Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الأمثل لالتقاط الليزر ميكروديسيكشن لعزل Ganglia المعوي من الأنسجة البشرية الطازجة المجمدة

Published: June 14, 2018 doi: 10.3791/57762
Automatic Translation
1, 1, 1
1Vanderbilt University Medical Center

Summary

والهدف من هذا البروتوكول الحصول على عينات من الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوية المعزولة من الأنسجة المعوية البشرية غير المثبتة، مستأصل حديثا باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM). ويشمل هذا البروتوكول إعداد فلاش تجميد عينات من الأنسجة المعوية البشرية، كريوسيكتيونينج، وتلطيخ ethanolic والجفاف، LCM، واستخراج الحمض النووي الريبي.

Abstract

والغرض من هذا الأسلوب الحصول على عينات من الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوية التي جمعت من الأنسجة المعوية البشرية غير المثبتة، مستأصل حديثا باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM). وقد حددنا خمس خطوات في سير العمل التي لا بد منها للحصول على عزل الحمض النووي الريبي من ganglia المعوي مع كمية ونوعية عالية بما فيه الكفاية لما يليها الحمض النووي الريبي أولاً، عند إعداد الأنسجة المعوية، يجب أن يكون كل عينة السائل الزائد كل إزالة بواسطة النشاف قبل التسوية serosa قدر الإمكان عبر الجزء السفلي من قوالب قاعدة كبيرة. العينات ثم تجمد بسرعة فوق ملاط الثلج الجاف و 2-ميثيلبوتاني. وثانيا، عند تقطيع الأنسجة، من المهم أن موضع كريومولدس حتى الأجزاء المعوية موازية للطائرة الكامل الضفيرة مينتيريك، مما تسفر عن مساحة أكبر من ganglia المعوي كل شريحة. الثالثة، خلال LCM، البولي إثيلين نابثالاتي (القلم)-عرض الشرائح غشاء أكبر قدر من السرعة والمرونة في تحديد الأشكال غير موحدة من ganglia المعوي عند جمع ganglia المعوي. رابعا، للتصور متميزة من ganglia المعوية داخل الأقسام، نقدم الأصباغ المتوافقة مع الإيثانول، مثل "كريسيل البنفسجي"، ممتازة الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي بالنسبة للأصباغ المائية. أخيرا، لاستخراج الحمض النووي الريبي من العقد تم التقاطها، لاحظنا الفروق بين مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي التجارية التي أسفرت عن تفوق الجيش الملكي النيبالي الكمية والنوعية، والقضاء على التلوث بالحمض النووي. الأمثل لهذه العوامل في البروتوكول الحالي إلى حد كبير يسرع سير العمل وغلة عينات ganglia المعوي مع استثنائية الحمض النووي الريبي النوعية والكمية.

Introduction

ويهدف هذا الأسلوب للحصول على عينات الحمض النووي الريبي عالية الجودة من ganglia المعوي من الأنسجة المعوية البشرية باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM). البروتوكول هو موضح هنا تم الأمثل لتقديم نوعية الجيش الملكي النيبالي وغلة كافية للحمض النووي الريبي التسلسل (الحمض النووي الريبي-seq) والمقصود ليتم استخدامها مع الأنسجة المعوية البشرية مستأصل حديثا، غير المثبتة، مجمدة في فلاش.

اضطرابات حركية الجهاز الهضمي والأمعاء الوظيفية يؤثر على واحد من كل أربعة أشخاص في الولايات المتحدة. النظام العصبي المعوي (ENS)، كما يشار إلى الدماغ الثاني1، غالباً في وسط هذه الاضطرابات، كما أنها تلعب دوراً حاسما في التوازن القناة الهضمية وحركية. عموما قيدت التلاعب بحركية القناة الهضمية للاستئصال الجراحي للأنسجة أجانجليونيك/نونكونتراكتيلي، وتعديل النظام الغذائي المزمن، و/أو الأدوية. من المستغرب، يظل الترنسكربيتوم الكامل من ENS الكبار تكون متسلسلة، يحد كثيرا من قدرتنا على تحديد الجزيئات داخل ENS يمكن استهداف فارماسيوتيكالي أو تستخدم في علاجات الخلايا الجذعية.

هناك طرق قليلة نسبيا لعزل الحمض النووي الريبي من ganglia المعوية البشرية. يتطلب النهج الأول، تفكك الخلية2، حضانة ارتفاع درجات الحرارة وأوقات طويلة الحضانة؛ على حد سواء التي من المعروف أن تعزز تدهور الجيش الملكي النيبالي، ويغير2،الترنسكربيتوم3. نهج بديل، LCM، أكثر موثوقية يحافظ الترنسكربيتوم ويحمي سلامة الحمض النووي الريبي. على الرغم من أن العديد من الدراسات قد استخدمت LCM لجمع ganglia من الأنسجة المعوية البشرية مجمدة طازجة4،،من56، هذه النهج يعوقها أما ضعف كمية ونوعية الجيش الملكي النيبالي، وكانت ذات العمالة الكثيفة جداً، أو تحتاج إلى تعديل لتلطيخ أو تقنيات استخراج الحمض النووي الريبي للعمل في أيدينا. بروتوكولات LCM أخرى مصممة للحفاظ على الحمض النووي الريبي التي تم العثور عليها في المنتج LCM أدلة قدمت تحسينات إضافية7،8، ولكن التكيف الضروري عند تطبيقه على عزل ganglia المعوي8، 9-ولهذه الأسباب، قمنا بتطوير بروتوكول أمثل استناداً إلى هذه الموارد أن ينتج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوية البشرية، وسير عمل سريع نسبيا، وتنتج نتائج متسقة عبر كبيرة عدد العينات.

في هذه الدراسة، نقدم موجزاً لإجراءات محسنة تسهل عزل الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوي مصدرها الأنسجة المعوية البشرية مستأصل. لدينا أسلوب يتضمن خمسة جوانب هامة. ينبغي أن يتم اقتطاعها عينات الأمعاء البشرية الأولى، مستأصل حديثا، غير المثبتة للحجم، وجميع الرطوبة الزائدة إزالة مع أنسجة مختبرية وسويت بالأرض في قالب قاعدة كبيرة قبل تجميد فلاش قمة الطين من الثلج الجاف و 2-ميثيلبوتاني (2 ميغا بايت). وينبغي إعداد المقاطع النسجية، والثانية من الأمعاء للحصول على الطائرة الكامل الضفيرة مينتيريك على شريحة، الذي يقدم حمولة كبيرة من ganglia المعوي. نجاح هذه الخطوة تعتمد إلى حد كبير على عملية إعداد الأنسجة. ثالثا، يتطلب هيكل نونونيفورم ganglia في ENS استخدام البولي إثيلين نابثالاتي (القلم) غشاء الشرائح6، التي توفر أكبر قدر من السرعة والدقة أثناء عملية LCM. ينبغي استخدام الأصباغ الرابعة، المتوافقة مع الإيثانول، مثل "كريسيل البنفسجي"، للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي أثناء تلطيخ ganglia المعوي. آخر، عملية استخراج الحمض النووي الريبي حاسمة بالنسبة لنتيجة ناجحة مع ما يليها الحمض النووي الريبي سعينا لنهج استخراج الحمض النووي الريبي التي تنتج نزاهة الجيش الملكي النيبالي عالية ويزيد الغلة الحمض النووي الريبي عند بدء التشغيل مع مجموعات صغيرة من ganglia المعوي ويزيل التلوث بالحمض النووي ويحتفظ العديد من الحمض النووي الريبي الأنواع ممكن.

أخذت معا، الاستفادة المثلى من هذه العوامل في هذه الدراسة إلى حد كبير يسرع سير العمل وغلة عينات ganglia المعوي مع استثنائية الحمض النووي الريبي كمية ونوعية. وكانت النتائج متسقة إلى حد كبير بين مجموعة كبيرة من العينات، مما يشير إلى اتساق هذا النهج. علاوة على ذلك، فقد استخدمنا هذه النهج بالتسلسل بنجاح عشرات من عينات الحمض النووي الريبي من ganglia المعوي. يمكن أيضا تكييف الاستراتيجيات التي أبرزت هنا لأداء LCM للعقد المطلوب أو نويات الطرفية والجهاز العصبي المركزي والحالات الأخرى التي تتطلب عزل الحمض النووي الريبي عالية الجودة على نطاق واسع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات المذكورة هنا فاندربيلت الجامعي المؤسسي استعراض المجلس (مجلس الهجرة واللاجئين).

