Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção

Os linfócitos B são o principal jogador na imunidade humoral e o único tipo de célula em mamíferos que são capazes de produzir anticorpos, também denominados como imunoglobulinas (Ig)^1,2. Anticorpos secretados pelas células B fornecem uma formidável defesa contra patógenos através de diversos mecanismos, incluindo a neutralização, opsonização e ativação do complemento, levando a imunidade protetora³a invadir. Secreção de anticorpos pelas células B só é alcançada após a ativação completa das células B específicas, que normalmente requer que duas distintas sinaliza³. Sinal 1 é retransmitido por ligação directa do antígeno (Ag) para o receptor de células B (BCR) expressado na superfície de de células específicas ingênua B³. Dependendo da fonte de sinal 2, ativação de células B pode ser dividida em Timo-dependentes (TD) ou Timo-independente (TI)^3,4. Em uma resposta de antígeno de TD, sinal 2 é fornecida pelo cognato CD4 células T ativadas auxiliar (T,_H), que expressam CD154, o ligante para o receptor co-estimulatória CD40 expressado em células de B a^1,2,3. Em uma resposta de antígeno de TI, sinal 2 vem de qualquer envolvimento de receptores Toll-like (TLRs no caso tipo 1 TI Ag) ou cross-linking extensa dos BCRs (no caso do tipo 2 TI Ag) no B células^3,4. Os antígenos de TI (TI-1) do tipo 1 são ligantes microbianas de TLRs, incluindo bacterianos lipopolissacarídeos (LPS), RNAs virais e microbiana CpG DNA^4,5. Antígenos de TI (TI-2) do tipo 2 têm estrutura altamente repetitiva e são capazes de entregar prolongada e persistente sinalização à célula B por múltiplos do cross-linking dos BCRs^4,6. Exemplos típicos de TI-2 antígenos incluem pneumocócica polissacarídeos e polissacarídeo conjugados hapteno^6,7. Antígenos tanto TD e TI podem eliciar respostas de IgM robustas antígeno-específicas e também podem induzir a produção de anticorpos de comutação de isotipo (IgG, IgA e IgE) com a ajuda fornecida por apresentadoras de antígenos (APCs) de células como as células dendríticas (DCs)^{1 ,2,3}. Além disso, ambos TD e TI antígenos são capazes de induzir respostas de memória com a ajuda de APCs, mas TD os antígenos são mais eficientes na indução de memória B célula geração^3,8.

Neste protocolo, TD e TI Ig respostas são eliciadas em camundongos intraperitoneal (i.p.) imunização com hemocianina de Lapa 2.4.6-trinitrophenyl-fechadura de antígenos conjugados hapteno modelo (TNP-KLH) e TNP-polissacarídeo (neutro, altamente ramificado e alta massa), respectivamente,^10,9,11. Antígenos de TD são geralmente usados com um adjuvante para aumentar a produção de anticorpos¹². Aqui em nosso protocolo, TNP-KLH é injetado com alume, um adjuvante comumente utilizado em estudos de imunização¹². Outros exemplos de adjuvantes que podem ser usados incluem completa ou incompleta adjutor de Freund (CFA ou IFA), A monofosforil lipídio / dicorynomycolate trealose (“Ribi” adjuvante) e CpG oligodeoxynucleotides, etc.^{13, 14}. após a imunização, soros de rato são colhidos nos pontos de tempo diferentes e anticorpos específicos TNP em soros são quantificados usando o Ig isotipo específico enzima-lig da imunoabsorção ensaio (ELISA)^{9,10, 11}.

ELISA é um ensaio baseado na placa que é amplamente utilizado como uma ferramenta de diagnóstico na medicina e também como uma ferramenta analítica em investigação biomédica^15,16. É usado para detectar e quantificar analitos incluindo anticorpos, hormônios, citocinas, quimiocinas e vários antígenos, etc. ELISA pode ser executada em vários formatos diferentes, incluindo directo, indirecto, sanduíche e competitiva ELISA^15,16. Em geral, envolve a imobilização do antígeno para uma superfície sólida, geralmente uma placa de microtitulação 96 poços, que é incubada com anticorpo primário. Após a incubação, o anticorpo não acoplado é lavado. Em um ELISA direto, o anticorpo primário diretamente é conjugado a uma enzima (peroxidase de rábano normalmente ou fosfatase alcalina), que pode decompor um substrato cromogénico para produzir uma mudança de cor visível detectada por um instrumento de detecção do sinal tais como uma Espectrofotómetro de^15,16. Em contraste, se um anticorpo secundário enzima-lig é usado para ligar o anticorpo primário, então este é considerado um de^15,de ELISA indireto¹⁶. ELISA direta é mais rápido enquanto ELISA indireta é mais sensível,^15,16. Em um sanduíche ELISA, as placas são revestidas com anticorpo “captura” usado para imobilizar o antígeno de interesse nas amostras, e em seguida o antígeno capturado pode ser detectado por outro anticorpo “detecção” de uma forma directa ou indirecta^{15, 16}. ELISA sanduíche oferece alta especificidade, uma vez que o antígeno é detectado por dois diferentes anticorpos do antígeno. Em um ELISA competitivo, a competição é estabelecida entre o antígeno da amostra e o antígeno de placa-limite para a ligação com o anticorpo primário, e em seguida a concentração de antígeno na amostra é quantificada através da medição da redução no sinal do substrato ^{15 , 16}. ELISA competitivo pode ser executada usando o formato acima mencionado direto ou indireto e é útil para a detecção de antígenos pequenos com apenas um epítopo^15,16.

Técnicas alternativas para a medição de anticorpos incluem radio-imunoensaio (RIA), ensaio de eletroquimioluminescência (ECL) ensaio e superfície ressonância de plasmon (SPR)¹⁷. RIA foi o primeiro imunoensaio desenvolvido que as medidas da presença de um antígeno (ou anticorpos) com alta especificidade e sensibilidade, usando reagentes radiolabeled^18,19. No entanto, devido as preocupações de toxicidade radioativa, custos de eliminação, validade e licenças especiais para trabalhar com materiais radioactivos, ELISA é um melhor e mais conveniente técnica comum usa^20,21. ECL é um ensaio altamente sensível no qual quimioluminescente reações são iniciadas usando eletricidade para gerar espécies altamente reativas de precursores estáveis na superfície de um eletrodo, em podem ser usadas para medir a quantidade de analitos (tais como antígenos ou anticorpos)²². No entanto, ECL requer um instrumento especial e, portanto, não é tão amplamente usado como ELISA²³. SPR é um ensaio direto que pode ser usado para medir a vinculação dos ligantes (EG., anticorpos) para moléculas de imobilizado (EG., antígenos) em um sensor chip superfície²⁴. SPR detecta as interações em tempo real, muito especificamente e não requer a utilização de reagentes rotulados como ELISA. No entanto, SPR também requer um equipamento especial e tem uma sensibilidade mais baixa do que ELISA¹⁷. Tendo em conta as limitações dos métodos alternativos, ELISA é a técnica mais adequada e conveniente para o nosso propósito no presente protocolo. Aqui, descrevemos o uso de sanduíche ELISA para a análise dos níveis totais do isotipo Ig e os procedimentos de ELISA indireto para a análise do antígeno-específicas isotipos de Ig.