Cerebral organoids repræsenterer en nye modelsystem til at undersøge tidlig menneskelige hjerne udvikling i vitro. Denne artikel giver den detaljeret metode til effektivt generere homogene dorsale forhjernen-type organoids fra menneskelige inducerede pluripotente stamceller herunder kritiske karakterisering og validering trin.
Den menneskelige cortex er stærkt udvidet og udstiller en kompleks struktur med specifikke funktionelle områder, giver højere hjernefunktion, såsom kognition. Bestræbelser på at studere menneskelige hjernebarken udviklingen har været begrænset af tilgængeligheden af modelsystemer. Omsætte resultater fra gnaver undersøgelser til det menneskelige system er begrænset til arter forskelle og undersøgelser på primære væv er hæmmet af en mangel på væv tilgængelighed samt etiske bekymringer. Seneste udvikling i humane pluripotente stamceller (PSC) teknologi omfatter generation af tre-dimensionelle (3D) selvorganiserende organotypic kultur systemer, som efterligner til en visse omfang menneske-specifikke hjerne udvikling i vitro. I øjeblikket er forskellige protokoller tilgængelige for generation af enten hele hjernen eller hjerne-regionen specifikke organoids. Metoden for generation af ensartet og reproducerbar forhjernen-type organoids fra induceret PSC (iPSC), som vi tidligere har etableret og beskrive her, kombinerer PSC iboende evne til at selv organisere med guidede differentiering mod den forreste neuroectodermal afstamning og matrix indlejring for at støtte dannelsen af en kontinuerlig neuroepithelium. Mere specifikt denne protokol omfatter: (1) generation af iPSC aggregater, herunder konvertering af iPSC kolonier til en sammenflydende éncellelag kultur; (2) induktion af anterior neuroectoderm; (3) integrering af neuroectodermal aggregater i en matrix stillads; (4) generation af forhjernen-type organoids fra neuroectodermal aggregater; og (5) fiksering og validering af forhjernen-type organoids. Som sådan, giver denne protokol en let anvendelig ordning for generation af standardiserede og reproducerbare iPSC-afledte kortikale væv strukturer i vitro.
Den menneskelige hjerne er klart en af de mest komplekse organer og er ansvarlig for alle menneskelige intellektuelle evner. En dybere forståelse af menneskelige-specifikke hjernens udvikling er således en afgørende forudsætning for forståelsen af menneskets kognitive evner. Traditionelt, transgene dyr fungerede som modelorganismer til at undersøge hjernens udvikling. Disse modeller leveres grundlæggende indsigt i principperne for hjernens udvikling. Vi ved nu, at en fælles funktion af hjernens udvikling hos alle pattedyr er en præcis koreografi stamfader spredning, neurogenese og neuronal migration. Der er dog betydelige strukturelle forskelle mellem hjerner af modelorganismer som gnavere og mennesker, især i neocortex. De primære mekanismer, der er blevet foreslået at bidrage til primat kortikale evolution er en øget spredning af stamceller og stamfader celler og generation af ydre radial glia celler (oRGCs), der findes kun meget sjældent i gnavere1 ,2,3.
Metoder til model menneskelige hjernebarken udvikling omfatter generation af PSC-afledte telencephalic stamceller og hjernebarken projektion neuroner som éncellelag kulturer. Disse standardiserede differentiering protokoller replay visse aspekter af menneskelig kortikale udvikling som den stereotype tidsmæssige rækkefølge af kortikale neurogenese4. De falder dog kort når det kommer til sammenfatning af udviklingsprocesser for organogenesis såsom rumlige mønstre og morfogenese. Nyere udvikling i stamceller biologi førte til oprettelsen af 3D organoid kulturer fra PSC’er, som revolutionerer forskning af in vitro- humane organogenesis. Udnytte PSC’er kapacitet til selvstændig organisere i organotypic strukturer, har forskellige organoids, som afspejler vigtige strukturelle og funktionelle egenskaber af organer, herunder nyrer, gut, øjet og hjernen været etableret5. Sådanne organoids indeholder flere orgel-specifikke cellulære undertyper, som kan samle og rumligt organisere meget lig den udvikle organer i vivo5,6. Derudover afslørede celle sammensætning, lineage forhold og genet netværk undersøgelser ved hjælp af encellede RNA sekventering at menneskelige cerebral organoids trofast sammenfatte vigtige aspekter af menneskelig føtal neocortex udvikling såsom gen expression programmer 7 , 8. en større ulempe, som forhindrede deres bred anvendelse hidtil, var dog stor batch til batch variationer og organoid til organoid heterogenitet9.
