Summary

一种简便有效的成人皮肤组织中人角质形成细胞的分离方法

Published: August 25, 2018
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Summary

在这里, 我们提出了一个协议, 以有效地隔离主要的人角质细胞从成人皮肤组织。该方法利用接种培养基中的岩石抑制剂 Y-27632, 将表皮细胞与真皮细胞自发分离, 从而简化了常规程序。

Abstract

从新鲜皮肤组织中分离出来的人角质形成细胞及其体外扩张已被广泛应用于实验室研究和临床应用。传统的人角质形成细胞的分离方法涉及两步序贯酶消化法, 由于细胞回收率低, 细胞减少, 在成年组织中产生原发体细胞效率低下。可行性。我们最近报告了一种先进的方法, 从皮肤组织中分离人类主要表皮祖细胞, 利用 Y-27632 激酶抑制剂在培养基中。与传统的协议相比, 该方法简单、简便、耗时少, 增加了上皮干细胞的产量, 增强了干细胞的特性。此外, 新的方法不需要分离表皮与真皮, 因此, 适合隔离细胞从不同类型的成人组织。这种新的隔离方法克服了传统方法的主要缺点, 更适合在实验室和临床应用中生产大量具有高效能的表皮细胞。在这里, 我们详细描述了新的方法。

Introduction

目的是制定一个简单有效的协议, 以隔离主要的人角质细胞 (好客精神) 从成人组织, 特别是在临床应用。皮肤表皮干细胞, 局部在皮肤的基底层, 具有很高的潜能增殖和分化, 并提供角质细胞维持皮肤的功能1,2,3, 4. 从皮肤组织中分离出来的好客精神广泛用于皮肤组织工程和再生目的, 特别是在修复受损皮肤和用于临床应用的基因治疗5,6。HKC 应用的关键问题是有效地分离和扩展大量的好客精神, 其体外78具有很高的潜力。虽然不同的研究小组已经开发出了培养茎样好客精神的方法, 但这些方法有时耗时且复杂, 并有其他限制, 如低细胞产量和受皮肤标本类型的限制。使用9。例如, 传统的方法分离好客精神从皮肤组织涉及两步酶消化分离的表皮从真皮6。这种方法通常适用于新生儿组织, 但它变得非常困难, 当用于隔离细胞从成人组织。

Y-27632, 一种蛋白激酶 (岩石) 抑制剂, 据报道, 大大提高了表皮干细胞分离和菌落生长的效率10,11,12。在以前的研究中, 我们发现 Y-27632 促进表皮细胞的克隆生长, 但通过差异控制黏附分子的表达来降低真皮细胞的产量13。我们还建立了一个新的条件接种培养基, 称为 G 培养基, 它支持的生长和产量的主要表皮细胞。采用 G-培养基与 Y-27632 相结合的方法, 可以在酶消化后自发分离表皮和真皮细胞, 从而去除表皮-真皮分离1314的步骤。根据以前的报告, 我们现在描述了这个新方法的详细程序, 以隔离好客精神从成人皮肤组织。

Protocol

本议定书所使用的人体组织已根据该机构的人类研究道德委员会的指导方针进行处理 (2015120401, 日期: 2015年5月12日)。 1. 筹备工作 收集在医院的整形手术丢弃的新鲜成人腹部皮肤组织50毫升管与10毫升冰冷 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM)。标本可以保持在4°c, 可达72小时, 而不会显著影响细胞的生存能力。 准备试剂和培养基, 如下所述。 添加1毫升青霉素 (100 U/?…

Representative Results

图 1给出了新方法 (图 1A) 和常规方法 (图 1B) 的示意图。传统的方法是两步消化, 这需要2天的过程。相比之下, 新的方法是一步消化, 这需要大约3小时的时间来完成。重要的是, 一步新的方法可以同时获得两个种群 (表皮和真皮细胞), 这取决于接种培养基中 Y-27632 的存在。此外, 如果在隔离后接种相同数量的?…

Discussion

培养的初级好客精神已被广泛用于治疗创伤的诊所超过三年, 并从那时起, 一直重要的是有效地获得足够数量的细胞, 为临床应用及时的方式。因此, 在实践中, 传统的隔离方法, 需要分离的表皮与真皮, 使难以满足这些要求, 由于细胞的低产量和低的能力, 通过成人细胞。在这里, 我们描述了一个新的简单方法, 我们开发了以有效地获得好客精神从成人组织的基础上报告13,<sup…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到国家重点研究开发项目 (2017YFA0104604)、中国国家自然科学基金总计划 (81772093)、苏州科技发展规划 (ZXL2015128) 的支持,江苏省自然科学基金 (BK20161241), 山东泰山学者奖 (tshw201502065)。

Materials

Countess automated cell counter Invitrogen Inc.  C10227 Automatic cell counting 
CO2 Incubator Thermo Scientific 51026333 For cell incubating
Sorvall ST 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004380 Cell centrifuge
Constant Temperature Shaker Shanghai Boxun 150036 For water bath
Electronic Scale Harbin Zhonghui 1171193 For tissue weighing
Cell Culture Dish Eppendorf 30702115 For cell culture
50ml Centrifuge Tube KIRGEN 171003 For cell centrifuge
Cell Strainer Corning incorporated 431792 Cell filtration
Phosphate buffered solution Solarbio Life Science  P1020-500 Washing solution
DMEM Thermo Scientific C11995500 Component of neutralization medium
Defined K-SFM Life Technologies 10785-012 Epidermal cells culture medium
Penicillin Streptomycin Thermo Scientific 15140-122 Antibiotics
Fetal Bovine Serum Biological Industries 04-001-1AC5 Component of neutralization medium
0.05% Trypsin Life Technologies 25300-062 For HKC dissociation
0.25% Trypsin  Beijing Solarbio Science & Technology T1350-100 For HKC dissociation
Coating Matrix Kit Life Technologies R-011-K For coating matrix
Dispase Gibco 17105-041 For HKC isolation
Collagenase Type I Life Technologies 17100-017 For HKC isolation
Deoxyribonuclease I Sigma 9003-98-9 For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, Hams Life Technologies 31765035 Component of G-medium
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore Merck Biosciences 341595 Growth factor in G-medium
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503 ROCK inhibitor
Fungizone Gibco 15290026 Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein Gibco PHG0311 Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8 Thermo Scientific NC9864731 cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5 Hewlett-Packard Development Company MA-20142 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human Loricrin Covance PRB-145p For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human Vimentin Cell Signaling Technology 3390 For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3) Santa Cruz  SC-19622 flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITC Santa Cruz  SC-2831 negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis 

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Liu, Z., Wen, J., Leng, X., Zhou, Q., Zhou, C., Zhao, H., Wu, X. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57784, doi:10.3791/57784 (2018).

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