新鮮凍結ひと組織から腸管神経節の隔離のためのレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクションの最適化

このメソッドは、レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) を使用して人間の腸組織から腸管神経節の高品質 RNA サンプルを取得します。ここで説明したプロトコル RNA シーケンス (seq RNA) の十分な RNA の品質と生産性を提供するために最適化されているし、新鮮な切除、固定されていない、フラッシュ冷凍人間の腸組織で使用するものです。

機能性消化管・腸の運動障害、米国のすべての 4 人の影響を与えます。腸神経系 (ENS)、2 つ目の脳の¹とも呼ばれます、しばしば、これらの無秩序の中心に腸内の恒常性と運動で重要な役割を果たしています。消化管運動の操作は一般的に結腸/noncontractile 組織、慢性的な食餌療法の修正および/または薬の外科的切除に制限されています。驚いたことに、大人の ENS のにおけるトランスクリプトームの大幅薬学的ターゲットまたは幹細胞療法に活用できる ENS 内の分子を識別するために我々 の能力を制限するシーケンスするままです。

人間の腸管神経節からの RNA を隔離するため比較的少数の方法があります。高い温度と長い潜伏時間; 細胞解離²、最初のアプローチが必要です。両方あるの RNA の劣化を促進し、トランスクリプトーム^2,3を変更知られています。代替アプローチ、LCM、詳細は確実にトランスクリプトームを保存し、RNA の整合性を保護します。いくつかの研究は、LCM を使用新鮮凍結ひと腸管組織^4,5,6から大脳基底核を収集するが、これらのアプローチが貧しい人々 の RNA の品質や数量に阻まれたか、非常に労働集約的であったか汚れるか、または私たちの手で動作するように RNA 抽出技術の変更を必要とします。マニュアル提供腸管神経節^8,の分離に適用されるときに追加改善^7、8、しかし適応が必要だった LCM 製品で発見された RNA を保持するために設計された他 LCM のプロトコル⁹しますこれらの理由から、我々 はひと腸管神経節から整合性の高い RNA の相当な量を生成、比較的高速なワークフロー、大規模な全体で一貫性のある結果を生成するこれらのリソースに基づいて最適化されたプロトコルを開発。サンプルの数。

本研究では人間の腸切除から腸管神経節から整合性の高い RNA の分離を容易にする最適化された手順の概要を提案します。私たちの方法には、5 つの重要な側面が組み込まれています。最初、新鮮な切除、固定されていない人間の腸サンプル研究所組織で除去し、スラリー状のドライアイスと 2-methylbutane (2 MB) 上にフラッシュ凍結する前に大規模な基本金型で平坦化のすべての余分な水分は、サイズに整うべきであります。筋間神経叢に腸の神経節細胞の大規模なペイロードを提供するスライド上の完全な平面を取得には、腸の第二に、組織学的セクションを備える必要があります。この手順での成功は組織の準備プロセスに大きく依存です。第三に、神経節、ENS の不均一構造ポリエチレン napthalate (ペン) 膜スライド⁶、LCM プロセス中に最大の速度と精度を提供するの使用が必要です。クレシル バイオレットなどの第四に、エタノールと互換性のある染料は、腸の神経節細胞を染色しながら RNA の整合性を維持するために使用ください。最後に、RNA 抽出プロセスは RNA シーケンスで成功を収めるのための重要です私たちは真心を RNA を生成、腸管神経節の小さなコレクションを開始するときに RNA の収量を最大化、DNA 汚染を排除しできるだけ RNA の多くの種を保持 RNA 抽出方法を追求しました。

一緒に取られて、本研究ではこれらの要因の最適化は大きくワークフローを加速し、例外的な RNA の量と質と腸管神経節のサンプルが得られます。結果は、主としてこのアプローチの一貫性を示すサンプルのかなりのグループの間で一貫しています。さらに、正常に腸の神経節細胞からの RNA のサンプルの数十をシーケンス処理するこれらの方法を使いました。ここを強調する戦略には、目的の神経節の LCM あるいは末梢と中枢神経系と高品質 RNA の隔離を必要とするその他の場合の核を実行するため広く適応ことができます。