Neste trabalho, descrevemos um protocolo para caracterizar T-dependentes e T-independentes respostas do isotipo de imunoglobulina (Ig) em camundongos usando ELISA. Este método usado sozinho ou em combinação com fluxo cytometry permitirá que os investigadores a identificar diferenças nas respostas de isotipo Ig mediada por células B em camundongos após imunização de antígenos T-dependentes e T-independentes.
Anticorpos, também denominados como diferenciados de imunoglobulinas (Ig), secretadas por linfócitos B, células plasmablasts/plasma, na imunidade humoral fornecem uma formidável defesa contra a invasão de agentes patogénicos através de diversos mecanismos. Um dos principal objetivos da vacinação é induzir proteção anticorpos antígeno-específicos para prevenir infecções fatais. Timo-dependentes (TD) e antígenos de Timo-independente (TI) podem eliciar respostas de IgM robustas antígeno-específicas e também podem induzir a produção de anticorpos de comutação de isotipo (IgG, IgA e IgE) bem como a geração de células B de memória com a ajuda fornecido por apresentadoras de antígenos (APCs) de células. Aqui, descrevemos um protocolo para caracterizar TD e TI Ig isotipo respostas em ratos utilizando ensaio imunoenzimático (ELISA). Neste protocolo, TD e TI Ig respostas são eliciadas em camundongos intraperitoneal (i.p.) imunização com antígenos conjugados hapteno modelo TNP-KLH (em alum) e TNP-polissacarídeo (em PBS), respectivamente. Para induzir resposta de memória TD, uma imunização de reforço do TNP-KLH em alum é dado em 3 semanas após a primeira imunização com o mesmo antígeno/adjuvante. Soros de mouse são colhidos em pontos diferentes de tempo, antes e após a imunização. Total de níveis de Ig de soro e anticorpos específicos TNP são posteriormente quantificados usando o Ig isotipo específico sanduíche e ELISA indireta, respectivamente. Para corretamente quantificar a concentração de soro de cada isotipo Ig, as amostras devem ser apropriadamente diluído para caber dentro da escala linear das curvas padrão. Usando este protocolo, consistentemente obtivemos resultados confiáveis com sensibilidade e alta especificidade. Quando usado em combinação com outros métodos complementares tais como citometria de fluxo, em vitro cultura de esplênica de células B e imuno-histoquímica coloração (IHC), este protocolo permitirá aos pesquisadores uma compreensão abrangente do anticorpo respostas em um determinado ambiente experimental.
Os linfócitos B são o principal jogador na imunidade humoral e o único tipo de célula em mamíferos que são capazes de produzir anticorpos, também denominados como imunoglobulinas (Ig)1,2. Anticorpos secretados pelas células B fornecem uma formidável defesa contra patógenos através de diversos mecanismos, incluindo a neutralização, opsonização e ativação do complemento, levando a imunidade protetora3a invadir. Secreção de anticorpos pelas células B só é alcançada após a ativação completa das células B específicas, que normalmente requer que duas distintas sinaliza3. Sinal 1 é retransmitido por ligação directa do antígeno (Ag) para o receptor de células B (BCR) expressado na superfície de de células específicas ingênua B3. Dependendo da fonte de sinal 2, ativação de células B pode ser dividida em Timo-dependentes (TD) ou Timo-independente (TI)3,4. Em uma resposta de antígeno de TD, sinal 2 é fornecida pelo cognato CD4 células T ativadas auxiliar (T,H), que expressam CD154, o ligante para o receptor co-estimulatória CD40 expressado em células de B a1,2,3. Em uma resposta de antígeno de TI, sinal 2 vem de qualquer envolvimento de receptores Toll-like (TLRs no caso tipo 1 TI Ag) ou cross-linking extensa dos BCRs (no caso do tipo 2 TI Ag) no B células3,4. Os antígenos de TI (TI-1) do tipo 1 são ligantes microbianas de TLRs, incluindo bacterianos lipopolissacarídeos (LPS), RNAs virais e microbiana CpG DNA4,5. Antígenos de TI (TI-2) do tipo 2 têm estrutura altamente repetitiva e são capazes de entregar prolongada e persistente sinalização à célula B por múltiplos do cross-linking dos BCRs4,6. Exemplos típicos de TI-2 antígenos incluem pneumocócica polissacarídeos e polissacarídeo conjugados hapteno6,7. Antígenos tanto TD e TI podem eliciar respostas de IgM robustas antígeno-específicas e também podem induzir a produção de anticorpos de comutação de isotipo (IgG, IgA e IgE) com a ajuda fornecida por apresentadoras de antígenos (APCs) de células como as células dendríticas (DCs)1 ,2,3. Além disso, ambos TD e TI antígenos são capazes de induzir respostas de memória com a ajuda de APCs, mas TD os antígenos são mais eficientes na indução de memória B célula geração3,8.