1-إعداد قبل وصول الأنسجة

  1. الحصول على موافقة الاتحاد الدولي للرجبى السليم والتنسيق مع وكالات التبرع بالأعضاء البشرية للحصول على أنسجة الأمعاء مستأصل حديثا، غير المثبتة من الجهات المانحة أن تفي بجميع معايير البحث المطلوبة للدراسة.
    ملاحظة: هذا البروتوكول يمكن تطويعها للاستخدام مع الفئران والقوارض نماذج أخرى.
    1. فورا على استئصال كل جزء الأمعاء، دقة مسح التجويف مع برنامج تلفزيوني المثلجة أو وسيطة تخزين الأنسجة لإزالة بقايا المواد لومينال أو البراز.
    2. بعد التنظيف والتخلص من النفايات في وعاء واقية مناسبة، غمر النسيج في كمية كافية من الأنسجة سعة التخزين المتوسطة (مثل 3-5 مرات حجم الأنسجة المعوية) وتخزينها في البلاستيك المسمى فردياً، والمياه محكم حاويات، غارقة في الجليد أو المبردة حتى الاستخدام).
    3. عملية النسيج في غضون 18-26 ساعة من وقت جمع لمنع تدهور الجيش الملكي النيبالي كبيرة.
      ملاحظة: اعتماداً على نظافة القطعة المعوية والتخزين، قد يكون ممكناً تمديد المهلة الزمنية المقترحة لدينا.
  2. تحضير جميع المواد اللازمة لجمع الأنسجة البشرية في وقت مبكر، كما هو مبين في هذا البروتوكول (انظر الجدول للمواد للحصول على معلومات أكثر تفصيلاً المنتج). تأكد من أن كافة المطلوبة يتم ارتداء معدات الحماية الشخصية في جميع الأوقات.
  3. إعداد دلاء الثلج الجاف جنبا إلى جنب مع ملاط ثلج الجاف كما هو مبين في الشكل 1.
    1. سحق الثلج الجاف ما يكفي لملء 4 دلاء الثلج دائرية القياسية ودلو الجليد مستطيل واحد. يجب أن يكون واحد من الدلاء القياسية المختبرات الصغيرة (11 × 21 سم) الأنسجة وضعت على سطح الجليد الجاف. إذا كان ذلك ممكناً، استخدام صناديق جديدة، ولم يتم فتحها من مختبر الأنسجة.
    2. جعل من ملاط ثلج الجاف بووديريزينج L 2 الثلج الجاف في دلو الجليد نظيفة مستطيلة.
    3. إضافة 2 ميغا بايت قبل مبردة تصل إلى سطح الجليد الجاف. قليلاً خلط وتسطيح الملاط استخدام غطاء مربع تلميح ماصة لسطح الشكل الطين إلى قناة محاط بقطعة أكبر من الثلج الجاف على طول جانبي دلو مستطيلة.
    4. مكان عدة كتل الجليد الجاف على طول حواف دلو الجليد رقيقة لتشجيع تجميد أكثر سرعة. وينبغي أن يكون هناك مجال لقوالب قاعدة إيه فور لتناسب فضفاضة في دلو الملاط الثلج الجاف في وقت معين.
      1. بشكل اختياري، شغل المكدس دلو الجليد داخل دلو الجليد مستطيل آخر ¼ مع الثلج الجاف. هذه المواقع تساعد على عزل أفضل الملاط الثلج الجاف ويحول دون الحاجة إلى إجراء تعديلات متكررة من الثلج الجاف و 2 ميغا بايت أثناء الإجراء.
    5. ضع دلاء الثلج الجاف في خط تجميع حسب الترتيب التالي: 1) الثلج الجاف دلو ملاط، 2) مختبر دلو الجليد الجاف الأنسجة، 3 و 4) العادي دلاء الثلج الجاف، دلو الثلج الجاف 5) مستطيلة الشكل (الشكل 1أ).

2-إعداد الأنسجة المعوية البشرية المجمدة فلاش

ملاحظة: يمكن أن تأخذ هذه العملية برمتها بين 45-80 دقيقة لكل قطعة الأمعاء، اعتماداً على نوعية الأنسجة المعوية. نوصي أيضا بجمع عينات مراقبة الجودة لتقييم نوعية الجيش الملكي النيبالي وعلم الأنسجة قبل المتابعة مع LCM.

  1. ملء علبة كبيرة مع الجليد الرطب وألواح التقطيع الجراحي فوق الجليد الجاف.
  2. في هذا الإعداد، تشيل قنينة 500 مل و 100 مل لتخزين الأنسجة والأجزاء المشذبة في حل التخزين البارد. قوالب قاعدة قبل البرد في مجالس القطع بحيث تكون مستعدة لتلقي الأنسجة.
  3. عند استلام الأنسجة المعوية جديدة، من أجل إيقاف الوسائط التي يتم نقل الأنسجة والاحتفاظ به في قنينة مبردة مسبقاً. ترك بعض الغرف في هذه الأكواب لتخزين مؤقت للأنسجة المعوية والأجزاء المشذبة، التي سيتم إعدادها في الخطوات اللاحقة.
  4. قص الجزء المعوية بطول 20 سم تقريبا، التي تنص على الأنسجة وافرة (40-60 سم2) لتوليد الحمض النووي الريبي للتطبيقات المصب وعينات مراقبة الجودة. اعتماداً على سلامة النسيج، قد يكون مجديا لإنجاز عزل الحمض النووي الريبي للتجهيز النهائي بطول أصغر بكثير (أي 5 سم الأمعاء).
  5. تقليم بعيداً الدهنية والنسيج الضام من الأمعاء باستخدام مقص جراحي. بقايا الدهنية على طول سيروسا المعوية ينال من قدرة على كامل تسطيح النسيج في الخطوات اللاحقة. تقليم الأنسجة، تفاديا نيكينج سيروسا أثناء إزالة الدهون والنسيج الضام، الذي يمكن أن تلف الضفيرة myenteric هيكلياً أو جعل السطح الخارجي للأنسجة تسطيح غير متكافئ لتقطيع بعناية.
  6. إجراء شق طولي على طول العينة المعوية، يفضل أن تكون في موقع مرفق المساريقي العلوي.
  7. تشريح بعيداً وتجاهل القولونية تنيا من القولون، ذلك لأنه يقوم بتسوية أكثر سهولة، بعد الإفراج عنه من التوتر.
  8. تباعد الجانب الغشاء المخاطي للامعاء إلى أسفل على قطع مثلجة مجلس وقطع 1.25 سم المنظومة الشرائط من طول كامل من الأنسجة.
    ملاحظة: توسع الأنسجة المعوية غالباً ما بعد التشذيب، حيث ينبغي تعديل هذا الحجم تبعاً لذلك.
  9. مؤقتاً تخزين الشرائط في حل تخزين الأنسجة المبردة.
    ملاحظة: نحن نستخدم UW بلزر الحل التخزين البارد لأنها حياة طويلة الجرف، وفعالة من حيث التكلفة نسبيا ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى حاجة.
  10. إزالة من قطاع أنسجة من الحل التخزين البارد وقطع عليه في قطاعات ~1.5-2 سم طويلة.
  11. لطخة قطاعات الأمعاء في كومة من المسحات المختبرية، لإزالة السائل الزائد ومنع تشكيل بلورات الثلج على طول سيروسا المعوية خلال فلاش-تجميد بسرعة. إذا هو لم يجف النسيج بما فيه الكفاية، سيكون من الصعب الحصول على مقاطع عالية الجودة من الضفيرة مينتيريك.
  12. يكمن الجانب الغشاء المخاطي لمسح القطع المعوية إلى مبردة مسبقاً، وكبير، والمتاح بلاستيكية قاعدة العفن (37 مم × 24 مم × 5 مم).
  13. عناية تسطيح كل قطعة باستخفاف تمتد الأنسجة سطح القالب الأساسي واستخدام الملقط منحنية بلطف اضغط لأسفل وطرد أي فقاعات الهواء التي قد حوصروا تحت سيروسا. علما بأن يوسع الأنسجة أثناء التسوية. إذا لزم الأمر، تقليم الأجزاء وقطع العينات المتبقية في حجم أصغر.
    ملاحظة: إذا كانت الأنسجة طاقتها، وهذا سوف يشوه الضفيرة مينتيريك. بعد أن تتم إزالة جميع فقاعات الهواء، تقييم سمك العينة قبل التجميد. إذا لزم الأمر، دفع الحواف من الداخل العينة حتى تقترب العينة المعوية سمك الأصلي.
  14. ضع القالب قاعدة محملة على سطح الجليد الجاف، ملاط 2 ميغا بايت. ينبغي تجميد الأنسجة تماما خلال 30-60 ثانية، اعتماداً على حجم وسمك الجزء المعوية.
  15. الجاف للجزء السفلي من القالب الأساسي لإزالة 2 ميغا بايت المتبقية بسرعة فرك العفن قاعدة في مختبر الأنسجة مبردة مسبقاً في دلو الثانية من الثلج الجاف.
  16. نقل العينة المجففة إلى الحوض الثالث من الثلج الجاف، ودفنها تحت سطح الجليد الجاف حتى أنها مستعدة لأن تكون ملفوفة.
  17. مراقبة الجزء السفلي من القالب الأساسي قبل الالتفاف، لدراسة النوعية لإعداد نموذج بسرعة. جعل علما بأي عينات لا تظهر مسطحة أو يكون فقاعات الهواء الكبيرة، كما ينبغي تجنب هذه كريوسيكتيونينج و LCM.
  18. لف العينة في رقائق الألومنيوم المسمى مسبقاً التي وضعت فوق الثلج الجاف في دلو من حيث أنه يحدث التفاف أنسجة بينما يجري أبقى مجمدة تماما.
  19. لف عينة بطبقة من البلاستيك، للتقليل من جفاف الأنسجة أثناء التخزين في-80 درجة مئوية.
  20. تخزين العينات في دلو مستطيلة حتى تكون جاهزة لنقلها إلى الثلاجة.
  21. قبل التسمية وقبل chill مربعات المجمد في-80 درجة مئوية للتخزين المباشر لعينات بعد جمع.
  22. أخذ جزء صغير من الأنسجة من كل قطعة الأمعاء لتقييم سلامة الحمض النووي الريبي قبل إجراء LCM.
    1. قبل تسمية أنبوب رناسي خالية 2 مل لكل قطعة، مليئة إيه فايف زيرو زيرو ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت. ونحن نوصي باستخدام أدوات استخراج الحمض النووي الريبي "د"، المدرجة في الجدول للمواد.
    2. مجانسة قطعة صغيرة (2 × 2 مم) من الأمعاء في أنسجة قياسية البالغة الصغر-الخالطون (20-40 ثانية، حتى تبقى لا قطع الأنسجة). ثم، فورا بتجميد الجيش الملكي النيبالي على الثلج الجاف ومخزن في-80 درجة مئوية حتى الشروع في استخراج الحمض النووي الريبي.
    3. بشكل اختياري، تضمين بعض الفروع في الأنسجة المتوسطة التجميد (ينص) كنسخة احتياطية. إعداد مقاطع الأنسجة في الضبط بنفس الطريقة الموضحة في هذا القسم، ولكن غمر العينات في ينص ضمن القالب الأساسي قبل تجميد فلاش.

