. birincil nöronal kültürler Not: Birincil nöronal kültürler WT yeni doğan (P0) farenin hipokampus veya korteks (hat C57BL/6) hazırlanmıştır. Santrifüjü adımları eksi bütün prosedür bir hücre kültür mahallede Steril koşullar altında gerçekleşir. RT coverslips (18 mm Ø) % 65 nitrik asit çözüm için en az 12 h ile tedavi Nitrik asit kaldırın. Coverslips iki kez PBS 10 x ile ve birkaç kez distile su ile durulayın. Coverslips 24-iyi yemekleri eklemek ve onları poli-D-lisin ile kat (0.1 mg/mL steril distile su veya PBS 1 x) 37 ° C’de 1 h için Poli-D-lizin kaldırmak ve coverslips üç kez distile su ile yıkayın. İhtiyaç kadar 4 ° C de stok onları. İşten çıkarma tarafından fare pups ötenazi ve kafaları vücutlarından ayrı. Kafaları yemekleri yerleştirin ve nazikçe cildi incelemek. İyi makas kullanarak, kafatası beyin üslerini bir kesi yaparak dosyayı açtı. “Kurukafalar” iki yarısını ayrı ve onları dikkatli bir şekilde çıkarın. Forseps kullanarak, bazlar gelen beyin kapalı çimdik ve korteks ve hipokampus izole etmek. Onları Hank’in dengeli tuz çözüm (HBSS) orta % 1 penisilin/streptomisin içeren içeren iki ayrı yemeklerin aktarın. Adım 3,6 ve 3,7 her hayvan için yineleyin. Tüm süreç daha–dan 30-45 dk almamalıdır unutmayın. Toplanan doku kıyma ve tripsin %0,1 içeren HBSS orta 10 mL ile iki 50 mL konik tüp (hipokampus) diğeri korteks için içine aktarabilirsiniz. 7 dk. 37 ° C’de için su banyosunda kuluçkayaNot: Hiçbir ajitasyon gereklidir. 1 mL % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve 10 µg/mL DNaz homogenate içeren DMEM tripsin faaliyetleri engellemek için ekleyin. Elde edilen Disosiye doku üzerinde bir santrifüj RT, 5 min için 200 × g, santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.Not: Pelet dokudan disseke hücreleri temsil eder. Kaplama orta, % 10 %2 B27, 2 mM glutamin, 6 mg/mL glikoz, içeren hücrelerde resuspend FBS, 12,5 µM glutamat ve 10 µg/mL gentamisin. Plaka ayrışmış nöronlar poli-D-lizin coverslips oranı göre 24 iyi tabak içinde Tarih: 1 korteks/12 kuyu ve 1 hipokampus/6 wells, iyi başına yaklaşık 150.000/200.000 hücre sonuçlanan. 37 ° C’de kuluçka hücreleri korumak Bir gün sonra (gün vitro, DIV 1), %2 B27, 10 µg/mL gentamisin ve 2 mM glutamin içeren orta ile kaplama orta değiştirin. Sayı 2, 1/3 orta çıkarın ve 1/3 2.5 µM sitozin arabinoside gliyal kirliliği azaltmak 48 saat için içeren taze orta ekleyin. Nöronlar 37 ° C’de korumak ve orta yarısı yerine üç günde. 4. nöronlar tedavi Not: Tedavi DIV 7’de sahne aldı. Tüm belgili tanımlık merdiven steril koşullarda hücre kültür başlık altında devam. Bir örnek kortikal nöronal kültür yoğunluğu DIV 7 Şekil 1′ de gösterilmiştir. αs microsomes ilgili toplamları seyreltme için orijinal homojenizasyon tampon kullanarak bir 1 µg/µL çözüm için üç farklı hastalıklı Tg farelerin omurilik elde edilen havuz. 1/3 orta çıkarın ve hafifçe %2 B27, 1 x 2 mM, gentamisin ve glutamin içeren taze orta ile değiştirin. Havuza alınan αS microsomes ilgili toplamları 1 µg cep orta olarak ekleyin. 37 ° C’de kuluçka dönüş nöronlar 3 günde 1 hafta, 1/3 taze orta ekleyin. Orta yerine koymayın. Sadece ekleyin. 1 hafta sonra tedavi, 1/3 orta çıkarın ve hafifçe %2 B27, 10 µg/mL gentamisin ve 2 mM glutamin içeren taze orta ile değiştirin. 3 günde bir tekrarlayın. Nöronlar tedavi (DIV 21) 2 hafta sonra düzeltmek. 5. ayirt PBS % 2 paraformaldehyde ile sinir hücreleri tamir 1 x ve %5 sükroz çözüm sallayarak, olmadan 15 dakika RT adlı bir kimyasal altında duman hood. Sabitleme çözüm kaldırın. Kısaca, PBS ile 1 x, 3 kez yıkayın.Not: birincil nöronlar sıkıca poli-lizin coverslips için sopa olamaz çünkü yavaşça tüm çamaşır adımları gerçekleştirin. Nöronlar PBS 1, Nonyonik yüzey aktif % 0.3’ile permeabilize x 5 dk RT. az için Kısaca, PBS ile 1 x, 3 kez yıkayın. Nöronların % 3 ile kuluçkaya FBS PBS 1 x 30 dk RT belirsiz bağlama sitelerinde bir orbital çalkalayıcı engellemek için az için. Yılında % 3 çözünmüş uygun birincil antikor ile nöronlar kuluçkaya FBS PBS 1 x, O/N bir orbital çalkalayıcı üzerinde 4 ° C’de.Not: syn303 (1:1, 000), fare αS (1: 200), pser129-αS (1:1, 000) ve Tau (1:10, 000) antikorları kullanılmıştır. Antikor çözüm ve yıkama, kısaca, PBS 1 x, 3 kez ile kaldırın. Nöronlar uygun floresan ikincil antikor %3 içinde çözünmüş ile kuluçkaya FBS PBS, karanlıkta bir orbital çalkalayıcı üzerinde RT, 1 h için. Antikor çözüm ve yıkama, kısaca, PBS 1 x, 3 kez ile kaldırın. Nöronlar DAPI çözüm ile leke (PBS 1 0.1 µg/mL x) içinde belgili tanımlık karanlık bir orbital çalkalayıcı üzerinde RT, 15 dakika. Antikor çözüm ve yıkama, kısaca, PBS 1 x, 3 kez ile kaldırın. Mount coverslips kullanarak antifade montaj orta bir slayttaki.