Neste protocolo, TD e TI Ig respostas são eliciadas em camundongos intraperitoneal (i.p.) imunização com hemocianina de Lapa 2.4.6-trinitrophenyl-fechadura de antígenos conjugados hapteno modelo (TNP-KLH) e TNP-polissacarídeo (neutro, altamente ramificado e alta massa), respectivamente,10,9,11. Antígenos de TD são geralmente usados com um adjuvante para aumentar a produção de anticorpos12. Aqui em nosso protocolo, TNP-KLH é injetado com alume, um adjuvante comumente utilizado em estudos de imunização12. Outros exemplos de adjuvantes que podem ser usados incluem completa ou incompleta adjutor de Freund (CFA ou IFA), A monofosforil lipídio / dicorynomycolate trealose (“Ribi” adjuvante) e CpG oligodeoxynucleotides, etc.13, 14. após a imunização, soros de rato são colhidos nos pontos de tempo diferentes e anticorpos específicos TNP em soros são quantificados usando o Ig isotipo específico enzima-lig da imunoabsorção ensaio (ELISA)9,10, 11.
ELISA é um ensaio baseado na placa que é amplamente utilizado como uma ferramenta de diagnóstico na medicina e também como uma ferramenta analítica em investigação biomédica15,16. É usado para detectar e quantificar analitos incluindo anticorpos, hormônios, citocinas, quimiocinas e vários antígenos, etc. ELISA pode ser executada em vários formatos diferentes, incluindo directo, indirecto, sanduíche e competitiva ELISA15,16. Em geral, envolve a imobilização do antígeno para uma superfície sólida, geralmente uma placa de microtitulação 96 poços, que é incubada com anticorpo primário. Após a incubação, o anticorpo não acoplado é lavado. Em um ELISA direto, o anticorpo primário diretamente é conjugado a uma enzima (peroxidase de rábano normalmente ou fosfatase alcalina), que pode decompor um substrato cromogénico para produzir uma mudança de cor visível detectada por um instrumento de detecção do sinal tais como uma Espectrofotómetro de15,16. Em contraste, se um anticorpo secundário enzima-lig é usado para ligar o anticorpo primário, então este é considerado um de15,de ELISA indireto16. ELISA direta é mais rápido enquanto ELISA indireta é mais sensível,15,16. Em um sanduíche ELISA, as placas são revestidas com anticorpo “captura” usado para imobilizar o antígeno de interesse nas amostras, e em seguida o antígeno capturado pode ser detectado por outro anticorpo “detecção” de uma forma directa ou indirecta15, 16. ELISA sanduíche oferece alta especificidade, uma vez que o antígeno é detectado por dois diferentes anticorpos do antígeno. Em um ELISA competitivo, a competição é estabelecida entre o antígeno da amostra e o antígeno de placa-limite para a ligação com o anticorpo primário, e em seguida a concentração de antígeno na amostra é quantificada através da medição da redução no sinal do substrato 15 , 16. ELISA competitivo pode ser executada usando o formato acima mencionado direto ou indireto e é útil para a detecção de antígenos pequenos com apenas um epítopo15,16.
Técnicas alternativas para a medição de anticorpos incluem radio-imunoensaio (RIA), ensaio de eletroquimioluminescência (ECL) ensaio e superfície ressonância de plasmon (SPR)17. RIA foi o primeiro imunoensaio desenvolvido que as medidas da presença de um antígeno (ou anticorpos) com alta especificidade e sensibilidade, usando reagentes radiolabeled18,19. No entanto, devido as preocupações de toxicidade radioativa, custos de eliminação, validade e licenças especiais para trabalhar com materiais radioactivos, ELISA é um melhor e mais conveniente técnica comum usa20,21. ECL é um ensaio altamente sensível no qual quimioluminescente reações são iniciadas usando eletricidade para gerar espécies altamente reativas de precursores estáveis na superfície de um eletrodo, em podem ser usadas para medir a quantidade de analitos (tais como antígenos ou anticorpos)22. No entanto, ECL requer um instrumento especial e, portanto, não é tão amplamente usado como ELISA23. SPR é um ensaio direto que pode ser usado para medir a vinculação dos ligantes (EG., anticorpos) para moléculas de imobilizado (EG., antígenos) em um sensor chip superfície24. SPR detecta as interações em tempo real, muito especificamente e não requer a utilização de reagentes rotulados como ELISA. No entanto, SPR também requer um equipamento especial e tem uma sensibilidade mais baixa do que ELISA17. Tendo em conta as limitações dos métodos alternativos, ELISA é a técnica mais adequada e conveniente para o nosso propósito no presente protocolo. Aqui, descrevemos o uso de sanduíche ELISA para a análise dos níveis totais do isotipo Ig e os procedimentos de ELISA indireto para a análise do antígeno-específicas isotipos de Ig.