3-كريوسيكتيونينج

  1. قبل كريوسيكتيونينج، إعداد جميع المواد اللازمة لتلوين والجفاف ونقل عينات الأنسجة المرجوة من الثلاجة-80 درجة مئوية في دلو من الجليد الجاف.
  2. إعداد كريوستات لاستخدام الإعداد الأمثل خفض درجة حرارة (-18 إلى-22 درجة مئوية) ومسح أسفل الأسطح مع الإيثانول 100% وعلاج الشفرة وفرشاة صينية مع رناسي إزالة التلوث الحل.
  3. أفضل التقيد العينة لتشاك، استخدام الطريقة التالية.
    1. ضع الملقط في الثلج الجاف لمالا يقل عن 30 ثانية قبل إزالة التغليف العينة المعوية ووضعها على سطح الجليد الجاف serosa-الجانب-متابعة.
    2. صب التلة 3-5 مم من الأنسجة المتوسطة التجميد (ينص) على حامل عينات كريوستات كبيرة ونقل على الفور عينة المعوية serosa-الجانب الهاتفي على ينص.
    3. بسرعة نقل صاحب العينة للثلج الجاف، وتغطي مع الثلج الجاف بووديريزيد بعد السماح لينص على التمسك بالعينة s 2-5 في درجة حرارة الغرفة. ضمان بقاء ينص أسفل طائرة الضفيرة مينتيريك.
      ملاحظة: من الناحية المثالية، على السطح الخارجي للغشاء المخاطي للامعاء سوف يتقيد تقيدا تاما ينص قبل أن يبدأ ينص تجميد دون ذوبان الجليد من العينة.
  4. جبل صاحب العينة في الرأس كريوستات عينة ومحاذاة العينة مع بليد كريوستات، حيث لا تكون موازية لشفرة قطع طائرة الضفيرة مينتيريك.
  5. تعيين سمك تقطيع كريوستات إلى 8 ميكرون. والغرض من محاذاة تماما العينة الحصول على مساحة ممكنة أعظم الضفيرة مينتيريك على كل شريحة. هذا السمك ينصح عموما للأنسجة البشرية والقوارض، ولكن يمكن تعديلها حسب الحاجة.
  6. قسم من خلال سيروسا وعضلة طولانية حتى وصلت إلى ضفيرة مينتيريك.
    1. لتحديد موقع الضفيرة myenteric، تحميل مقطع عينة إلى شريحة ووصمة عار المقطع مع صبغ مائي، مثل 1% كريسيل البنفسجي أو الأزرق تولويدين، إلخ.
    2. قم بعرض المقطع تحت مجهر خفيفة في 40-2000 X التكبير التعرف على مفترق الطرق بين طبقات العضلات الطولية والدائرية. معلمات مجهر ترد في الجدول للمواد. في بداية تمزيقها، سيتم وضع علامة سيروسا بسبب وجود النسيج الضام. قد تكون بعض الدهون المساريقي العلوي المتبقية الحالية على طول سيروسا أيضا. ثم يبدأ ورقة من طبقة العضلات الطولية الخارجي. حالما يتم التوصل إلى الحدود بين طبقات العضلات الطولية والدائرية، سيجري الاحتفال بجزء من العقد المعوية.
      ملاحظة: في عدة أقسام القادمة، سوف تصبح الضفيرة myenteric واضح جداً، مع مساحات كبيرة من ganglia موجودة داخل قسم واحد (الشكل 2-ج). إذا لم يكن الأنسجة مسطحة تماما في بداية تمزيقها، ثم جزء فقط من العقد ستكون موجودة في كل قسم في وقت معين. في بعض الأحيان، قد عينة المعوية ضفيرة myenteric طبيعتها متفاوتة، على الرغم من الأنسجة التي تظهر مسطحة تماما. وهذا ينطبق بشكل خاص لعينات العفج. في تجربتنا، هذه العينات يمكن أن يستغرق وقتاً أطول لمعالجة مع LCM، بل يكفي الجيش الملكي النيبالي يمكن جمعها ضمن الدورة ليوم واحد. الموقع الدقيق الضفيرة مينتيريك يمكن أن تختلف اختلافاً كبيرا بين العينات، استناداً إلى الأنسجة والتحضير له قبل التجميد.
  7. البدء في جمع مقاطع المسلسل ل LCM، مع مجموعات المثلى توفير أكبر عدد من الخلايا العصبية وإطلاق كل شريحة. اعتماداً على المساحة السطحية للعينة، ويمكن الجمع بين عدة مقاطع إلى شريحة قلم-غشاء مفرد.
  8. تحميل المقاطع على الشرائح غشاء القلم، مبردة بإيجاز في كريوستات ل s 5-10. عند تركيب، ينبغي أن تذوب الأنسجة إلا قليلاً، أقصى الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي.

4-التلوين

ملاحظة: للمحة عامة عن عملية المصبوغة، الرجوع إلى الجدول 1. تعد جميع الحلول المستخدمة في قارورة مخروطية 50 مل القياسية. علاج خارج الأنابيب مع رناسي إزالة التلوث الحل لا يبدو أن تحسين النتائج (البيانات لا تظهر).

  1. تعد حلاً مشبعة من 4% كريسيل البنفسجي في الإيثانول 95% على الأقل يوم واحد في وقت مبكر، وإعادة تعليق البنفسجي كريسيل قبل تحميل المحاقن بشكل كامل.
    ملاحظة: قد تحتاج تركيز الإيثانول تخفيضها لتلطيخ فعال، كما هو موضح في جزء المناقشة. ونحن لم اختبر ما إذا كان استخدام الإيثانول 50% أو 75% خلال تلطيخ كبير يقلل من سلامة الحمض النووي الريبي. كريسيل البنفسجي هو حساسة للضوء، وهكذا ينبغي أن تكون محمية من الضوء.
  2. بعد تركيب أبواب الضفيرة myenteric على الشريحة، تغرق فورا الشريحة في قنينة مخروطية من الإيثانول 95% (مبردة مسبقاً في-20 درجة مئوية) لمدة 30 ثانية.
    1. إذا لم تتقيد الأقسام تماما الشريحة في الخطوة السابقة، قليلاً دافئ أسفل الشريحة مع القفاز يد (مسح مختبرات ينبغي وضعها في الفترات الفاصلة بين الشريحة والقفازات)، للتقيد الكامل قبل غمر في الإيثانول 95%. يمكن إعادة استخدام الشرائح على الأقل 3-6 هذا الحل دون الحد من سلامة الحمض النووي الريبي.
  3. وضع الوجه شرائح لأعلى على مسح مختبر توضع فوق حاوية قبل المعالجة، وخالية من رناسي8.
  4. قبل ملء المحاقن 3 مل مع 4% كريسيل البنفسجي وإرفاق عامل تصفية حقنه 0.2 ميكرون.
    ملاحظة: ونحن نوصي مرشحات خلات السليولوز.
  5. ضع 6-10 قطرات وصمة مباشرة على أقسام الأنسجة8 واحتضان 10-30 ثانية، أو حتى صبغ كافية يتم الاحتفاظ بها عند إزالة الملون. بينما تلطيخ، بلطف تدوير الحاويات الشريحة باليد للتأكد من أن أقسام الأنسجة المغلفة بالتساوي مع وصمة عار.
  6. إزالة البقع من أجل إيقاف وصمة عار وعلى الفور الشريحة في قنينة إيثانول 75%. مرارا وتكرارا تغرق الشريحة حتى الصبغة الزائدة قد تسربت معظمها من خارج العينة. هذا قد يستغرق ما بين 10-20 ثانية.
  7. وضع الصيغة النهائية لإزالة تلطيخ بها مرارا وتكرارا الغمس العينة في قنينة إيثانول 95% للعينة 10 س. سوبميرجي مرارا وتكرارا حتى إزالة وصمة عار الزائدة جميع.
    1. تعديل مدة ديستينينج، حسب الاقتضاء، لتحسين تلطيخ ganglia. إذا تمت إزالة وصمة عار الكثير، العينة يصبح شفافاً جداً، وقد يكون من الصعب تصور
      ملاحظة: قد الأمثل هذا البروتوكول المصبوغة استناداً إلى عدة منشورات5،،من810،11 الذي يحتاج إلى تعديل قبل أن تم الحصول على نتائج مرضية. ولذلك، ينبغي تعديل تركيز الإيثانول المستخدمة في الصبغ وأثناء عملية ديستينينج، عند الضرورة، الحصول على نتائج أفضل.

5-الجفاف

  1. فورا وتراجع الشريحة في الإيثانول 100% 2-3 مرات، لمجموعة من 10-20 ثانية.
  2. غمر الشريحة في الإيثانول 100% لا مائي لمالا يقل عن 30 ثانية. كما الإيثانول اللامائى بلورات جداً، إضافة الجزيئية ثقب سيتا (8-12 شبكة) إلى قنينة الإيثانول 100% قبل بدء الإجراء إزالة أي ماء استيعابها وهكذا يذوي أكمل نموذج5.
  3. مرارا وتكرارا وتراجع الشريحة في زيلين نفط عن 15-20 ثانية. هذه الخطوة تماما يزيل طبقة الإيثانول على الشريحة. إضافة ثقب سيتا الجزيئي قبل الموعد المحدد لهذه الأنابيب من زيلين نفط، الكامل الجسميات جزيئات الإيثانول والمياه الزائدة5.
    تنبيه: والزيلين تصنف على أنها مصدر إزعاج للعيون والجهاز التنفسي العلوي، وينبغي أن تستخدم في غطاء الأبخرة كيميائية.
  4. غمر الشريحة في زيلين نفط (مع ثقب سيتا الجزيئية، مش 8-12) لمدة 10 دقيقة على الأقل.
    ملاحظة: يمكن أخذ استراحة قصيرة بعد هذه الخطوة، إذا لزم الأمر. يمكن أن يترك العينات في زيلين نفط لمدة 4-5 ساعات دون الآثار الضارة لتلطيخ، العائد/السلامة LCM أو الجيش الملكي النيبالي.
  5. اختيارياً، وعلى حدة بإعداد عدة شرائح إضافية في هذه المرحلة. إذا كان إعداد جولة ثانية من الشرائح بعد إكمال LCM على كافة الشرائح المعدة، قد تحتاج الأنسجة في كريوستات إلى ريفاسيد، بسبب جفاف سطح الأنسجة. واحد إلى أربعة أقسام قد تحتاج إلى تجاهل قبل يمكن جمعها بأقسام قابلة للاستخدام.

