Caratterizzazione delle risposte di isotipo dell'immunoglobulina timo-dipendenti e indipendenti del timo in topi usando l'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente

I linfociti B sono il principale attore in immunità umorale e l’unico tipo di cellula in mammiferi che sono in grado di produrre anticorpi, anche definiti come le immunoglobuline (Ig)^1,2. Gli anticorpi secernuti dalle cellule di B forniscono una difesa formidabile contro l’invasione patogeni tramite diversi meccanismi di neutralizzazione, opsonizzazione e l’attivazione del complemento, che conduce a un’immunità protettiva³. Secrezione di anticorpi dalle cellule di B si raggiunge solo dopo la completa attivazione di cellule B specifiche, che normalmente richiede che due distinti segnali³. Segnale 1 viene inoltrato da binding diretto dell’antigene (Ag) per il recettore delle cellule B (BCR) espresso sulla superficie delle cellule di B ingenui specifiche³. A seconda della fonte di segnale 2, attivazione delle cellule B può essere suddivisa in timo-dipendenti (TD) o timo-indipendenti (TI)^3,4. In risposta all’antigene un TD, segnale 2 è fornito da attivato cognate CD4 linfociti T helper (T_H), che esprimono CD154, il ligando per il recettore co-stimolatore CD40 espresso sulle cellule di B^1,2,3. In risposta all’antigene una TI, 2 segnale proviene da entrambi fidanzamento dei Toll-like receptors (TLRs nel caso tipo 1 TI Ag) o cross-linking vasto del BCRs (nel caso di tipo 2 TI Ag) sulla B cellule^3,4. Gli antigeni di TI (TI-1) di tipo 1 sono microbiche ligandi dei TLR, inclusi lipopolisaccaridi batterici (LPS), RNA virale e microbica CpG DNA^4,5. Gli antigeni di TI (TI-2) di tipo 2 hanno struttura altamente ripetitiva e sono in grado di fornire prolungata e persistente segnalazione alla cella B da più cross-linking del BCRs^4,6. Tipici esempi di antigeni TI-2 pneumococcici polisaccaridi e polisaccaride coniugato aptene^6,7. Gli antigeni sia TD e TI possono suscitare risposte antigene-specifiche IgM di robuste e possono anche indurre la produzione di anticorpi isotipo-switched (IgG, IgA e IgE) con l’aiuto fornito dall’antigene che presenta le cellule (APCs) quali le cellule dendritiche (DCs)^{1 ,2,3}. Inoltre, gli antigeni sia TD e TI sono in grado di indurre risposte di memoria con l’aiuto di APC, ma gli antigeni TD sono più efficienti a indurre la memoria delle cellule di B generazione^3,8.

In questo protocollo, TD e TI Ig risposte sono tratte in topi tramite immunizzazione intraperitoneale (i.p.) con emocianina di modello aptene coniugato antigeni 2, 4,6-trinitrophenyl-keyhole limpet (TNP-KLH) e TNP-polisaccaride (neutro, molto ramificato e a massa elevata), rispettivamente^9,10,11. Gli antigeni TD sono usati solitamente con un adiuvante per migliorare la produzione di anticorpi¹². Qui nel nostro protocollo, TNP-KLH viene iniettato con allume, un adiuvante comunemente utilizzato in studi di immunizzazione¹². Altri esempi di coadiuvanti che possono essere utilizzati completa o incompleta l’adiuvante di Freund (CFA o IFA), monofosforil-lipidico A / trehalose dicorynomycolate (“Ribi” adiuvante) e CpG oligodeoxynucleotides, ecc.^{13, 14}. dopo immunizzazione, sieri del mouse sono stati raccolti in diversi momenti e gli anticorpi di TNP-specifici nel siero sono quantificati tramite Ig specifici enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA) dosaggio^{9,10, 11}.