Her give vi en detaljeret protokol for en enkel og standardiseret forhjernen-type organoid kultur system. Det centrale element i dette system er, at det effektivt og reproducerbar genererer PSC-afledte organoids næsten eksklusiv dorsale telencephalic identitet. Protokollen er baseret på de metoder, der anvendes i vores seneste Celle rapporter papir10. Det kombinerer selvorganisering kapacitet på iPSCs med selektiv induktion af kortikale neuroepithelium og håndfast kan generere homogene kulturer af tidlige dorsale telencephalic væv inden 3 uger. Protokollen bygger på tidligere rapporteret SMAD signalering og Wnt hæmning strategi, der guider differentiering af PSC mod forreste neuroectodermal slægt11,12 i kombination med matrix indlejring, som fremmer dannelsen af omfattende og kontinuerlige neuroepithelial strukturer13. Vi har med succes brugt metoden beskrevet på forskellige iPSC linjer, med flere kloner pr. person. Vi viste, at dette system er velegnet til downstream applikationer hvor reproducerbarhed og ensartethed er af stor betydning som sygdom modellering. Når anvendelsen af protokollen til iPSCs stammer fra patienter lider af en svær kortikale misdannelse, var vi i stand til at sammenfatte patologiske kendetegnende for sygdommen i vitro og identificere nye molekylære mekanismer fører til de fænotypiske ændrer10. Vi foreslår, at den beskrevne organoid protokol kan udnyttes for at lukke kløften mellem reduktionistiske PSC-afledte kortikale éncellelag kulturer og i vivo undersøgelser, og at det repræsenterer en pålidelig og stabil cellebaserede modelsystem til at simulere tidligt menneskelige kortikale udvikling i sundhed og sygdom uden for menneskekroppen.
Hjernen organoids repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at studere menneskelige hjerne udvikling i vitro , da de giver de relevante arter baggrund og den komplekse 3D arrangement af celler i forbindelse med væv. Med det bygge de bro mellem ikke-menneskelige dyremodeller og reduktionistisk menneskelige todimensional éncellelag celle kultur teknikker. Deres programmer hæmmes imidlertid af manglende reproducerbarhed9. Vi har udviklet en forhjernen-type organoid protokol, som overvinder den store prøve til prøve variation ved at kombinere iPSC selvorganiserende kapacitet med deres imødekommenhed til mønster faktorer. Specifikt, iPSCs blev lagt sammen for at fremme selv-organisering og efterfølgende hæmme TGF-β/SMAD signalerer til fremme dorsale cortex differentiering ved at udsætte kulturer til en BMP (LDN-193189) og en TGF-β type I-receptor inhibitor (A83-01). Derudover blev en sammensat hæmme Wnt vej (IWR) til at forhindre, at posteriorization anvendt. I modsætning til ‘iboende’ cerebral organoid protokoller19, som er baseret på samlesæt uden ekstern kontrol giver anledning til temmelig heterogene hjernen organoids og udviser stor batch variationer (målt ved effektivitetsgevinsterne af polariseret neurale ectoderm dannelse15), protokollen beskrevet her reproducerbar genererer homogene forhjernen-specifikke organoids fra menneskelige iPSCs.
Disse forhjernen-type organoids kan bruges til en bred vifte af applikationer som Neuro-udviklingsmæssige undersøgelser, evolutionær undersøgelser herunder gen funktion undersøgelser, sygdom modellering og potentielt, drug test og terapeutiske formål. Protokollen er dog mest velegnet til at undersøge tidlige aspekter af menneskelig kortikale udvikling. Vi har for eksempel brugt forhjernen-type organoids til at undersøge menneske-specifikke aspekter af vRGC adfærd. Mere specifikt patofysiologiske forandringer forbundet med en svær form af lissencephaly, en menneskelig kortikale misdannelse karakteriseret ved en i nærheden af fravær af kortikale foldning, blev behandlet. Kun visse aspekter af denne sygdom kan modelleres i mus, musen hjernen er naturligvis lissencephalic. Når du anvender ordningen med organoid til lissencephaly patient-afledte iPSCs, kunne vi pålideligt sammenfatte menneske-specifikke aspekter af sygdommen og identificere underliggende mekanismer. Mere specifikt kunne vi vise, at patienten-afledte organoids viser en signifikant reduktion i størrelse skyldes et skift fra symmetrisk til asymmetrisk celledeling af vRGCs. Denne switch var forbundet med ændringer i organisationen af vRGCs’ mikrotubulus net, en afbrydelse af arkitekturen i VZ niche og ændret udtryk for celle adhæsionsmolekyler, fører til en nedsat aktivering af N-cadherin/β-catenin signalering akse10. Note: β-catenin-afhængig regulering af vRGC division tilstande blev foreslået for at være menneske-specifikke som overekspression af β-catenin i mus fører til tangential cortex ekspansion og efterfølgende kortikale folde20. Således, vores data fremhæve at ordningen forhjernen-type organoid repræsenterer et lovende redskab til at studere i en målelig måde human-specifikke aspekter af tidlig kortikale udvikling i vitro.