6-ليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM)

  1. إزالة الشريحة من زيلين نفط وأيردري في غطاء الأبخرة كيميائية على الأقل 1 دقيقة إدراج خرطوشة من قبعات LCM إلى مرحلة مجهر LCM. تحميل الشريحة على خشبة المسرح، والحصول على صورة عامة للشريحة.
  2. تحديد الموقع الذي تريده ل LCM وتحميل قبعة على الشريحة.
  3. محاذاة ليزر الأشعة تحت الحمراء (IR) وضبط السلطة والمدة جعل قطرها 20-30 ميكرون القبض على الفور.
  4. موقع الليزر الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) وتعيين سرعة القطع المناسبة وكثافة.
  5. مخطط ganglia المطلوب يتم جمعها باستخدام البرمجيات LCM، مع التأكد من البقاء داخل حدود منطقة التحصيل على الغطاء (يصور في الشريحة نظرة عامة للبرنامج كدائرة خضراء).
  6. في كل من الآثار، ضبط البقع الأشعة تحت الحمراء أن هناك على الأقل واحد الأشعة تحت الحمراء بقعة كل 100-500 ميكرون.
  7. اضغط على الزر قص الأشعة تحت الحمراء للأشعة فوق البنفسجية المضي في جمع كافة العقد ملحوظ.
  8. بمجرد الانتهاء من المجموعات، أما نقل الحد الأقصى إلى موقع جديد وكرر عملية جمع أو دراسة الغطاء LCM في محطة مراقبة الجودة بمجرد الغطاء مليء بما فيه الكفاية مع ganglia (أو حتى يتم التوصل إلى الحد الزمني الموصى به من 60 إلى 80 دقيقة).
  9. إذا كان الحطام موجودة على الغطاء، يمسح بعيداً باستخدام الرسام الجميلة ذات الرؤوس تم قبل التعامل مع الحل إزالة التلوث رناسي، وشطفها بماء خال من نوكلاس، وتجفيفها تماما.
  10. بعناية دراسة الغطاء بالعين المجردة أو بالتكبير تحت مجهر حقل مشرق لضمان جميع الأنقاض قد أزيلت. إذا كان لا يمكن إزالة الأنقاض من خلال استخدام الرسام قبل المعالجة، ثم استخدام تلميح ماصة غرامة (رناسي الحرة) إلى كشط بعيداً من تحت الأنقاض.
  11. تأمين الحد الأقصى على مل 0.5 [ميكروفوج] أنابيب مليئة ميليلتر 230 من المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي (RLT المخزن المؤقت من أدوات استخراج الحمض النووي الريبي "ب"، مع β-mercaptoethanol إضافتها بتركيز 10 ميليلتر/مل).
  12. عكس كاب، بإيجاز ودوامه، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  13. الطرد المركزي في ≥ 5,000 س ز ل 5 دقيقة ونقل بعد ذلك [ميكروفوج] أنابيب للجليد الجاف.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. ويمكن تخزين ليساتيس الجيش الملكي النيبالي في-80 درجة مئوية دون تأثير كبير على تدهور الجيش الملكي النيبالي لمدة أسبوع واحد على الأقل. إذا كان يتم إجراء عزل الحمض النووي الريبي في نفس اليوم، ثم البرد العينات على الجليد حتى أنهم مستعدون للاستخراج.
  14. أداء كافة مجموعات إضافية ضمن المهلة الزمنية القصوى الموصى بها من 80-90 دقيقة بعد إزالة الشريحة من زيلين نفط. كما تتعرض الأجزاء المجففة للرطوبة المحيطة، رنسيس يمكن تدريجيا تصبح تنشيط. قصر فترة التجميع يمكن التقليل من تلك الآثار وأقصى المحافظة على سلامة الحمض النووي الريبي.

7. عزل الحمض النووي الريبي

  1. تعد محطة خالية من رناسي لاستخراج الحمض النووي الريبي.
  2. إعداد جميع الأنابيب والمواد الكاشفة وفقا للدليل "الطقم استخراج الحمض النووي الريبي".
    ملاحظة: في حين تتوفر مجموعات كثيرة لعزل الحمض النووي الريبي عقب LCM، حققنا نجاحا أفضل استخدام أدوات استخراج الحمض النووي الريبي "ب"، المدرجة في قائمة المواد. انظر الشكل 5 مقارنة جنبا بجنب الكواشف استخراج الحمض النووي الريبي.
  3. إزالة عينات من الثلاجة-80 درجة مئوية وسرعة ذوبان الجليد في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  4. فورا إذابة دوامة عينات ل s 2-3 توزيع أملاح ثيوسيانات جوانيدينيوم بالتساوي.
  5. الجمع بين كل عينة مع حجم متساوية من الإيثانول 70%. تجمع ليساتيس 2 أو أكثر معا، إذا لزم الأمر، للوصول إلى تركيز الحمض النووي الريبي كاف.
  6. المضي قدما وفقا لإرشادات الشركة المصنعة في كتيب لعملية استخراج الحمض النووي الريبي، استخدام بروتوكول الأمثل للعينات ميكروديسيكتيد.
  7. الوت الجيش الملكي النيبالي في الخطوة الأخيرة في حجم الحد الأدنى الموصى به المياه خالية من نوكلاس (14 ميليلتر).
  8. بعد عزل الحمض النووي الريبي، الكوة 1-2 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي من كل عينة إلى جديدة قبل المسمى أنبوب رناسي خالية لتقييم نوعية/الجودة مع جهاز ميكروفلويديكس التي يمكن تصور كميات صغيرة من الجيش الملكي النيبالي، مثل بيواناليزير. قاسمة ميليلتر 1 إضافية في أنبوب مستقل للقياس الكمي مع مجموعة أدوات القياس الكمي الحمض النووي الريبي حساسية عالية.
    1. ضبط هذه الخطوات، حسب الحاجة، للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي لتحليل المتلقين للمعلومات (أي.، تجمع عدد أكبر من قبعات LCM قبل استخراج الحمض النووي الريبي).
  9. الجيش الملكي النيبالي مخزن في-80 درجة مئوية حتى جمع العينات كافية لتحليل المتلقين للمعلومات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ونحن قد أدخلت عدة تحسينات على البروتوكولات القائمة التي تمكن من جمع السريع نسبيا من ganglia المعوي من عينات الأمعاء البشرية باستخدام LCM، الوفاء بالمعايير لما يليها الحمض النووي الريبي أولاً، نحن الأمثل التجميد السريع لشرائح الأنسجة المعوية في قوالب قاعدة كبيرة وضعت على سطح من الطين ثلج الجاف في 2 ميغا بايت (الشكل 1ب). تم الحصول على نجاح أفضل أثناء كريوسيكتيونينج و LCM اللاحقة بزرع شرائح المعوية شقة داخل قاعدة العفن، تواجه الغشاء المخاطي-الجانب الأعلى (الأرقام 1-1 ج). التأكد من وجود قوالب قاعدة مسطحة قدر الإمكان في القاعدة، كما أي انحناء سوف تجعل من الصعب أكثر بكثير للحصول على شريحة كبيرة من الضفيرة myenteric. ويؤدي هذا النهج الأنسجة هو مقطوع بسهولة في سمك 8-ميكرومتر (الشكل 1ﻫ) ويسمح للقضاء التام على ينص من عملية المصبوغة. وجدنا أن ينص يتداخل مع عملية المصبوغة وهكذا يحجب تحديد ganglia المعوي. وضع الأنسجة في هذا الاتجاه كما يتجنب تمزيقها من خلال الغشاء المخاطي، الذي يحتوي على نسبة عالية من رنسيس12، على الرغم من أن من تجربتنا، ويبدو أن استخدام البقع ethanolic يعوق إلى حد كبير هذه رنسيس. في الحالات حيث ينص أو درجة الحرارة المثلى من القطع المتوسطة (OCT) المسبق، ووجدنا أنه من الأكثر موثوقية تسطيح العينة في الجزء السفلي من القالب الأساسي أولاً ثم قم بإضافة ينص على القالب بعد هذه الخطوة (الشكل 1د). وهذا يترك "نافذة" الذي الأمعاء يمكن تصور بسهولة، مما يجعل من السهل لمحاذاة العينة وإنتاج المقاطع التي موازية تماما الضفيرة myenteric (الشكل 1ﻫ).

إعداد كريوسيكشنز طوليا أسفل طول الأمعاء في اتجاه مواز الضفيرة myenteric (الشكل 2ألف)، ينشئ الأقسام التي مرئية أكبر مجال ganglia المعوي كل شريحة على تلطيخ ( الشكل 2 ج)-عندما تقترب الضفيرة myenteric (الشكل 2ج)، في ترخيصات لطبقات العضلات الطولية والدائرية (الشكل 2ب)، يمكن أن تكون مقاطع المسلسل 6-12 المجمعة (الشكل 2ألف، الطولي) التي تحتوي على مساحات كبيرة من ganglia المعوي (الشكل 2-ج). يمكن تحميل قبعات LCM للقدرات باستخدام مقطع واحد (الشكل 4د). وفي المقابل، عند إعداد مقاطع عرضية من الأمعاء المجمدة الطازجة (الأرقام 2 ألف-2)، هناك فقط منطقة صغيرة من الضفيرة myenteric موجودة على كل شريحة (الشكل 2ب). ويمكن جمع ganglia المعوي عدد قليل جداً من مقاطع عرضية الأنسجة، مما أدى إلى زيادة الوقت المستثمر وارتفاع تكلفة العينة الإجمالية. النهج تمزيقها التوازي الذي يستخدم أقل من خمس عدد LCM قبعات والشرائح بالمقارنة مع مقاطع عرضية ويتسارع بشكل كبير عملية جمع.

قبل LCM، يجب الملون عينات ونزعت تماما لتجنب النشاط رناسي أثناء جمع LCM. لقد قمنا بتصميم تجربة لمقارنة مباشرة أثر البقع المائية مقابل البقع اثانوليك على سلامة الحمض النووي الريبي. في هذه التجربة، قسمين المعوية قد شنت معا على شريحة واحدة، وتم تجهيزها بإحدى الطرق الأربعة، مع n = 2-3 replicates البيولوجية كل مجموعة. في المجموعة الأولى، لم تم تحميل المقاطع المعوية الطازجة إلى شريحة وكل نقلت مباشرة إلى المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي استخدام الملقط خالية رناسي قبل مبردة على الثلج الجاف (الشكل 3أ). لجميع الفئات المتبقية، المقاطع كانت انضمت إلى شريحة والمجهزة وكشط قبالة من الشريحة باستخدام شفرة حلاقة المعالجة بحل رناسي إزالة تلوث ونقلها إلى المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي بالملقط رناسي خالية. قياسية البالغة الصغر-الخالطون استخدمت بالكامل العينات في جميع الفئات. في المجموعة الثانية، تم تجهيز الشرائح من خلال جميع الخطوات، ولكن تم استخدام لا صبغة أثناء الإجراء المصبوغة (الشكل 3ب). تمت معالجة ثلاثة المجموعة مع البروتوكول الموصوفة أعلاه، باستخدام صبغة كريسيل البنفسجي 4% (الشكل 3ج). في المجموعة الرابعة، واستخدمت وصمة عار مائي، تولويدين الأزرق، بينما يتبع البروتوكول لطقم المصبوغة على أساس مائي استخدام خليط من الأزرق تولويدين وتوضع (الشكل 3د). بعد استخراج الحمض النووي الريبي، كما هو موضح، قيمت جودة الجيش الملكي النيبالي مع بيواناليزير. وكان الفرق الوحيد بين مائي و ethanolic تلطيخ بروتوكولات إضافة اثنين المياه إينكوبيشنز (30 ثانية كل)، مباشرة قبل وبعد التلوين، وهي مطلوبة من أجل امتصاص والاحتفاظ بالصبغة. كذلك وجدنا أن عملية الانضمام أقسام الأنسجة إلى الشريحة وتجهيز مع الخطوات الجفاف أدت إلى انخفاض طفيف، أمرا لا مفر منه من نوعية الجيش الملكي النيبالي (الأرقام 3 ألف-3 (ب))، ولكن أن تلطيخ مع صبغ ethanolic، كريسيل البنفسجي، لا يقلل من جودة الحمض النووي الريبي (الشكل 3ج). وفي المقابل، صبغ مائي، أزرق تولويدين، أدت إلى تدهور الجيش الملكي النيبالي كبيرة، احتمالاً بسبب التعرض مائي لمدة طويلة تسمح بنشاط رناسي الذاتية (الشكل 3د).