ELISA è un saggio basato su piastra che è ampiamente usato come uno strumento di diagnostica in medicina e anche come strumento analitico in ricerca biomedica^15,16. Esso viene utilizzato per rilevare e quantificare analiti compresi gli anticorpi, ormoni, citochine, chemochine e vari antigeni, ecc. ELISA può essere eseguita in diversi formati, tra cui diretto, indiretto, panino e competitivo ELISA^15,16. In generale, coinvolge l’immobilizzazione dell’antigene ad una superficie solida, solitamente una piastra microtiter a 96 pozzetti, che viene incubata con un anticorpo primario. Dopo l’incubazione, l’anticorpo non legato è lavato via. In una ELISA diretta, l’anticorpo primario è direttamente coniugato ad un enzima (tipicamente perossidasi o fosfatasi alcalina), che può fendere un substrato cromogenico per produrre un cambiamento di colore visibile rilevato da uno strumento di rilevamento del segnale come un spettrofotometro^15,16. Al contrario, se un anticorpo secondario enzima-collegata è usato per legare l’anticorpo primario, quindi questo è considerato come un’indiretta ELISA^15,16. ELISA diretta è più velocemente mentre ELISA indiretto è più sensibile^15,16. In un panino ELISA, le piastre sono rivestite con un anticorpo di “cattura” utilizzato per immobilizzare l’antigene di interesse nei campioni, e quindi l’antigene catturato può essere rilevato da un altro anticorpo di “rilevazione” in un modo diretto o indiretto^{15, 16}. Sandwich ELISA offre alta specificità poiché l’antigene viene rilevato da due differenti anticorpi dell’antigene. In una ELISA competitivo, è istituita la competizione tra l’antigene del campione e l’antigene associato a piastra per il legame dell’anticorpo primario, e quindi alla concentrazione di antigene nel campione è quantificata misurando la riduzione del segnale dal substrato ^{15 , 16}. ELISA competitivo può essere eseguita utilizzando il formato di diretto o indiretto di cui sopra ed è utile per la rilevazione degli antigeni piccoli con un solo epitopo^15,16.

Tecniche alternative per la misurazione degli anticorpi comprendono radioimmunoanalisi (RIA), dosaggio elettrochemiluminescenza (ECL) analisi e superficie di risonanza plasmonica (SPR)¹⁷. RIA è stato il primo immunoassay sviluppato misure che la presenza di un antigene (o l’anticorpo) con elevata specificità e sensibilità usando reagenti radiomarcato^18,19. Tuttavia, a causa delle preoccupazioni di tossicità radioattiva, i costi di smaltimento, shelf-life e licenze speciali per lavorare con materiali radioattivi, ELISA è una migliore e più conveniente tecnica comune utilizza^20,21. ECL è un test altamente sensibile in cui reazioni chemiluminescenti sono avviate usando l’elettricità per generare specie altamente reattive da precursori stabili sulla superficie di un elettrodo e possono essere utilizzate per misurare la quantità di analiti (come antigeni o gli anticorpi)²². Tuttavia, ECL richiede uno strumento speciale e così non è usato nel senso più ampio come ELISA²³. SPR è un dosaggio diretto che può essere utilizzato per misurare il grippaggio dei ligands (ad es., anticorpi) per immobilizzato molecole (ad es., antigeni) su un sensore chip superficie²⁴. SPR rileva le interazioni in tempo reale in modo molto specifico e non richiede l’uso di reagenti etichettati come ELISA. Tuttavia, SPR inoltre richiede un’attrezzatura speciale e ha una sensibilità inferiore rispetto ELISA¹⁷. Date le limitazioni dei metodi alternativi, ELISA è la tecnica più adatta e conveniente per il nostro scopo in questo protocollo. Qui, descriviamo l’uso di sandwich ELISA per l’analisi dei livelli di isotipo Ig totali e le procedure di ELISA indiretto per l’analisi dell’antigene-specifiche Ig isotipi.