En stor udfordring for fremtiden er at opretholde ensartethed af organoids over længere tidsperioder for at opnå mere modne neuronal fænotyper. Dette kunne realiseres af en eller flere af følgende: dyrkning af organoids i en bioreaktor system14, anvende flydende scaffolds15, supplere differentiering mediet med neurale vækst eller neuronal overlevelse faktorer. Til sidst kan en kontrolleret stigning i hjernen kompleksitet opnås ved fusing forhjernen-type organoids med cerebral organoids af forskellige regionale identitet21,22.
Tilsammen, tilbyder forhjernen-type organoid protokol præsenteres her en let anvendelse og pålidelige værktøj for generation af tidlige kortikale strukturer in vitro. Protokollen giver anledning til meget homogene tidlige kortikale væv på tværs af flere iPSC linjer og kan udnyttes til at pålideligt oprette individuelle-specifikke kortikale væv. Således er systemet specielt velegnet til programmer, der kræver en høj grad af ensartethed og reproducerbarhed som sygdom modellering.
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet var støttet af Ministeriet for Innovation videnskab og forskning i Nordrhein-Westfalen (Junior Research Group) og ERA-NET NEURON, JTC 2015 nervesystemets, STILK-MCD.
A83-01 | StemGent | 130-106-274 | 500 nM |
B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | 1 to 100 |
Basement membrane extract (e.g. Geltrex) | Gibco | A14132-02 | |
Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | 0.15 µg/mL |
Cell-dissociation reagent (TrypLE Express) | Gibco | 12605028 | |
Counting chamber e.g. Fuchs-Rosenthal | Karl Hecht | 40449001 | |
D-Glucose | Carl Roth | HN06.3 | 0.2 mg/mL |
DMEM-F12 L-Glutamin | Gibco | 11320033 | |
Embedding molds (Tissue-Tek Cryomold) | Sakura Finetek | 4565 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | 0.5 mM |
Gelantin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | 10 ug/mL |
Inhibitor of WNT response (IWR-1) | Enzo Life Science | BML-WN103-0005 | 10 ug/mL |
Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | 2.5 µg/mL |
IPSC medium for monolayer cultures (Pluripro) | Cell Guidance Systems | MK01 | |
L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax) | Gibco | 35050038 | 1% |
Low-adhesion 6 cm plates | Labomedic | 2081646L | |
Low-adhesion 10 cm plates | Labomedic | 2081646O | |
LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-104-171 | 180 nM |
N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | 1 to 200 |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140035 | 0.50% |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | 4.00% |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
Plastic paraffin film (Parafilm) | BRAND GMBH + CO KG | 701606 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Cell Guidance Systems | SM02-100 | 5 µM or 50 µM |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Tubes 15 mL | Corning Life Sciences | 734-0451 | |
Microscope Slides e.g. Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS4 | |
Tissue culture 6 well plate | Falcon | 734-0019 | |
Tissue culture 24 well plate | Falcon | 734-0949 | |
Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
Ultra-low-binding 96 well lipidure-coat plate A-U96 | Amsbio | AMS.51011610 | |
Antibodies | |||
Sox2 | R&D Systems | MAB2018 | |
Pax6 | Covance | PRB-278P-100 | |
Otx2 | R&D Systems | ab9566 | |
Emx1 | Sigma | HPA006421 | |
N-cadherin | BD | 610921 | |
ZO-1 | Life Tech | 61-7300 | |
P-Vimentin | Biozol | D076-3 | |
Tpx2 | Novus Biologicals | NB500-179 | |
Acetylated α-tubulin | NEB/CS | 5335 | |
Alexa488 anti ms | Invitrogen | A11001 | |
Alexa488 anti rb | Invitrogen | A11008 | |
Alexa555 anti ms | Invitrogen | A21424 | |
Alexa555 anti rb | Invitrogen | A21429 |