الأشكال الفريدة من العقد المعوية تسبب صعوبات للأشعة تحت الحمراء-LCM القياسية مع الشرائح الزجاجية التقليدية6 (الشكل 4أ). عند استخدام القلم-غشاء الشرائح (الشكل 4ب)، عينات التقيد بورقة رقيقة يتم فصل من أغلبية الشريحة الزجاجية. الليزر الأشعة فوق البنفسجية يخترق كل عينة والغشاء القلم، أسفر عن كتيبة كاملة من العقد من الشريحة (الشكل 4ج) والتقيد الكامل بغطاء LCM (الشكل 4د). المطلوب هياكل أي الحجم والشكل (> 10-15 ميكرون) يمكن أن يكون تماما وعلى وجه التحديد التي تم جمعها (4E-4 ح فيجوريد). لبعض العينات مع ganglia أقل كل قسم، الحد الأقصى قد يكون ≥ انتقلت أربع مرات قبل جمع. وفي هذه الحالة، تركيب اثنين إلى ثلاثة أقسام كل شريحة يقلل استخدام الشرائح غشاء القلم.

عند عزل الحمض النووي الريبي من عينات LCM لتسلسل الحمض النووي الريبي، الهدف الحصول على أعلى جودة ممكنة من الجيش الملكي النيبالي، والكمية، والقضاء على كل الحمض النووي (جدنا). تحديد إجراء عزل الحمض النووي الريبي مثالية، أجرينا وجها لوجه مقارنة مع مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي "A" (الشكل 5ألف)، أدوات استخراج الحمض النووي الريبي "ب" (الشكل 5ب)، أو طريقة استخراج الحمض النووي الريبي "ج" بتنظيف عينات الحمض النووي الريبي بأدوات استخراج الحمض النووي الريبي "ب" (الشكل 5ج). بعد معالجة العينات مع البنفسجي كريسيل الأمثل تلطيخ البروتوكول، استخدم LCM لجمع عينات دائرية موحدة (قطرها 500 ميكرومتر) من الأنسجة المعوية، مأخوذة من طبقة العضلات الطولية. وكان عشوائياً كل غطاء لكل مجموعة من المجموعات عزل الحمض النووي الريبي الثلاثة، التي توضع فوق 0.5 مل [ميكروفوج] أنابيب مملوءة مسبقاً بالمخزن المؤقت تحلل كل منهما من كل مجموعة. اتبعت التعليمات بالضبط كما هو موضح لكل مجموعة، مع أدوات استخراج الحمض النووي الريبي "" المخزن مؤقت لتحلل تتطلب الحضانة في 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. مجموعات أخرى، استخدمت حضانة درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وكانت جميع العينات بإيجاز فورتيكسيد عليها، بالإضافة إلى تحلل المخزن المؤقت. ثم كانت مبردة عينات حتى أجريت عمليات الاستخراج في نفس اليوم على الجليد (n = 4). وجدنا أن عدة استخراج الحمض النووي الريبي "ب" مع خطوة هضم الحمض النووي في عمود أدت إلى أعلى الجيش الملكي النيبالي نوعية وكمية وفعالية القضاء على جدنا (الأرقام 5A-5 ج). الأهم من ذلك، تحلل الحمض النووي الريبي المخزن المؤقت المقدمة من مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي الريبي "ب" الكامل lyses ganglia تم التقاطها عند جمع ganglia المعوي (الشكل 5د).

في المتوسط، يكون لدينا عينات رين ± 7.49 0.53 (الجدول 2). عشرات رين أكبر من 6-7 تعتبر ذات نوعية كافية لتسلسل الحمض النووي الريبي (اعتماداً على تعريف الحمض النووي الريبي معين)13، منحنا الثقة أن لدينا عينات ذات جودة كافية للجيش الملكي النيبالي-يليها النظر أن رين لهذه العينات، وعند تلقي، وقد تراوحت من 7.4 إلى 9.5، تشير هذه النتائج إلى أن لدينا بروتوكول الأمثل يوفر الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي ممتازة. ويرد الجيش الملكي النيبالي الممثل جودة النتائج من العينات المقدمة لتسلسل الحمض النووي الريبي في الأرقام 6A-6 ج. النتائج من تسلسل الحمض النووي الريبي تثبت أن لدينا عينات التسلسل بنجاح، ولديها تحيز متواضعة 3 '-نهاية (الشكل 6د). عموما، هو يفضل أكبر 3 '--تحيز في عينات مع انخفاض رين14؛ وينعكس هذا التأثير معتدلاً في لدينا عينات. وعلى الرغم من هذا، كانت المتعايشة الجيني لوحظت يتسق إلى حد كبير بين جميع العينات (الشكل 6ه)، مما يشير إلى مدى موثوقية البيانات.