Aqui, descrevemos o protocolo para a caracterização de TD e TI Ig isotipo respostas nos ratos usando ELISA. Sucesso da implementação do presente protocolo requer o uso de materiais especificados na tabela 1, incluindo placas de ensaio de ELISA, imunização Ags, anticorpos de isotipo específico do Ig e padrões. Deve ter cuidado para evitar o uso de placas de cultura de tecidos tratada por ELISA. Diluições dos padrões e amostras de soro devem ser feitas em chapas separadas não tratadas (fundo re…
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi suportado pelos institutos nacionais de subsídios saúde R01 CA158402 (P. Xie) e R21 AI128264 (P. Xie), o departamento de defesa conceder W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), um prêmio de piloto o Cancer Institute de New Jersey através do Grant número P30CA072720 do Instituto Nacional de câncer (P. Xie), uma concessão biomédica Busch (P. Xie), uma bolsa de Victor Stollar (a. leite) e um B. Anne e James B. Leathem Fellowship (S. Zhu).
VersaMax Tunable Microplate Reader | MDS Analytical Technologies | VERSAMAX | Equipment to read the plates |
SOFTmax PRO 5.3 | MDS Analytical Technologies | SOFTmax PRO 5.3 | Software for the plate reader |
GraphPad Prism | GraphPad | Prism | Software for graphing and statistics |
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) | Biosearch Technologies | F-1300-10 | A TI Ag for immunization |
TNP-KLH | Biosearch Technologies | T-5060-5 | A TD Ag for immunization |
TNP(38)-BSA | Biosearch Technologies | T-5050-10 (conjugation ratio: 38) | Coating Ag for TNP-specific ELISA |
TNP(3)-BSA | Biosearch Technologies | T-5050-10 (conjugation ratio: 3) | Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig |
Imject Alum | Fisher Scientific | PI-77161 | Alum adjuvant for immunization |
Falcon Polypropylene tubes | Fisher Scientific | 14-959-11A | For incubation of TNP-KLH/alum |
BD Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | For i.p. injection of mice |
Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom | Fisher Scientific | 14-245-61 | For ELISA |
Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom | VWR | 82050-622 | For serial dilutions of standards and samples |
Phosphatase substrate, 5 mg Tablets | Sigma | S0942-200TAB | AP substrate |
Diethanolamine | VWR | IC15251690 | A component of AP substrate buffer |
Goat anti-mouse IgM | SouthernBiotech | 1020-01 | Capture Ab for mouse IgM |
Goat anti-mouse IgG1 | SouthernBiotech | 1070-01 | Capture Ab for mouse IgG1 |
Goat anti-mouse IgG2a | SouthernBiotech | 1080-01 | Capture Ab for mouse IgG2a |
Goat anti-mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-01 | Capture Ab for mouse IgG2b |
Goat anti-mouse IgG3 | SouthernBiotech | 1100-01 | Capture Ab for mouse IgG3 |
Goat anti-mouse IgA | SouthernBiotech | 1040-01 | Capture Ab for mouse IgA |
Goat anti-mouse IgE | SouthernBiotech | 1110-01 | Capture Ab for mouse IgE |
AP-Goat anti-mouse IgM | SouthernBiotech | 1020-04 | Detection Ab for mouse IgM |
AP-Goat anti-mouse IgG1 | SouthernBiotech | 1070-04 | Detection Ab for mouse IgG1 |
AP-Goat anti-mouse IgG2a | SouthernBiotech | 1080-04 | Detection Ab for mouse IgG2a |
AP-Goat anti-mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-04 | Detection Ab for mouse IgG2b |
AP-Goat anti-mouse IgG3 | SouthernBiotech | 1100-04 | Detection Ab for mouse IgG3 |
AP-Goat anti-mouse IgA | SouthernBiotech | 1040-04 | Detection Ab for mouse IgA |
AP-Goat anti-mouse IgE | SouthernBiotech | 1110-04 | Detection Ab for mouse IgE |
Mouse IgM standard | BD Biosciences | 553472 | TNP-specific IgM, Clone G155-228 |
Mouse IgG1 standard | BD Biosciences | 554054 | TNP-specific IgG1, Clone 107.3 |
Mouse IgG2a standard | BD Biosciences | 556651 | TNP-specific IgG2a, Clone G155-178 |
Mouse IgG2b standard | BD Biosciences | 554055 | TNP-specific IgG2b, Clone 49.2 |
Mouse IgG3 standard | BD Biosciences | 553486 | KLH-specific IgG3, Clone A112-3 |
Mouse IgA standard | BD Biosciences | 550924 | Mineral oil-induced IgA, Clone MOPC-320 |
Mouse IgE standard | BD Biosciences | 557079 | TNP-specific IgE, Clone C38-2 |