Análise das células do epitélio do pigmento da retina humana, diferenciação e manutenção: um modelo de doença-em-um-prato de mutações BEST1
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para diferenciar as células do epitélio (RPE) pigmento da retina de células-tronco pluripotentes humanas mutações paciente-derivado de rolamento. As linhas de célula mutante podem ser utilizadas para análises funcionais, incluindo immunoblotting, imunofluorescência e braçadeira do remendo. Esta abordagem da doença-em-um-prato contorna a dificuldade de obtenção de células RPE humanas nativas.
Abstract
Apesar de mais de 200 mutações no gene humano BEST1 foram identificadas e ligadas a doenças degenerativas da retina, os mecanismos patológicos permanecem indescritíveis, principalmente devido à falta de um modelo de bom na vivo para o estudo BEST1 e suas mutações sob condições fisiológicas. BEST1 codifica um canal iônico, ou seja, BESTROPHIN1 (BEST1), que funciona no epithelium retinal do pigment (RPE); no entanto, a acessibilidade extremamente limitada para as células RPE humanas nativas representa um grande desafio para a investigação científica. Este protocolo descreve como gerar humanos RPEs rolamento BEST1 doença-causando mutações por induzida por diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Como hPSCs são auto renováveis, esta abordagem permite que os pesquisadores ter uma fonte constante de hPSC-RPEs para várias análises experimentais, como immunoblotting, imunofluorescência e braçadeira do remendo e, portanto, fornece um modelo de doença-em-um-prato muito poderoso para BEST1-associado a condições da retina. Notavelmente, esta estratégia pode ser aplicada para estudar a fisiologia RPE (patho) e outros genes de interesse expressado nativamente no RPE.
Introduction
Tem sido documentado pelo menos cinco doenças degenerativas da retina causadas por mutações genéticas no BEST1 gene1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, com o número de mutações relatadas já mais de 200 e ainda crescente. Estes BEST1-doenças associadas, também conhecido como bestrophinopathies, causam perda de visão progressista e até mesmo cegueira, e há atualmente nenhum tratamento eficaz. O produto proteico de BEST1, nomeadamente BESTROPHIN1 (BEST1), é um Ca2 +-canal de Cl– ativado (CaCC) especificamente expressado no epithelium retinal do pigment (RPE) dos olhos5,6, 8,9. Importante, um fenótipo clínico de BEST1-doenças associadas é a reduzida resposta visual aos estímulos de luz, chamado de pico de luz (LP) medido no eletrooculograma10,11; LP é acreditado para ser mediada por um CaCC RPE12,13,14. Para melhor compreender os mecanismos patológicos de mutações BEST1 e trabalhar no sentido de terapias potenciais, é essencial estudar mutante BEST1 canais endogenamente expressados em células humanas de RPE.
No entanto, obter o RPE células diretamente de pacientes ao vivo é altamente impraticável. Embora as células RPE nativas podem ser colhidas de biópsias de cadáveres humanos e fetos, o difícil acesso a essas fontes limita significativamente a investigação científica. Portanto, é essencial dispor de fontes alternativas de RPE diferente de olhos humanos. Esta chamada foi atendida pelos recentes avanços nas técnicas de células-tronco, como as células RPE funcionais agora podem ser diferenciadas de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo células-tronco embrionárias (hESCs) e induzida por células estaminais pluripotentes (hiPSCs), este último sendo gerada pela reprogramação de fibroblastos da pele primária de doadores16,17,18. Importante, a auto-renovação e pluripotência de hPSCs certifique-se de uma fonte confiável para gerar RPEs, enquanto a paciente-especificidade de hiPSCs e potencial de modificação do genoma de hESCs (por exemplo, por CRISPR) oferecem um modelo de doença-em-um-prato versátil para mutações de BEST1 desejadas.
hPSC-RPE tem várias vantagens sobre ratos modelos RPE: 1) ratos do KO BEST1 não exibem qualquer anormalidade da retina19, levantando a possibilidade de exigência genética diferente de BEST1 no RPE entre ratos e humanos; 2) apenas 3% de células humanas de RPE são binucleate, em contraste com 35% em ratos20; 3) hiPSC-RPE potencializa transplante autólogo na clínica tratamento de retina distúrbios21. No entanto, modelos animais são ainda indispensáveis para estudar RPE fisiologia e patologia em um sistema ao vivo, e o potencial oncogênica de hiPSC não pode ser esquecido.
O procedimento aqui descreve um hPSC moderadamente simples e útil para o protocolo de diferenciação RPE que pode ser usado para fins clínicos e de pesquisa. Este protocolo utiliza a nicotinamida (vitamina B3) para aumentar a diferenciação de hPSCs tecido neural, que mais é induzida a se diferenciar em RPE pelo tratamento com a União. Tratamento de nicotinamida foi mostrado para aumentar o número de células pigmentadas (sinal de diferenciação em RPE), possivelmente se atenuar a atividade apoptotic de diferenciar células22. As células resultantes do hPSC-RPE exibem a mesmas chaves marcadores, morfologia de paralelepípedos e funcionalidade celular como nativo humano RPE células22. Assim, em um ambiente de pesquisa, as células de RPE-hPSC resultante são adequadas para análises funcionais a jusante, incluindo immunoblotting, imunocoloração e braçadeira do remendo de célula inteira, para que procedimentos experimentais detalhados também são fornecidos. Clinicamente, as células RPE derivadas de células-tronco têm mostrado grande potencial para o tratamento de transplante de degeneração macular em estudos com animais e testes em humanos de23.
Protocol
Representative Results
Discussion
O procedimento mais importante para a abordagem da doença-em-um-prato é para diferenciar o hPSCs com uma doença-causando mutação de linhagem celular correto, que é o RPE para BEST1. Assim, após cada experiência de diferenciação, as células de RPE-hPSC resultante devem ser cuidadosamente validadas para seu estado maduro por morfologias RPE específicos e marcadores de proteína a16,17,18. Para minimizar o arte…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projecto foi financiado pelo NIH subsídios EY025290, GM127652 e da Universidade de Rochester financiamento de start-up.
Materials
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
Referenzen
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