Figure 1
الشكل 1 . الأمثل تجميد الأنسجة المعوية. تعد دلاء الثلج الجاف (A) في النظام المبينة؛ أنا) ملاط الثلج الجاف، ثانيا) مختبر الأنسجة توضع فوق الثلج الجاف، دلو التخزين المؤقت الثالث)، دلو رابعا) التفاف، دلو تخزين الخامس) قبل التجميد، ودلو تجاوز سعة التخزين المجمد قبل السادس). (ب) ونحن الأمثل التجميد السريع لشرائح الأنسجة في قوالب قاعدة كبيرة وضعت على سطح الطين من الثلج الجاف و 2-ميثيلبوتاني. (ج) صورة أقرب إلى أعلى من عينة مجمدة تماما، لاحظ في الإعداد هو موضح في الفريق باء المعوية تزرع شرائح مسطحة في قالب قاعدة مواجهة الجانب الغشاء المخاطي. (د) هذا الأسلوب التجميد يمكن تكييفها بسهولة للاستخدام مع ينص بإعداد الأنسجة بنفس الطريقة، ولكن إضافة ينص على قاعدة العفن قبل تجميد. وسيكون العينة الناتجة من ضفيرة myenteric مسطحة تماما، مع سيروسا التي يمكن بسهولة تصور. (ه) إعداد الأنسجة كلا النهج إنتاج أقسام الأنسجة ممتازة في سمك 8-ميكرومتر الموصى بها. ويرد الإجراء باستخدام ينص هنا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . التوجه السليم للأنسجة المعوية توفر الأقسام الغنية في ganglia المعوي. عند إعداد المقاطع العرضية عرضية القياسية من الأمعاء المجمدة الطازجة (أ وب)، هناك فقط منطقة صغيرة من الضفيرة myenteric (ب) موجودة على كل شريحة. ويمكن جمع ganglia المعوي قليلة جداً كل شريحة، التي تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفا. وفي المقابل، إعداد مقاطع طولية في الطائرة من الضفيرة myenteric (ج)، يوفر مساحة سطحية أكبر كثيرا من العقد (ج). يتم الحصول على مقاطع من الضفيرة myenteric بدءاً serosa وتمزيقها إلى الداخل عن طريق عضلة طولانية (ب). عندما تقترب من الضفيرة myenteric، على مفترق الطرق لطبقة العضلات الطولية والدائرية (ب)، يمكن جمع مقاطع المسلسل 6-12. يحتوي كل مقطع طولي الضفيرة مينتيريك على مساحات كبيرة من ganglia المعوي (ممثلة في C، باستخدام إجراء المصبوغة معدلة، دون زيلين نفط، بشكل تفضيلي وصمة عار في ganglia). يمكن أن تملأ قبعات LCM للقدرات باستخدام مقطع واحد من أنسجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . تلطيخ مع صبغ المتوافقة مع الإيثانول تحسن نوعية الحمض النووي الريبي. وكان قياس نوعية الحمض النووي الريبي قبل بيواناليزير ويتم عرض نتائج تمثيلية لعينات اثنين من كل مجموعة. الأولى الجيش الملكي النيبالي الجودة تقاس من أقسام جديدة, صاعد (ألف، أي علاج)، كان عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) 8.65 ± 0.07. للمقاطع المركبة ومعالجتها من خلال جميع الخطوات، ولكن دون وصمة عار (ب)، كان رين 7.95 ± 0.35. عند التلوين مع البنفسجي كريسيل 4% إضافة إلى الخطوات الجفاف، كان هناك تأثير يذكر على رين، مع رين متوسط من 7.87 ± 0.35 (ج). وبالمقارنة، أسفر استخدام وصمة عار مائي، تولويدين الأزرق (تي--الأزرق) وإضافة يشطف المياه المطلوبة للإجراء (د) خفض إلى حد كبير نوعية الجيش الملكي النيبالي، مع رين من 6.45 ± 0.21. كل مجموعة تتكون من n = 3 replicates البيولوجي باستثناء "أي معاملة" و "T-Blue"(n=2). رطبها وترد هنا باعتباره يعني ± الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . القلم غشاء LCM الشرائح تمكين مجموعات محددة من ganglia المعوي. باستخدام شرائح المجهر الزجاج العادية لجمع ganglia المعوي عن طريق LCM يميل إلى تنتج في الأنسجة غير المرغوب فيها بيك آب (A). دوائر حمراء (30 ميكرومتر في القطر) تشير إلى حجم البقع LCM الأشعة تحت الحمراء المستخدمة أثناء عملية جمع. السهم الأبيض يشير إلى مجموعة العقدة التي سحبت قطعة من الأنسجة المجاورة موسكولاريس. مع الشرائح القلم-الغشاء (ب)، التقيد عينات إلى ورقة رقيقة يتم فصل من أغلبية الشريحة الزجاجية. عند قص بالليزر LCM الأشعة فوق البنفسجية، كلا من عينة والغشاء القلم هي شرائح، أسفر عن كتيبة كاملة من العقد من الشريحة، بغض النظر عن شكل العقدة (ج)، واستكمال الانضمام إلى كاب LCM عند إزالتها من العينة (د ). المطلوب هياكل من أي حجم وشكل إيه وان زيرو-15 ميكرون يمكن تماما والتي تم جمعها على وجه التحديد [(ه)، الأولى الأنسجة علامة المتابعة؛ (و) الأشعة تحت الحمراء والأشعة فوق البنفسجية بالليزر قطع الانتهاء؛ إزالة غطاء LCM (ز) من قسم] كما تصور في كاب LCM (ح). خلفية الأرقط في لوحة ح الملازمة لعملية النداء الموحد وليس الحطام غير مرغوب فيها. هي جزء من برنامج LCM مرمى دوائر خضراء زرقاء في ألواح ه-ح وهي العناصر النائبة لليزر الأشعة فوق البنفسجية والأشعة تحت الحمراء، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 . تحديد مجموعة مواد عزل الحمض النووي الريبي أمثل. وتظهر نتائج سلامة الحمض النووي الريبي بعد مقارنة متزامنة لثلاثة إجراءات عزل الحمض النووي الريبي مختلفة. يتم عرض قطعتي ممثل عن كل مجموعة لتوضيح التغير الذي يمكن أن يحدث بين العينات التي تتم معالجتها في نفس الوقت. طقم استخراج الحمض النووي الريبي "" (A) أنتجت عينات مع رين 6.83 ± 0.65 وتقدم معتدل الحمض النووي الريبي الغلال، وتميل إلى تلوث الحمض النووي، على الرغم من القيام هضم الدناز في عمود. أدوات استخراج الحمض النووي الريبي "ب" (ب) أسفرت عن رين يقاس أعلى، عند 8.3 ± 0.1. بينما "الأسلوب استخراج الحمض النووي الريبي" تستند الفينول "ج" (متبوعة بتنظيف عينات الحمض النووي الريبي مع أدوات استخراج الحمض النووي الريبي "ب") (ج) القضاء على جدنا على ما يبدو وكان رين ± 7.5 0.26، وكانت هناك تلويث العصابات، الذي قد يكون ناجماً عن ذوبان كبير البوليمر لاصقة من كاب LCM أثناء الخطوة تحلل الحمض النووي الريبي. علاوة على ذلك، كانت دائماً أقل من تلك التي حصل عليها طقم استخراج الحمض النووي الريبي "ب" غلة الجيش الملكي النيبالي من أدوات استخراج الحمض النووي الريبي "ألف" واستخراج أسلوب "ج". الأهم من ذلك، الجيش الملكي النيبالي تحلل المخزن المؤقت المقدمة من مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي الريبي "ب". (مع إضافة β-ميركابتوثانول) تماما ganglia تم التقاطها (د). كل مجموعة كانت n = 3 replicates البيولوجية ويرد هنا ما يعني ± انحراف معياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 . النتائج التمثيلية. عند تجميع قبعات اثنين من ganglia المعوي كل عينة، يمكننا الحصول على كميات كافية من الحمض النووي الريبي لتسلسل الحمض النووي الريبي (> 1 نانوغرام) جنبا إلى جنب مع نوعية ممتازة من الجيش الملكي النيبالي. ممثل الجيش الملكي النيبالي مؤامرات تظهر عينة مع رين 8.3 (A) و 7.5 (ب) 6.9 (ج). تم تشغيل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي عن طريق تشغيل في ر. (د) المؤامرة نهاية-تحيز يشير إلى أن العينات التي تم بنجاح تعيين تسلسل ولديها تحيز متواضعة 3 '-نهاية برامج تقييم الجودة. (ﻫ) وارسم biotype الجينات يمثل أيضا أن تسلسل النتائج تتوافق إلى حد كبير بين العينات. وفي المجموع، كان لدينا > نسبة النجاح 95% في توليد نماذج يمكن استخدامها لتسلسل الحمض النووي الريبي الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الخطوة المدة والغرض
إيثانول 95% (ج-20 س) 30 s التثبيت
4 في المائة كريسيل البنفسجي في الإيثانول 95% 10-30 ثانية وصمة عار
75 ٪ الإيثانول (مع غمس المتكررة) 15-25 ثانية إزالة وصمة عار
95% إيثانول (مع غمس المتكررة) 5-15 ثانية إزالة وصمة عار
100 ٪ إيثانول 15 s الجفاف
الإيثانول 100% (لا مائي) 30 s الجفاف
زيلين نفط (مع غمس المتكررة) 15-20 ثانية الجفاف
زيلين نفط > 10 دقيقة الجفاف
أيردري 1-3 دقيقة تبخر زيلين نفط

الجدول 1. تلوين ونظرة عامة حول بروتوكول الجفاف. هذا الجدول يبين لنا بروتوكول المصبوغة الأمثل. يمكن ملاحظة أن وصمة عار أي المتوافق مع الإيثانول ليحل محل كريسيل البنفسجي، إذا كانت يوفر نتائج أفضل. وفي بعض الحالات، ستحتاج المدد لتلطيخ وديستينينج إلى تمديد أو تقصير. وبشكل عام، يعد وقت التثبيت، أسرع الأنسجة سوف يكون كاملا الملون. غير أننا لاحظنا أي تخفيض في نزاهة الجيش الملكي النيبالي بعد إعادة استخدام قنينات تصل إلى 3 مرات عند إعداد الشرائح من نفس الجزء من الأنسجة.

الجهات المانحة الأنسجة رين
و القولون 7.1، 7.4، 7.2
M الدقاق 7.2، 6.9، 7.8
M العفج 8.2، 7.4، 7.7
الدقاق 7، 4، 7، 6، 7، 3
القولون 7.7، 7.8، 7.3
و العفج 7.1، 7.3، 6.9
الدقاق 7.8، 7.9، 7.6
القولون 7، 3، 8، 0، 7، 5
M الدقاق 6.9، 6.7، 6.9
القولون 6.8، 6، 4، 6، 6
M الدقاق 7.2، 7.3، 7.6
القولون 6.7، 7.6، 7.7
M الدقاق 8.3، 7.8، 7.4
القولون 7.0، 7.4، 7.0
و العفج 8.3، 8، 8، 8، 0
الدقاق 8.1, 8.0, 7.8
القولون 8، 4، 8، 6، 7، 1

الجدول 2. الجيش الملكي النيبالي الممثل نزاهة النتائج. العينات المعروضة في هذا الجدول كل انتزعت من ganglia المعوية البشرية. جميع العينات المختارة قد يكفي الجيش الملكي النيبالي النوعية والكمية لتحليل الحمض النووي الريبي seq. رين متوسط لجميع العينات المدرجة في هذا الجدول هي 7.49 ± 0.53. تم قياس تركيز الحمض النووي الريبي أيضا استخدام الإنزيم ريبوجرين ضليع في الرياضيات، أنها وقد اجتمع جميع العينات المعروضة في هذا الجدول الحد الأدنى الكمية المطلوبة لأن الجيش الملكي النيبالي-seq (> 1 نانوغرام) التجارب. ويمكن استخدام كميات أصغر، اعتماداً على الإجراء قبل التضخيم. بيد أن هذه الإجراءات أكثر موثوقية عند أحد يتوقع هناك إلى أن الاختلافات الكبيرة في التعبير الجيني بين العينات أو المجموعات التي تتم مقارنتها؛ وإلا يمكن أن تخفي هذه النتائج الاختلافات الحقيقية في بعض التطبيقات تسلسل الحمض النووي الريبي. ولذلك يوصي عموما بالبدء مع المزيد من المواد عندما يكون ذلك ممكناً.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتيح هذا الإجراء كفاءة جمع ganglia المعوية عديدة كمصدر استخلاص الحمض النووي الريبي لما يليها الحمض النووي الريبي هنا، نحن قد تسارعت العمليات الواردة في البروتوكولات القائمة مع أقصى الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. كما كافة الخطوات في هذا الإجراء مترابطة، من المهم أن القضاء على كافة القضايا من بداية الدراسة وأن جميع العينات على استعداد المثل لبعضها البعض قدر الإمكان، للحصول على الحمض النووي الريبي موثوقة-ما يليها

من بداية الإجراء، سلامة الحمض النووي الريبي يمكن أن تكون سلبي إذا كان الفاصل الزمني (الوقت الدماغية الباردة) بين مجموعة من الأنسجة في الوقت للتبرع بالأعضاء وتلقى الأنسجة للمعالجة في المختبر طويل جداً. ونظرا لهذا الشاغل، لقد فوجئنا بأن الجيش الملكي النيبالي عالية الجودة لا تزال يمكن أن تستخلص من عينات الأمعاء حتى بعد 24 ساعة من وقت السكتة الباردة. عندما تكون العينات المعوية مبردة وتخزينها بشكل صحيح في حل التخزين البارد، هناك حماية رائعة لسلامة الأنسجة ونوعية الجيش الملكي النيبالي. ونحن نطلب أن يتم مسح الأنسجة المعوية عند جمع فريق جمع الجهاز، للحد من تعرض الأمعاء للإنزيمات الهضمية ورنسيس والجزيئات الأخرى التي يمكن أن تؤثر على نوعية الجيش الملكي النيبالي خلال هذه الفترة. وقد وجدنا أن عندما لا يتم مسح العينة الأمعاء تماما، وهذا يمكن أن تقلل رين العينة.

