Summary

Упрощенная и эффективный метод для изоляции первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожной ткани

Published: August 25, 2018
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол эффективно изолировать первичной человеческие кератиноциты от взрослых кожных тканей. Этот метод упрощает обычные процедуры с использованием ингибитора Y-27632 рок в средне-прививка спонтанно отделить эпидермальных клеток от кожных клеток.

Abstract

Для лабораторных исследований и клинического применения основного человека кератиноцитов, изолированный от свежих кожных тканей и их расширение в пробирке широко использовались. Обычные изоляции метод человеческие кератиноциты включает в себя последовательное ферментативного пищеварения двухэтапная процедура, которая оказалась неэффективной в генерации начальных клетки от взрослых тканей из-за низкой сотовый скорость восстановления и сокращение клеток жизнеспособности. Недавно мы сообщили расширенный метод изолировать человека первичной эпидермальный прародитель клеток тканей кожи, использующий ингибитора киназы Ро Y-27632 в среде. По сравнению с традиционными протоколом, этот новый метод проще, легче и менее трудоемким и увеличивает урожайность эпителиальных стволовых клеток и усиливает их характеристики стволовых клеток. Кроме того новая методология не требует отделения эпидермис от дермы и, таким образом, подходит для изоляции клетки из различных видов тканей взрослого. Этот новый метод изоляции преодолевает основных недостатков традиционных методов и больше подходит для производства большого количества клеток эпидермиса с высокой потенции, как в лабораторных, так и для клинического применения. Здесь мы опишем новый метод в деталях.

Introduction

Целью было разработать простой и эффективный протокол изолировать первичной человеческие кератиноциты (HKCs) от взрослых тканях, особенно для клинического применения. Эпидермальный стволовых клеток кожи, локализованные в базального слоя кожи, обладают высоким потенциалом размножаться и дифференциации кератиноцитов для поддержания функций кожи1,2,3, 4. HKCs, изолированных от кожи, ткани широко используются для кожи ткани инженерии и регенерации целей, особенно в ремонт поврежденной кожи и генной терапии для клинического применения5,6. Ключевым вопросом для приложений на базе HKC является эффективно изолировать и расширить большое количество HKCs с высоким потенциальным в vitro7,8. Хотя различные исследовательские группы разработали методы для производства культур стволовых как HKCs, эти методы являются иногда длительным и сложным для выполнения и другие ограничения, например урожайность низкая клеток и ограничиваясь типом кожи образца используемые9. К примеру традиционный метод, чтобы изолировать HKCs от кожных тканей предполагает двухэтапный ферментативного пищеварения с разделением эпидермис дерма6. Этот метод обычно хорошо работает для новорожденных тканей, но она становится очень трудно, когда используется для изоляции клетки от взрослых тканях.

Y-27632, ингибитора киназы Ро связанные белком (рок), сообщалось значительно повысить эффективность эпидермальный стволовых клеток изоляции и колонии роста10,11,12. В предыдущем исследовании мы обнаружили, что Y-27632 облегчает клоновых рост клеток эпидермиса, но уменьшает доходность кожных клеток, дифференциально контролируя экспрессию молекул адгезии13. Мы также создали новое средство кондиционером прививка, называется G-средний, который поддерживает рост и урожайность первичных клеток эпидермиса. Объединив G-средний с Y-27632, этот новый метод может спонтанно отдельных клеток эпидермиса и дермы после Пищеварение энзима, удалив таким образом шаг эпидермис дерма разделения13,14. Основываясь на предыдущих докладах, мы теперь описывают подробные процедуры этот новый метод, чтобы изолировать HKCs от взрослых кожной ткани.

Protocol

Человеческие ткани, используемые в настоящем Протоколе, обрабатывались в соответствии с руководящими принципами Комитета этики Института исследований человеческого (NO.2015120401, Дата: 12 мая 2015). 1. Подготовка Собирать свежие взрослых брюшной кожных тканей, отказаться о…

Representative Results

На рисунке 1представлены схемы нового метода (рис. 1A) и традиционным методом (рис. 1B). Традиционным методом является двухэтапный пищеварение, которая требует 2-день процедуры. Напротив новый метод это Одношаговая пищеваре…

Discussion

Культивированный первичной HKCs широко использовались для лечения ран в клиниках для более чем трех десятилетий, и с того времени, он был всегда важно эффективно получить достаточное количество клеток для клинического применения своевременно. Таким образом на практике, обычные изоляци?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана национальной ключ научных исследований и развития программа Китая (2017YFA0104604), Генеральный программы национального фонда естественных наук Китая (NSFC, 81772093), Наука и технологии развития программа Сучжоу (ZXL2015128), Естественные науки фонд провинции Цзянсу (BK20161241) и премию ученый Taishan Шаньдун (tshw201502065).

Materials

Countess automated cell counter Invitrogen Inc.  C10227 Automatic cell counting 
CO2 Incubator Thermo Scientific 51026333 For cell incubating
Sorvall ST 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004380 Cell centrifuge
Constant Temperature Shaker Shanghai Boxun 150036 For water bath
Electronic Scale Harbin Zhonghui 1171193 For tissue weighing
Cell Culture Dish Eppendorf 30702115 For cell culture
50ml Centrifuge Tube KIRGEN 171003 For cell centrifuge
Cell Strainer Corning incorporated 431792 Cell filtration
Phosphate buffered solution Solarbio Life Science  P1020-500 Washing solution
DMEM Thermo Scientific C11995500 Component of neutralization medium
Defined K-SFM Life Technologies 10785-012 Epidermal cells culture medium
Penicillin Streptomycin Thermo Scientific 15140-122 Antibiotics
Fetal Bovine Serum Biological Industries 04-001-1AC5 Component of neutralization medium
0.05% Trypsin Life Technologies 25300-062 For HKC dissociation
0.25% Trypsin  Beijing Solarbio Science & Technology T1350-100 For HKC dissociation
Coating Matrix Kit Life Technologies R-011-K For coating matrix
Dispase Gibco 17105-041 For HKC isolation
Collagenase Type I Life Technologies 17100-017 For HKC isolation
Deoxyribonuclease I Sigma 9003-98-9 For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, Hams Life Technologies 31765035 Component of G-medium
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore Merck Biosciences 341595 Growth factor in G-medium
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503 ROCK inhibitor
Fungizone Gibco 15290026 Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein Gibco PHG0311 Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8 Thermo Scientific NC9864731 cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5 Hewlett-Packard Development Company MA-20142 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human Loricrin Covance PRB-145p For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human Vimentin Cell Signaling Technology 3390 For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3) Santa Cruz  SC-19622 flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITC Santa Cruz  SC-2831 negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis 

Referenzen

  1. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
  2. Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. Development and homeostasis of the skin epidermis. Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383 (2012).
  3. Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells – role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
  4. Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal stem cells of the skin. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).
  5. Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2 (2013).
  6. Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
  7. Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
  8. Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
  9. Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
  10. Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
  11. Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
  12. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
  13. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
  14. Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
  15. Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
  16. Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
  17. Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
  18. Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Liu, Z., Wen, J., Leng, X., Zhou, Q., Zhou, C., Zhao, H., Wu, X. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57784, doi:10.3791/57784 (2018).

View Video