استخدام لدينا الإجراء الأمثل لإعداد عينات الأنسجة المعوية، نحن قادرون على تجنب تضمين عينات في ينص. لأنه ينص يتفاعل مع الإيثانول وزيلين نفط لتشكيل متسرعا بني داكن الذي يتداخل مع تصور ganglia المعوي، نحن نفضل استبعاد أنه لدينا عينات. عند العمل مع الأنسجة المعوية من الفئران أو أنواع أخرى، ومع ذلك، قد لا يكون ممكناً استبعاد ينص. وفي هذه الحالة، ونحن قد جربت إزالة ينص من قسم التقيد بها على شريحة. إذا كان مساحة كافية للأنسجة، يمكن مقطر الإيثانول (مبردة في-20 درجة مئوية) على الشريحة مع ماصة نقل بسرعة إصلاح ينص، يسمح لها بإزالتها بالملقط. قطرات الإيثانول على الشرائح ويتجنب تراكم ينص داخل قنينة الإيثانول، التي يمكن أن تؤدي إلى تفاقم تأثير براوننج عندما يجري تجهيز شرائح متعددة.

خلال تجميد فلاش، أننا نفضل استخدام ملاط ثلج الجاف مع 2 ميغا بايت، بدلاً من الإيثانول 100%، نظراً لسهولة يتبخر 2 ميغا بايت عند الهبوط على سطح النسيج. الإيثانول يميل إلى أن تتبخر ببطء أكثر، لا سيما عندما جنبا إلى جنب مع ينص، تشكيل من حماة كيميائية على كتلة الأنسجة التي لا يمكن إزالتها بسهولة. الإيثانول و 2 ميغا بايت تميل إلى از وترشيش بشدة عند التجمد في حاويات تجميد الصغيرة، نظراً لصغر حجم الملاط الثلج الجاف له قدرة منخفضة حرارة النوعية. بدلاً من ذلك، استخدام دلو مستطيلة كبيرة مليئة بالثلج الجاف بووديريزيد يوفر كتلة تبريد كبيرة ويمنع التقلبات في درجات الحرارة في حين يتم تجميد الأنسجة.

كما ذكر، من الأسهل في بعض الأحيان للحصول على أوراق ganglia المعوي المستمر من بعض عينات الأنسجة بالنسبة للآخرين. ومن المفهوم أن يخضع سرعة الشامل LCM تقلب تبعاً لخصائص النسيج المصدر أو منطقة الأمعاء يتم أخذ عينات. ولهذا السبب، فمن الأفضل لإعداد العديد من العينات المجمدة الطازجة في مستهل عادة. وقد وجدنا عموما أن ما مجموعة 20 عينة كل مقطع من الأمعاء (~ 2 سم × 1.5 سم، كل) الآن أكثر من كافية لتوفير وافرة الحمض النووي الريبي للتطبيقات المتلقين للمعلومات. ومع ذلك، إلا إذا كان يتوفر طول صغيرة من الأنسجة المعوية، نوصي الحد أدنى لطول 5 سم. مع النهج الذي نتبعه، العائد الأدنى التي سيتم الحصول عليها سوف تتراوح بين 18-30 نانوغرام من الجيش الملكي النيبالي، كما يناقش أدناه. طول الحد الأدنى 5 سم يحتمل أن يخفض، اعتماداً على التطبيق، خاصة إذا استخدمت كميات أعلى من كدنا بريامبليفيكيشن. لم يتم اختبار هذه المعلمات في الدراسة الحالية. على سبيل المثال، قد جمعت ganglia المعوي من عينات خزعة الأمعاء كاملة-سمك (2 سم x 2 سم) للاستخدام مع قبكر4.

كما تدل على أننا في هذه الدراسة، استخدام الصبغة المتوافقة مع الإيثانول، كريسيل البنفسجي، يوفر حماية أفضل بكثير من سلامة الحمض النووي الريبي من وصمة عار مائي، تولويدين الأزرق. عندما أغرق في الإيثانول، تصبح رنسيس الخاملة5،15. ومع ذلك، لا يزال استعادة رنسيس الدالة مرة واحدة معرضة للماء7،15. عند التلوين بالأصباغ المائية، يجب أن تتعرض الأنسجة للمياه خالية من نوكلاس لحوالي 1 دقيقة9، مما يؤدي إلى تدهور كبير في الجيش الملكي النيبالي. عند استخدام تولويدين الأزرق تلطيخ الأنسجة، كنا غير قادر على الحد من التعرض للمياه قبل وبعد التلوين، لأن هذه التعديلات أيضا قلل من امتصاص والاحتفاظ تولويدين الأزرق، على التوالي. تمت مصادفة مشكلة مماثلة أيضا مع صبغ الهيماتوكسيلين المستندة9. في البروتوكول المعدل الموصوفة هنا، تلطيخ مع البنفسجي كريسيل يتجنب التعرض المباشر لعينات الأمعاء بالماء وأقصى حد ممكن وبالتالي الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. هذه النتائج القضاء على الحاجة إلى مثبطات رناسي إضافية في الحل المصبوغة. ووجدنا أن هذه الموانع غير فعالة في تمكين استخدام صبغ مائي، تولويدين الأزرق، كما أنها تتدخل في امتصاص والاحتفاظ بالصبغة.

عند تحسين لدينا بروتوكول المصبوغة في البداية، كنا غير قادر على استخراج النتائج التي تم الحصول عليها في البروتوكولات الأخرى وتقارير5،7،،من811. في حين السبب في ذلك غير واضح، وجدنا العديد من العوامل التي أدت إلى امتصاص الصبغة غير متناسقة والاحتفاظ بها. على سبيل المثال، على الرغم من أن لديها الملون بعض البروتوكولات بنجاح النسيج باستخدام كريسيل البنفسجي في الإيثانول 100%8 أو في الإيثانول 75%5, الصبغ فقط خافت المسمى ganglia أو خلفية عالية، وكان مقارنة باستخدام كريسيل البنفسجي في الإيثانول 95%. النسبة المئوية للبنفسجي كريسيل المستخدمة في حل المصبوغة آخر، أيضا مهم جداً. معظم البروتوكولات التوصية 1% كريسيل حل بنفسجي7،8، لكنها لم تقدم هذا التركز تلطيخ موثوقة في أيدينا، حتى بعد تلطيخ الأبواب ليصل إلى 2 دقيقة. كان لدينا أفضل نجاح تلطيخ كريسيل البنفسجي11 تطبق على العينة من خلال تصفية المحاقن معقمة8مع توضيح كيفية حل المصبوغة مشبعة من 4%. يتيح هذا الحل المشبعة تلطيخ السريع أكثر بكثير من العينة، بأقل قدر من 10-15 س. يتيح التثبيت المسبق للعينة في برود الإيثانول 95% (في-20 درجة مئوية) امتصاص أكثر سرعة من وصمة عار.

وجد تقرير آخر أن ganglia المعوي الأكثر وضوح الملون في أقسام الأمعاء البشرية الطازجة المجمدة عند الجمع بين البنفسجي كريسيل ويوزين في حل إيثانول 75%5. ومع ذلك، وجدنا أن ويوزين جعلت من الصعب تحديد العقد وأن كريسيل البنفسجي، وحدها، ويقدم كشف متفوقة. ووجد في دراسة مختلفة، أن حل كريسيل بنفسجي مخزنة قدمت نتائج المصبوغة متسقة ل أنسجة سرطان بطانة الرحم10. ومع ذلك، وجدنا هذا لم تقدم أي تحسن للأنسجة المعوية البشرية وأيضا لا يمكن تنفيذها عند استخدام الإيثانول 95% لحل المصبوغة.

قد اختبرنا عددا من الظروف التي يمكن أن تكون متوقفة مؤقتاً البروتوكول واستأنفت في وقت لاحق. تشير العديد من البروتوكولات تقطيع شرائح قبل الموعد المحدد وإعادة تجميدها فورا بعد تصاعد على5،الشريحة9في-80 درجة مئوية. مع هذا النهج، وتلطيخ ويمكن LCM ثم تستأنف خلال الأسبوع المقبل، تقدم قدرا كبيرا من المرونة. ومع ذلك، ليس فقط هذا إلى حد كبير تتداخل مع تلطيخ؛ كما خفضت سلامة الحمض النووي الريبي في أيدينا (البيانات لا تظهر). للتحايل على هذه المشكلة، نوصي Grover et al. تلطيخ والتجفيف المقاطع قبل التخزين في الثلاجة11. وفي هذا النهج، الملون الشرائح والمجففة (كما هو الحال في الجدول 1) تصل إلى 100% والخطوة الإيثانول اللامائى (بروتوكول الفرع 5-2). عينات هي المحتضنة في قنينة ثانية من الإيثانول اللامائى 100% لمدة 10 دقائق ثم يتم نقلها فورا إلى أنبوب مخروطي مع هلام المجففة، ثم يتم مبردة على الثلج الجاف ونقلها إلى الثلاجة-80 درجة مئوية. عند إزالة عينات من الثلاجة، الشرائح فورا مغمورة في الإيثانول اللامائى 100% 30 ثانية وقبل الهواء المجفف لأداء LCM11. ولسوء الحظ، خفضت هذا النهج في أيدينا، رين من 0.6-0.8 (البيانات لا تظهر). ونحن لذلك لجأت إلى أداء جميع المقاطع وتلطيخ و LCM في نفس اليوم من أجل الحصول على سلامة الحمض النووي الريبي القصوى في ظروفنا. وهذا يثبت أن يكون عملية تستغرق وقتاً طويلاً، ولكن يمكن أن تملأ قبعات LCM 10-14 خلال العمل يوم كامل من.

النقطة الأكثر موثوقية في الذي يمكن أن يكون مؤقتاً لدينا بروتوكول في مرحلة الحضانة زيلين نفط. وقد ترك الشرائح في زيلين نفط (مع ثقب سيتا الجزيئية) لتصل إلى 4-5 ح دون أي تأثير واضح على سلامة الحمض النووي الريبي. وقد وجدنا أنه عندما يتم إعداد ثلاث شرائح في وقت واحد، كل ما يمكن معالجته مع LCM ضمن هذا الإطار الزمني، حتى إذا كان هناك حاجة إلى فاصل ساعة. خيار بديل ديسيككاتي الشرائح بعد الخطوات تلطيخ والجفاف داخل اكسيكاتور فاكوومسيليد16، ولكن نحن لم تحاول حتى الآن هذا النهج.

عزل الحمض النووي الريبي بعد آخر خطوة حاسمة لهذا الإجراء، مع أهم العوامل يجري: الحصول على عائد ممكن القصوى من الجيش الملكي النيبالي، الاحتفاظ بمجموعة كاملة من الحمض النووي الريبي (دون فقدان الأنواع رنا أصغر)17،18، و القضاء تماما على الحمض النووي من عينة17. في أيدينا، قدمت مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي "ب" أفضل النتائج مع عينات لدينا، كما أنها عرضت غلة أكبر وأكثر فعالية في القضاء على الحمض النووي الجينوم. ملاحظاتنا بشأن الاختلافات بين الكواشف استخراج الحمض النووي الريبي في غلة تتسق مع التقارير السابقة17،18. ومع ذلك، هناك أيضا العديد من الدراسات LCM التي أبلغت عن النجاح مع استخراج الحمض النووي الريبي الكواشف19،20. كما تشير التقارير السابقة إلى أن عمليات استخراج الحمض النووي الريبي المستندة إلى عمود تقدم استبقاء أفضل من جزيئات الحمض النووي الريبي صغيرة من أساليب "استخراج الحمض النووي الريبي" تستند الفينول18 كجزيئات الحمض النووي الريبي صغيرة يمكن أن تضيع في المادة طافية أثناء هطول الأمطار في الجيش الملكي النيبالي الخطوات.

ولاحظنا أن تحلل الحمض النووي الريبي المخازن المؤقتة التي تستخدم ثيوسيانات جوانيدينيوم مع إضافة β-mercaptoethanol فعالة للغاية في إزالة كافة العقد تم التقاطها من كاب LCM (الشكل 5د). بينما معظم LCM البروتوكولات لا توحي فورتيكسينج، وقد وجدنا أن هذا يؤدي إلى نتائج ممتازة ولا يسفر عن تدهور الجيش الملكي النيبالي. ويوفر أيضا احتمال أكبر أن جميع أسر العقد سيتم الإفراج عنهم من الحد الأقصى لاستخراج الحمض النووي الريبي. استخدام هذه الأساليب، نحن عموما الحصول على غلة الجيش الملكي النيبالي من LCM ganglia المعوي في نطاق 1.8 إلى 18 ng/سم2 من الأنسجة المعوية، اعتماداً على كيفية العديد من العقد الحالية على شريحة معينة. يتطلب الإجراء تسلسل الحمض النووي الريبي لدينا إدخال الحد أدنى من 10 نانوغرام الجيش الملكي النيبالي، ولكن الإجراءات الأخرى يمكن أن يكون كثير أقل الحمض النووي الريبي الإدخال إذا كان يتضمن معالجة تسلسل عدد أكبر من الدورات السابقة التضخيم. المساحة الكلية للأنسجة المخزنة من إعداد وعملية تجميد فلاش هو 40-60 سم2، الذي ينص رنا وافرة كدنا المكتبة الإعدادية وتطبيقات تسلسل الحمض النووي الريبي المدخلات المنخفضة.

بينما لدينا إجراء يهدف لجمع ganglia المعوي كله، النهج الذي يمكن سهولة تعديل لمجموعة واحدة من الخلايا العصبية، أو إطلاق، إذا رغبت في ذلك5. ومع ذلك، نظراً لكثافة عمليات الدبقية انشياث الخلايا العصبية من ENS، رنا الدبقية سيتم تضمين جنبا إلى جنب مع الجيش الملكي النيبالي للقبض على الخلايا العصبية، أن كان ذلك على حساب انخفاض. وهذا يثير مسائل عند محاولة تحديد النصوص الخلايا العصبية وأعرب في عدد نسخ منخفضة. خلية واحدة الجيش الملكي النيبالي-seq يوفر الدقة والكشف عن أفضل في هذا الصدد، ولكن يتطلب الخلايا العصبية فصلها عن الأنسجة المعوية، ملطخة بعلامات العصبية القومية، ومعزولة مع التدفق الخلوي21 أو المحددة من الجامعة والأمعاء ديسوسييشنز بعد الفرز مع المعلوماتية الحيوية النهج. الجانب السلبي لمعظم الدراسات الانفصال هو أن معظم بروتوكولات تتطلب أن تكون المحتضنة العينة في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية لفترات طويلة، ومن المعروف أن يغير الترنسكربيتوم3. في الآونة الأخيرة، استخدمت مبطلات الباردة النشطة من Bacillus ليتشينيفورميس لجيل تعليق خلية واحدة للماوس الأنسجة وقد يكون من الممكن تطبيق هذا الإنزيم للانفصال من الأنسجة البشرية في 4 درجات مئوية22. حتى يتم إنجاز هذا التحسين، LCM للأنسجة البشرية المجمدة الطازجة وسيلة قوية لالتقاط الحمض النووي الريبي للتعبير التنميط من عناصر الجهاز العصبي المحيطي مثل ganglia المعوي.

وباختصار، قمنا بتطوير بروتوكول موثوقة ومتسقة لجمع الحمض النووي الريبي من ganglia المعوية البشرية. ونحن قد الأمثل إعداد الأنسجة المعوية البشرية وتلطيخ وعملية LCM واستخراج الحمض النووي الريبي استناداً إلى العديد من المنشورات والبروتوكولات. وقد أثبتنا أيضا موثوقية هذا النهج في جمع عينات من الحمض النووي الريبي من نوعية كافية من الحمض النووي الريبي لما يليها الحمض النووي الريبي هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على نطاق واسع للأنسجة التي جمعت من المرضى الذين يعانون من عدد من الأمراض المعدية المعوية، ويمكن أن يسهل تطويعها للاستخدام مع نماذج القوارض، مما يوفر استراتيجية موثوق بها لتطوير علاجات جديدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

Acknowledgments

ونحن ممتنون للجهات المانحة وأسرهم الذين جعلوا هذا العمل ممكناً. ونقدر أيضا بمساعدة الموظفين في المعهد الدولي للطب والخدمات تينيسي الجهات المانحة للمساعدة في تنسيق مجموعة من الأنسجة المستخدمة في هذه الدراسة. وأيد هذا العمل المنح المقدمة من "المعاهد الوطنية للصحة"، المعاهد الوطنية للصحة OT2-OD023850 لدعم الإدارة البيئية2 وراتب من المعاهد الوطنية للصحة T32-DK007673 إلى أمز. ونحن ممتنون للموظفين من "الموارد المشتركة علم الأمراض المتعدية فاندربيلت" للوصول إلى صك LCM وإسداء المشورة بشأن إعداد الأنسجة. علم أمراض الأنسجة فاندربيلت الموارد المشتركة معتمد جزئيا من المعاهد الوطنية للصحة منح P30-CA068485-14 و U24-DK059637-13. ونشكر مركز الوصول إلى تكنولوجيا الجينوم في قسم علم الوراثة في "كلية الطب في جامعة واشنطن" للمساعدة في تحليل الجينوم. غتاك معتمد جزئيا بالسرطان NCI مركز دعم المنح #P30 CA91842 إلى مركز السرطان Siteman وتكنولوجيات المعلومات والاتصالات/كتسا #UL1TR002345 منحة من المركز الوطني لبحوث الموارد (نكر)، مكون من المعاهد الوطنية للصحة (NIH)، والمعاهد الوطنية للصحة خارطة الطريق للأبحاث الطبية. هذا المنشور هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة الرأي الرسمي لنكر أو المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Neutral-buffered formalin Sigma HT501128-4L
2-Methylbutane Fisher O3551-4
3-mL syringe BD 309628
50-mL conical tubes, polypropylene  Corning 05-526B
Base molds 37x24x5mm, disposable Electron Microscopy Sciences 5025511
Belzer UW  Cold Storage Solution Bridge to Life N.A.
CapSure Macro LCM caps Arcturus, ThermoFisher LCM0211
Cling Wrap, Press’n Seal    Glad   N.A. 
Cresyl Violet Acetate Acros Organics AC405760025
Cutting Board Electron Microscopy Sciences 63308
Ethanol, 190-proof Pharmco-AAPER 111000190
Ethanol, 200-proof Pharmco-AAPER 111000200
Glass Microscope slides Fisher 12-550-343
Gloves, extended cuff Microflex  19010144
Gowns, surgical-disposable Kimberly-Clark  19-088-2116
Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) Nalgene   1335920B
Kimwipes (large) Kimberly-Clark  34120
Kimwipes (small) Kimberly-Clark  34133
Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) ThermoFisher N.A.
Leica Cryostat Chuck, large,  40 mm  Southeast Pathology Instrument Service N.A. 
Light Microscope Olympus CX43
Microscope objective (20X) Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 N.A.
Microscope objective (10X) Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- N.A. 
Molecular Sieves Acros Organics AC197255000
Nuclease-free water Ambion AM9937
PicoPure RNA extraction kit Applied Biosystems 12204-01
Pellet Pestle Kimble Kontes 4621973
PEN membrane LCM slides Arcturus, ThermoFisher LCM022
RNase-free tubes, 1.5 mL Ambion AM12400
RNaseZAP  Sigma Sigma-R2020
RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) Applied Biosystems 12204-01
RNA Extraction Kit "B" (RNeasy  Micro kit) Qiagen 74004
RNA Extraction Method "C" (TRIzol) Invitrogen 15596-026
RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) Qiagen 74134
Splash Shield, disposable faceshield Fisher 17-310
Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" Fine Science Tools 14002-14
Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) Nalgene   190-2520
Tissue Freezing Medium General Data Healthcare TFM-5
Xylenes Fisher X3P1GAL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
  2. Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
  3. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
  4. Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
  5. Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  6. Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
  7. PALM Protocols - RNA handling. , ZEISS. Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011).
  8. Schlaudraff, F. L. M. Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015).
  9. Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
  10. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  11. Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
  12. Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
  13. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
  14. Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
  15. Potter, S. S., Brunskill, E. W. Laser capture. Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).
  16. Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
  17. Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
  18. Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
  19. Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
  20. Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
  21. Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
  22. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).

Tags

علم الأعصاب، 136 قضية، التقاط الليزر ميكروديسيكتيون (LCM)، الأنسجة المعوية البشرية، الأمعاء، ganglia المعوي، والجهاز العصبي المعوي، واستخراج الحمض النووي الريبي، "البنفسجي كريسيل" تلطيخ، الحمض النووي الريبي التسلسل (الحمض النووي الريبي-Seq)
الأمثل لالتقاط الليزر ميكروديسيكشن لعزل Ganglia المعوي من الأنسجة البشرية الطازجة المجمدة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

May-Zhang, A. A., Deal, K. K.,… More

May-Zhang, A. A., Deal, K. K., Southard-Smith, E. M. Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue. J. Vis. Exp. (136), e57762, doi:10.3791/57762 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter