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Entwicklungsbiologie

Generazione di standardizzato e riproducibile del Forebrain-tipo Organoids cerebrale da umani cellule staminali pluripotenti indotte

Published: January 23, 2018
doi:
10.3791/56768
, , , ,
1Institute of Reconstructive Neurobiology,University of Bonn, 2Central Institute of Mental Health,University of Heidelberg/Medical Faculty Mannheim, 3Hector Institute for Translational Brain Research (HITBR gGmbH)

Summary

Organoids cerebrale rappresentano un nuovo modello di sistema di indagare cervello umano sviluppo anticipato in vitro. Questo articolo fornisce la metodologia dettagliata per generare efficientemente omogenei dorsale del forebrain-tipo organoids da cellule staminali pluripotenti indotte umane tra cui passaggi critici di caratterizzazione e convalida.

Abstract

Corteccia umana è altamente espanso ed esibisce una struttura complessa con specifiche aree funzionali, fornendo funzioni cerebrali superiori, come cognizione. Sforzi per studiare lo sviluppo della corteccia cerebrale umana sono stati limitati dalla disponibilità di sistemi modello. Tradurre i risultati degli studi del roditore al sistema umano è limitato dalle differenze di specie e studi su tessuti umani primari sono ostacolati dalla mancanza di disponibilità di tessuto, come pure le preoccupazioni di ordine etico. Recenti sviluppi nella tecnologia delle cellule staminali (PSC) pluripotenti umane includono la generazione di tridimensionale (3D) sistemi auto-organizzanti organotipiche cultura, che mimano in una certa misura cervello umano specifico sviluppo in vitro. Attualmente, sono disponibili vari protocolli per la generazione di intero cervello o organoids specifica regione del cervello. Il metodo per la generazione dei organoids omogeneo e riproducibile del forebrain-tipo da indotto PSC (iPSC), che abbiamo precedentemente stabilito e descritta qui, combina la capacità intrinseca di PSC di auto-organizzarsi con differenziazione guidata verso il neuroectodermal anteriore lignaggio e matrix incorporamento per supportare la formazione di un neuroepithelium continuo. Più specificamente, questo protocollo comporta: (1) la generazione degli aggregati iPSC, compresa la conversione delle colonie iPSC ad una coltura monostrato confluente; (2) l’induzione di neuroectoderma anteriore; (3) l’incorporamento di neuroectodermal aggregati in un’impalcatura di matrice; (4) la generazione dei organoids del forebrain-tipo da neuroectodermal aggregati; e (5) la fissazione e la convalida dei organoids del forebrain-tipo. Come tale, questo protocollo fornisce un sistema facilmente applicabile per la generazione di tessuto corticale iPSC-derivato standardizzato e riproducibile strutture in vitro.

Introduction

Il cervello umano è chiaramente uno degli organi più complessi ed è responsabile di tutte le abilità intellettuale umane. Così, una più profonda comprensione dello sviluppo del cervello umano specifico è un prerequisito fondamentale per la comprensione delle capacità cognitive umane. Tradizionalmente, gli animali transgenici servito come organismi modello per studiare lo sviluppo del cervello. Questi modelli forniti approfondimenti fondamentali i principi dello sviluppo del cervello. Ora sappiamo che una caratteristica comune di sviluppo del cervello in tutti i mammiferi è una precisa coreografia di proliferazione di cellule progenitrici, neurogenesi e migrazione neuronale. Esistono, tuttavia, notevoli differenze strutturali tra i cervelli degli organismi di modello, quali roditori e gli esseri umani, soprattutto nella neocorteccia. I meccanismi principali che sono state proposte per contribuire alla evoluzione corticale dei primati sono un’aumentata proliferazione delle cellule staminali e progenitrici nonché la generazione di cellule di glia radiale esterno (oRGCs), che si trovano solo molto raramente nei roditori1 ,2,3.

Metodi di sviluppo della corteccia cerebrale umana di modello includono la generazione di cellule progenitrici telencefalico PSC-derivato e neuroni di proiezione della corteccia cerebrale come culture dello strato monomolecolare. Questi standardizzata differenziazione protocolli riprodurre alcuni aspetti dello sviluppo corticale umano come l’ordine temporale stereotipata di neurogenesi corticale4. Essi, tuttavia, cadere a breve quando si tratta della ricapitolazione dei processi di sviluppo dell’organogenesi come patterning spaziale e morfogenesi. Più recenti sviluppi nella biologia delle cellule staminali ha condotto all’istituzione delle culture organoid 3D da sportelli unici, che stanno rivoluzionando la ricerca di in vitro umano organogenesi. Utilizzare la capacità degli sportelli unici di auto-organizzarsi in strutture organotipiche, organoids vari, che riflettono le proprietà chiave strutturale e funzionale degli organi, comprese quelle del rene, intestino, l’occhio ed il cervello sono stati stabiliti5. Tali organoids contengono molteplici sottotipi cellulari organo-specifici, che raggruppano e organizzano spazialmente molto simile a organi in via di sviluppo in vivo5,6. Inoltre, composizione cellulare, rapporto di lignaggio e studi di rete genica mediante sequenziamento di RNA di singola cellula ha rivelato che organoids cerebrale umana ricapitolare fedelmente gli aspetti principali dello sviluppo fetale umano neocorteccia quali programmi di espressione genica 7 , 8. uno svantaggio principale, che ha impedito loro vasta applicazione finora, era, tuttavia, il grande lotto variazioni e organoid-a-organoid eterogeneità9.

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per un sistema di coltura organoid del forebrain-tipo semplice e standardizzato. La caratteristica fondamentale di questo sistema è che esso in modo efficiente e riproducibile genera organoids PSC-derivato dell’identità telencefalici dorsali quasi esclusivo. Il protocollo si basa sui metodi utilizzati nel nostro recente Cell Reports carta10. Esso unisce la capacità di auto-organizzazione di iPSCs con induzione selettiva di neuroepithelium corticale e robustamente può generare omogenei colture del tessuto telencefalico dorsale precoce entro 3 settimane. Il protocollo si basa sulla segnalazione SMAD precedentemente segnalati e strategia di inibizione di Wnt che guida la differenziazione del PSC verso l’anteriore neuroectodermal lignaggio11,12 in combinazione con matrice incorporamento, che promuove la formazione di grande e continuo neuroepithelial strutture13. Abbiamo usato il metodo descritto con successo su varie linee di iPSC, con diversi cloni per ogni individuo. Abbiamo dimostrato che questo sistema è adatto per applicazioni a valle in cui omogeneità e riproducibilità sono di grande importanza come la modellazione di malattia. Quando l’applicazione del protocollo a iPSCs derivate da pazienti affetti da una grave malformazione corticale, siamo stati in grado di riassumere le caratteristiche patologiche della malattia in vitro e per identificare nuovi meccanismi molecolari che portano alla fenotipica Cambia10. Suggeriamo che il protocollo organoid descritta può essere utilizzato per chiudere il divario tra culture PSC-derivato corticale monostrato riduzionista e studi in vivo , e che esso rappresenta un sistema affidabile e stabile modello basati su cellule per simulare presto sviluppo corticale umano nella salute e nella malattia di fuori del corpo umano.

Protocol

1. generazione di iPSC aggregati Generazione di colture monostrato di cella singola da colonie di iPSC Preparare una piastra a 6 pozzetti Estratto (BME) rivestito della membrana dello scantinato. Scongelare BME sul ghiaccio a 4 ° C per 2-3 h, diluirlo con freddo di Dulbecco per volta Eagle Medium F12 (DMEM-F12; 01:50 diluizione), coprire la piastra con 1 mL/bene della soluzione diluita di BME e memorizzare la piastra durante la notte a 4 ° C. Il mezzo di aspirare e lavare intatto iPSC colonie di almeno 2 pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con 0,5 mM EDTA in tampone fosfato salino (PBS) due volte prima di incubazione colonie con acido etilendiamminotetracetico 0,5 mM (ed) in PBS per 4 min a temperatura ambiente (TA). Aspirare la soluzione di EDTA e staccare delicatamente le colonie lavandole via il fondo del piatto con 5 mL di terreno DMEM-F12. Raccoglierli in una provetta da 15 mL e appallottolarli mediante centrifugazione (4 min a 1.200 x g a RT).Nota: iPSCs riprogrammato da fibroblasti commercialmente disponibile è stato utilizzato con successo10. Aspirare il supernatante e incubare le colonie di iPSC con 500 µ l di reagente di cella-dissociazione per 6 min a 37 ° C. Dispensare la sospensione cellulare diverse volte delicatamente su e giù con una pipetta da 1 mL per rompere i mazzi delle cellule rimanenti in singole celle. Aggiungere 4 mL di DMEM-F12 la sospensione cellulare per diluire il reagente di cella-dissociazione. Girare le cellule giù a 1.200 x g per 4 minuti a TA. Risospendere le cellule in 2 mL di iPSC supplementato con 5 µM Y-27632 e seme di celle in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti BME rivestito.Nota: Utilizzare il mezzo di iPSC specificato nella Tabella materiali per le culture di iPSC una cella singola monostrato. Il giorno successivo, è necessario sostituire il mezzo con medium fresco iPSC manca Y-27632. Da questo punto, continuare a coltivare le cellule, cambiando il mezzo ogni giorno fino a quando iPSCs sono 100% confluenti. A seconda della linea cellulare e la confluenza dei pozzi iniziale, questo vi porterà tra 2-4 giorni. Una volta confluente, passaggio le iPSCs. Medio di aspirare e applicare 500 µ l di reagente di cella-dissociazione sulle cellule. Incubare le cellule per 5-10 min a 37 ° C. Scuotere delicatamente la piastra per staccare le cellule. Lavare le cellule dal pozzo con 2 mL di DMEM-F12 e raccoglierli in un tubo di 15 mL. Aggiungere DMEM-F12 per un volume totale di 5 mL. Rotazione verso il basso le cellule a 1.200 x g per 4 min a RT e aspirare il supernatante. Le cellule del seme in iPSC supplementato con 5 µM Y-27632 in 1:2 a rapporto di 1:4 su una BME rivestito piastra a 6 pozzetti (2 mL/pozzetto di mezzo). Continuare a coltura le cellule per 2-5 giorni e sostituire il terreno iPSC carente Y-27632 ogni giorno. Una volta confluenti, passaggio iPSCs (passi 1.1.4-1.1.8).Nota: Come un monostrato a iPSC medio specificato nella Tabella materiali prima del loro utilizzo per la generazione di iPSC aggregati per consentire alle cellule di adattarsi alle condizioni di cultura della coltura iPSCs per almeno 2 passaggi. Utilizzare colture monostrato iPSC quando sono 70-90% confluenti per la generazione di iPSC aggregati.Nota: iPSC adattato alle condizioni di cultura come singole cellule sono meno inclini a sottolineare che conduce alla morte delle cellule durante la procedura di dissociazione e di aggregazione. Colture monostrato iPSC necessario visualizzare morfologia tipica pluripotenti senza prova di differenziazione. Testare le culture su base regolare per contaminazione del micoplasma. Funzionano solo con iPSC micoplasma-free culture. Aspirare il terreno di coltura da un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e applicare 500 µ l di reagente di cella-dissociazione sulle cellule. Incubare le cellule per 5-10 min a 37 ° C. Scuotere delicatamente la piastra per staccare le cellule. Lavare le cellule dal pozzo con 2 mL di DMEM-F12 e raccoglierli in un tubo di 15 mL. Aggiungere DMEM-F12 per un volume totale di 10 mL. Per il conteggio delle cellule, prendere 25 µ l dalla sospensione delle cellule e mescolare con 25 µ l di trypan blu per marcare le cellule morte. Contare le cellule viventi, utilizzando una camera di conteggio. Raccogliere abbastanza cellule (4.500 cellule per iPSC aggregazione) dalla sospensione cellulare in una provetta da 15 mL. Rotazione verso il basso le cellule a 1.200 x g per 4 min a RT e aspirare il supernatante. Risospendere le cellule in un volume adeguato di iPSC supplementato con 50 µM Y-27632 ottenere 4.500 cellule vive a 150 µ l.Nota: Utilizzando un’alta concentrazione di Y-27632 (50 µM) è fondamentale per la sopravvivenza della iPSCs. Piastra 150 µ l in ogni bene di un basso-allegato 96 pozzetti U-fondo piatto e posizionarlo nell’incubatore a 37 ° C e 5% CO2.Nota: Durante la generazione di iPSC aggregati, considera che almeno 6 organoids sono necessari per il controllo qualità al giorno 20 (Vedi sezione 5). 2. induzione di neuroectoderma anteriore Monitorare attentamente le modifiche morfologia degli aggregati iPSC ogni giorno sotto il microscopio di coltura del tessuto usando un 4 X o 10 X potenza lente. Osservare al giorno 1, aggregati cellulari con confini chiari. Continuare ad aggregati di iPSC cultura nell’incubatore a 37 ° C e 5% CO2.Nota: Un certo numero di morto cellule/pozzetto è normale e non influenzerà la generazione organoid. Nutrire gli aggregati di iPSC a partire dal giorno 2 e proseguendo con ogni altro giorno aspirando delicatamente circa 2/3 del mezzo senza disturbare gli aggregati di cellule nella parte inferiore. Aggiungere un ulteriore 100 µ l di iPSC medium privo di Y-27632.Nota: Entro 4-6 giorni gli aggregati di cellule saranno 350-450 µm di diametro e presentano bordi lisci. In questa fase, piscina della cella vengono aggregati con un puntale di taglio 100 µ l in un piatto basso-allegato 6 cm (massimo 20 aggregati/piatto) in mezzo di induzione corticale contenente DMEM-F12 con supplemento N2 (1: 200), supplemento B27 (1: 100), glucosio (0,2 mg/mL), ciclico adenosina monofosfato (cAMP; 0.15 µ g/mL), 0,5% non essenziali aminoacidi (NEAA), 1% L-alanil-L-Glutammina, eparina (10 µ g/mL) e i composti LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM) e di inibitore della risposta di Wnt-1 (Imperia Winter Regatta-1) (10 µ g/mL). Nutrire gli aggregati di cellule modificando il mezzo di induzione corticale 3 giorni dopo il loro trasferimento al piatto 6-cm. Monitorare attentamente i cambiamenti morfologici durante l’induzione corticale sotto il microscopio di coltura del tessuto utilizzando una lente di potenza X 4.Nota: Dopo 4-5 giorni nel mezzo di induzione corticale, bordi degli aggregati cellulari dovrebbero iniziare a illuminare la superficie, indicanti la differenziazione neuroectodermal. In questa fase, organizzazione radiale di un epitelio pseudostratified emerge. Procedere al punto 3 per incorporare gli aggregati di cella in una matrice BME. 3. l’incorporamento di Neuroectodermal aggrega in un’impalcatura di Matrix Scongelare il BME sul ghiaccio a 4 ° C per 2-3 h. aliquota BME non diluito in quantità sufficiente. Preparare un foglio di pellicola di plastica paraffina per la procedura di incorporamento. Tagliare la pellicola di plastica paraffina utilizzando forbici sterili in 4 cm x 4 cm grandi pezzi, mettere un pezzo di plastica pellicola di paraffina sopra un vassoio di punta vuota 100 µ l per 100 consigli per µ l e premere con un dito guantato in modo che piccole fossette nel foglio di pellicola di plastica paraffina vengono create (1 di mple/cella aggregata necessaria). Pulire la pellicola di plastica paraffina con etanolo al 70% e si irradiano con luce UV (potenza: 15 watt, lunghezza d’onda: 435 nm) sotto la panca sterile chiusa per 30 min. Trasferire ogni aggregato di cellule in una fossetta del foglio di pellicola plastica paraffina utilizzando una punta di taglio di 100 µ l con apertura di diametro di 1,5-2 mm. Nel caso che due delle cellule aggregati sono fuse, non separarli ma trasferirli insieme una fossetta. Aspirare delicatamente il mezzo che circonda gli aggregati cellulari utilizzando un puntale uncut 100 µ l.Nota: Essere attenti a non succhiare gli aggregati di cellule nella punta, onde evitare di danneggiare gli aggregati. Aggiungere 40 µ l di BME non diluito per ogni aggregato di cellule. Posizione ogni cella aggregata nel mezzo il BME goccia utilizzando una punta di pipetta 100 µ l uncut.Nota: Essere molto attenti a non danneggiare il neuroepithelium in via di sviluppo con la punta della pipetta. Attentamente il foglio di pellicola plastica paraffina utilizzando pinze sterili in 10 cm di Petri (o un’altra piastra di coltura di cellule sufficiente) di trasferimento e posizionare il piatto nell’incubatore per 15-20 minuti consentire il BME a solidificare. Nel frattempo, preparare un piatto di basso-allegato 6 cm contenente 5 mL di mezzo di induzione corticale. Dopo la polimerizzazione di BME, rimuovere le goccioline contenenti gli aggregati di cella dal foglio di pellicola di plastica paraffina. Girare il film di plastica paraffina utilizzando pinze sterili e spremere delicatamente l’aggregati cellulari in leggermente inclinato (circa 30 °) piatto di basso-allegato 6 cm fino a quando le gocce cadono con il foglio di pellicola di plastica paraffina. Trasferire un massimo di 16 aggregati cellulari in una parabola di 6 cm. Continuare a Incubare gli aggregati di cellule a 37 ° C. 4. generazione del Forebrain-tipo Organoids da Neuroectodermal aggregati Un giorno dopo l’incorporamento in una matrice BME, posizionare piatti di cultura organoid su un agitatore di cultura cellulare a dondolo con un angolo di inclinazione di 5 ° e la 14 rpm, installato in un’incubatrice di coltura cellulare. Monitor organoids ogni giorno. Neuroepithelial omogeneo ciclo-come le strutture si sviluppano gradualmente dopo l’incorporamento nella matrice BME. Quando le strutture di ciclo neuroepithelial sono visibili, modificare il mezzo per mezzo di differenziazione organoid contenente DMEM-F12 con supplemento N2 (1: 200), supplemento B27 (1: 100), glucosio (0,2 mg/mL), accampamento (0.15 µ g/mL), 0,5% NEAA, 1% L-alanil-L-Glutammina, insulina (2,5 µ g/mL) Sostituire il mezzo di differenziazione organoid ogni 3-4 giorni fino a quando non viene raggiunto il punto di tempo di differenziazione desiderata. Quindi difficoltà organoids (Vedi sezione 5).Nota: In alcuni casi, il tessuto può presentare germogli del tessuto otticamente trasparente senza strutture di ciclo. Anche se questo non è l’ideale, questo non è che interessano lo sviluppo di strutture corticali. Il organoids possono essere coltivate in mezzo di differenziazione organoid fino a 40 giorni. Per i periodi estesi cultura (40-100 giorni) il mezzo di differenziazione organoid può essere completato con 01:50 BME per aumentare la complessità del tessuto e con BDNF e GDNF per consentire un neurone sopravvivenza e maturazione di14,15. 5. fissazione e convalida del Forebrain-tipo Organoids Per la convalida, è necessario raccogliere 6 organoids al giorno 20. Utilizzare 3 organoids per l’isolamento di mRNA e analisi PCR. Trasferire le ulteriori 3 organoids una piastra a 24 pozzetti contenenti PBS utilizzando una pipetta 1ml taglio con un’apertura di 3-3,5 mm per il fissaggio e analisi immunocitochimiche sequenziale. Lavare il organoids due volte, accuratamente aspirando il PBS e sostituendolo con fresco PBS utilizzando una pipetta di 5 mL. Difficoltà organoids per 15 min a freddo 4% paraformaldeide (PFA) (pH 7.4).Attenzione: Fate attenzione che la PFA è un agente cancerogeno umano conosciuto. Tutto il lavoro deve essere fatto in una cappa chimica indossando guanti di nitrile. Si raccomanda di indossare occhiali di sicurezza. Formaldeide può causare danni irreversibili alla cornea. Aspirare il PFA con cura e lavare tre volte con PBS a temperatura ambiente per 10 min. Sostituire il PBS con una soluzione di saccarosio 30% (wt/vol, basati su PBS) e conservare i campioni a 4 ° C per consentire organoids a disidratarsi. Organoids possono essere memorizzati fino a 7 giorni fino al procedimento successivo. Un giorno dopo la fissazione, pre-macchia il organoids disidratato aggiungendo trypan blu a circa 01:50 per 10 minuti consentire la visualizzazione della organoids durante la procedura di cryosectioning. Preparare il mezzo di inclusione contenente 10% di saccarosio, gelatina di 7,5% wt/vol in PBS e riscaldarla a 75 ° C, fino a quando è liquido. Sostituire la soluzione di saccarosio al 30% con mezzo di inclusione e trasferire la piastra a 24 pozzetti su una piastra di riscaldamento (60 ° C) per 15 min equilibrare il organoids. Coprire il fondo degli stampini incorporamento con uno strato di incorporamento media e metterli sul ghiaccio per polimerizzare. Trasferimento organoids dalla piastra a 24 pozzetti per l’incorporamento delle muffe contenente il mezzo di inclusione polimerizzato, aggiungere mezzo di inclusione aggiuntivo sulla parte superiore affinché il organoids sono coperti e posizionare lo stampo rapidamente in un ghiaccio di etanolo/secco 100% congelamento (vasca da bagno temperatura dovrebbe essere compresa tra -30 a-50 ° C) per almeno 1 min al congelamento. Posizionare lo stampo con forcipe su ghiaccio secco temporaneamente e uno store che li a-80 ° C o direttamente procedere con cryosectioning. Donatrici organoids a 20 µm spessore e raccogliere le sezioni su vetrini da microscopio, mantenendo traccia dell’ordine di sezioni sui vetrini (assorbimento sequenza). Consentire sezioni ad asciugare sulle diapositive per diverse ore, prima di riporli a-80 ° C o direttamente eseguire macchiatura immunocytochemical.

Representative Results

Il protocollo di organoid del forebrain-tipo standardizzato descritto qui in genere genera le colture organoid altamente omogenea di quasi esclusivamente le identità corticale dorsale da iPSCs umano entro i 20 giorni di coltivazione (protocollo descritto nella Figura 1 A). si raccomanda di eseguire diverse operazioni di controllo di qualità durante il corso di tempo del protocollo, definito qui come: ‘Vai’ (continuare il processo di differenziazione) e ‘off limits’ (culture non ottimali, si consiglia di terminare il batch) (Figura 1 ). Si consiglia inoltre di documentare ogni passaggio di controllo di qualità ben prendendo immagini e note. Il primo passo fondamentale nella generazione del forebrain-tipo organoids è quello di iniziare con culture iPSC di alta qualità. È importante che i iPSCs non contengono più grandi frazioni di cellule differenziate. Utilizzare solo culture iPSC che presentano come un omogeneo monostrato di cellule indifferenziate presso la popolazione di partenza (figure 1B, C). Inoltre, è fondamentale iniziare con il numero di cella specificata per l’aggregazione di iPSC. La prima ispezione dettagliata degli aggregati iPSC dovrebbe essere eseguita il giorno 2. In questa fase, gli aggregati dovrebbero hanno formato compatto delle cellule gustative con bordi lisci (‘Vai’) mentre comparenti irregolari aggregati o inerti con cavità dovrebbero essere scartato (‘Go’) (figure 1, E). Il prossimo passo di controllo di qualità deve essere eseguito al giorno 10 del protocollo. A questo punto del tempo, gli aggregati di cellule dovrebbero mostrare tessuto liscio e otticamente trasparente sulla superficie esterna che rappresenta induzione del neuroectoderma (‘Vai’) considerando che l’assenza di tale tessuto indica suboptimale induzione neurale (‘off-limits’) (figure 1F, G ). Solo quelli aggregati che presentano una superficie traslucida (Figura 1F) dovrebbero essere incorporati nella matrice BME. Una volta incorporato, la corticale organoids svilupperà neuroepithelial continuo ciclo-come le strutture, che si espanderà rapidamente. Analizzare l’efficienza dell’induzione corticale al giorno 15 e giorno 20 indagando se il organoids hanno sviluppato ectoderma neurale polarizzato come illustrato in Figura 1H, J (‘Vai’). Nel caso che organoids non hanno sviluppato criticamente tali gemme neuroepiteliali (‘off limits’ come illustrato in Figura 1I, K), rivedere i passaggi di controllo di qualità eseguito per risolvere i problemi. Quando strettamente seguendo il protocollo, altamente standardizzate organoid lotti sarà generato (figure 2A, B), che mostrerà omogeneità ≥ 90% polarizzati formazione ectoderma neurale all’interno e in batch (Figura 2C). Un errore comune che conduce all’efficienza variabile di formazione ectoderma neurale polarizzata è quello di aumentare il numero di cella iniziale per l’aggregazione di iPSC, o iniziare con bassa qualità iPSC culture come micoplasma contaminati culture o culture che contengono le cellule differenziate. Una convalida dettagliata dell’identità telencefalici dorsali del organoids generato deve essere eseguita al giorno 20. A tal fine, 3 organoids dovrebbe essere fissa e utilizzato per le analisi di immunofluorescenza. Stratificato neuroepithelial loop (Figura 3A) esprimere il marcatore delle cellule staminali neurali Sox2 (Figura 3B, D), i marcatori del forebrain Pax6 e Otx2 (figure 3, E) e il marcatore corticale dorsale Emx1 (Figura 3 F). questi cicli corticali si caratterizzano inoltre per una localizzazione apicale di N-caderina e ZO-1 (figure 3, H), delle cellule di glia radiale di zona ventricolare (vRGC)-derivato dei microtubuli, che si estende da apicale al lato basale delle strutture ( Figura 3 io), e trova apicale divisione delle cellule che macchia positive per il vimentin fosforilato (p-Vimentin, Figura 3J). Morte delle cellule potrebbe essere presente all’interno delle strutture organoid. Apoptosi centrale sono normale e non pregiudica lo sviluppo del tessuto corticale. Inoltre, 3 organoids deve essere utilizzato per valutare l’omogeneità del protocollo di analisi dell’espressione genica. Proencefalo-tipo organoids mostrano l’espressione dei marcatori del forebrain dorsale (FoxG1, Otx2, Emx1), mentre l’espressione del mesencefalo (FoxA2, Pax5) e i marcatori del hindbrain (HoxB2, HoxA4, HoxB4, HoxB6) non è rilevabile (Figura 3K). Lotti di qualità controllata organoids possono essere utilizzati per varie applicazioni come l’analisi del piano di divisione delle cellule glial radiali apicale. A tal fine, suggeriamo di eseguire la doppia colorazione usando gli anticorpi contro p-Vimentin e Tpx2 (Figura 3J). P-Vimentin è fosforilato da CDK1 durante la mitosi e si trova nel nucleo, segnando così tutti i nuclei in fase mitotica16. Tpx2 è una proteina associata ai microtubuli che può visualizzare il fuso mitotico e i processi apicali durante la migrazione nucleare intercinetica17,18. Utilizzando questi marcatori, tre aspetti della vRGC divisione possono in linea di principio essere analizzati: (I) cellulare se divisione avviene sul lato apicale, (II) se il piano di divisione è allineata verticale (indicando simmetrica divisione cellulare), orizzontale o obliqua ( che indica la divisione cellulare asimmetrica) alla superficie apicale e (III) se i centri di organizzazione dei microtubuli si formano normalmente. Organoids può essere anche ulteriormente differenziato in strutture più complesse di tessuto corticale organizzata e stratificata. Strutture corticali entro giorno 35 ± 2 organoids sono composti da una zona ventricolare (VZ)-, una zona subventricular interna ed esterna (SVZ), come pure un piatto corticale (CP) – come zona. All’interno il VZ e SVZ interna ed esterna, vRGCs, progenitori intermedi (IPs) e cellule ricorda oRGCs possono essere identificate. Inoltre, la formazione iniziale di una corteccia a strati possa essere osservata in zona CP-come con profondità corticali neuroni esprimere Tbr1 e Ctip2 all’interno e neuroni corticali superiori esprimendo Satb2, così come di cellule che esprimono Reelin in regioni esterne10. Figura 1 : Panoramica schematica del protocollo organoid e illustrazione di ‘andare’ e ‘off limits’ criteri. (A) lo schema del protocollo. CI medio: mezzo di induzione corticale; CD: supporto differenziazione corticale. (B–C) Immagine di una cultura di monostrato confluente iPSC (B) 90% ottimale e una cultura di iPSC non idonei che esibiscono la differenziazione (C). (D–E) Un aggregato di iPSC ottimo dimensioni, densità delle cellule, e aspetto superficiale (D) e due aggregati di cellule ‘off limits’ espositrici o cella spares cavità (E, aggregato superiore) o irregolare bordi (Eaggregato inferiore) due giorni seguendo l’aggregazione delle cellule. (F–G) Aggregati cellulari espositrici traslucidi e bordi lisci (F) e aggregati cellulari carente ottico di compensazione (G). La linea gialla consiste nel visualizzare l’area di interesse. (H–K) Un’ottimale organoid con loop continuo neuroepiteliali (H, J) e un organoid che non è riuscito a sviluppare radialmente organizzati neuroectoderma (I, K) ripreso al giorno 15 e giorno 20, rispettivamente. Barre della scala, B-C 500 µm; D-K 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 : Omogeneità e riproducibilità del protocollo del forebrain-tipo organoid. (A–B) Immagini rappresentative del campo luminoso dei organoids tra una partita al giorno 15 (A) e 26 (B). (C) analisi Quantitative dei organoids al giorno 20. Organoids che mostrano sulla superficie esterna un neuroepithelium, riconoscibile nel campo luminoso come tessuto otticamente chiaro superficiale con un bordo libero e la prova di architettura cellulare radiale sono stati quantificati (n = 3 per linea iPSC con almeno 16 organoids per esperimento). Barre di scala, A-b: 500 µm. errore bar ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 : Convalida del proencefalo-tipo organoids al giorno 20. (A–J) Caratterizzazione di immunocytochemical dei organoids. Organoids organizzare nei loop multipli neuroepiteliali (A, controcolorati con DAPI). Stratificato organizzate cellule all’interno il neuroepithelial loop express il marcatore delle cellule staminali neurali Sox2 (B, D), i marcatori del forebrain Pax6 (C, D) e Otx2 (E), così come il marcatore di dorsale del forebrain Emx1 (F). Strutture corticali ciclo ha esibito una cintura di giunzione aderente bene alla maggior parte apicale laterale con l’accumulo di N-caderina (G) e zona occludens protein 1 (ZO-1; H). microtubule ventricolare RGCs reti (macchiati di α-tubulina acetilata, Ac-vasca) si estendono da apicale al lato basale delle strutture di ciclo (io). Proliferazione delle cellule che esprimono p-vimentin (p-Vim) si trovano sulla superficie apicale. Fusi mitotici sono macchiati di Tpx2. maggiore ingrandimento immagine rappresentativa di una verticale e un piano di divisione orizzontale vengono visualizzati sulla destra (J). (K) analisi di RT-PCR per i fattori di trascrizione specifici per regione al giorno 20 di due gruppi indipendenti di organoids derivati da 2 iPSC diverse linee. FB: controllo cervello fetale; AB: controllo cervello adulto. Barre della scala, A-D 200 µm; E-I 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Epitopo Diluizione Sox2 1 – 300 PAX6 1 – 500 Otx2 1 – 500 Emx1 1 – 50 N-caderina 1 – 500 ZO-1 1 – 100 P-vimentina 1 – 1000 Tpx2 1 – 500 Α-tubulina acetilata 1 – 500 Alexa488 anti-ms 1 – 1000 Alexa488 anti-rb 1 – 1000 Alexa555 anti-ms 1 – 1000 Alexa555 anti-rb 1 – 1000 Tabella 1: Anticorpi per il controllo di qualità dei organoids al giorno 20. Primer Sequenza Otx2 avanti tgcaggggttcttctgtgat Otx2 inversa agggtcagagcaattgacca FoxG1 avanti ccctcccatttctgtacgttt FoxG1 inversa ctggcggctcttagagat Emx1 avanti agacgcaggtgaaggtgtgg Emx1 inversa caggcaggcaggctctcc FoxA2 avanti ccaccaccaaccccacaaaatg FoxA2 inversa tgcaacaccgtctccccaaagt PAX5 avanti aggatgccgctgatggagtac PAX5 inversa tggaggagtgaatcagcttgg HoxB2 avanti tttagccgttcgcttagagg HoxB2 inversa cggatagctggagacaggag HoxA4 avanti ttcagcaaaatgccctctct HoxA4 inversa taggccagctccacagttct HoxB4 avanti acacccgctaacaaatgagg HoxB4 inversa gcacgaaagatgagggagag HoxB6 avanti gaactgaggagcggactcac HoxB6 inversa ctgggatcagggagtcttca 18 anni in avanti ttccttggaccggcgcaag 18s inversa gccgcatcgccggtcgg Tabella 2: Primer e sequenze dell’iniettore per profilo di espressione genica.

Discussion

Cervello organoids rappresentano un potente strumento per studiare lo sviluppo del cervello umano in vitro in quanto forniscono lo sfondo di specie interessate e la disposizione 3D complessa delle cellule in un contesto di tessuto. Con quello, colmano il divario tra modelli animali non-umani e tecniche di coltura cellulare umano monostrato bidimensionale riduzionista. Le applicazioni sono, tuttavia, ostacolate da una mancanza di riproducibilità9. Abbiamo sviluppato un protocollo di organoid del forebrain-tipo, che sormonta la grande variabilità di campione a campione combinando la capacità di auto-organizzazione di iPSC con la loro disponibilità a patterning fattori. In particolare, iPSCs sono stati aggregati per promuovere l’auto-organizzazione e successivamente inibire TGF-ß/SMAD segnalazione per promuovere la differenziazione di corteccia dorsale esponendo le culture in un BMP (LDN-193189) e un TGF-β tipo inibitore del recettore (A83-01). Inoltre, è stato applicato un composto inibendo la via di Wnt (IWR) per evitare posteriorization. In contrasto con ‘intrinseca’ cerebrale organoid protocolli19, che si basano su auto-assemblaggio senza controllo esterno dando luogo a organoids cervello piuttosto eterogenea e che esibiscono variazioni di batch di grandi dimensioni (misurato dall’efficienza di polarizzato ectoderma neurale formazione15), il protocollo descritto qui riproducibile genera omogenea del forebrain specifico organoids da iPSCs umane.

Questi organoids del forebrain-tipo può essere utilizzato per una varietà di applicazioni quali neurodevelopmental studi, studi evoluzionistici, compresi gli studi di funzione del gene, modellazione di malattia e, potenzialmente, gli scopi di test e terapeutici del farmaco. Il protocollo è, tuttavia, più adatto ad esaminare gli aspetti precoce dello sviluppo corticale umano. Ad esempio abbiamo usato il proencefalo-tipo organoids per esaminare gli aspetti umani specifici di comportamento vRGC. Più specificamente, cambiamenti patofisiologici connessi con una forma severa di Lissencefalia, una malformazione corticale umana caratterizzata da una quasi totale assenza di piegare la corticale, è stato risolto. Solo alcuni aspetti di questa malattia possono essere modellati in topi come nel cervello del topo è naturalmente lissencephalic. Quando si applica il sistema di organoid a lissencefalia paziente-derivato iPSCs, potremmo attendibilmente ricapitolare umani specifici aspetti della malattia e identificare i meccanismi di fondo. Più in particolare, potremmo dimostrare che paziente-derivati organoids mostrano una significativa riduzione in dimensioni causato da un interruttore da simmetrico per divisione cellulare asimmetrica di vRGCs. Questo switch è stato associato con le alterazioni nell’organizzazione della rete dei vRGCs dei microtubuli, una perturbazione dell’architettura della nicchia VZ e alterata espressione di molecole di adesione cellulare, che conduce ad un’alterata attivazione del N-caderina/β-catenina segnalazione di asse10. Di Nota: regolamento di β-catenina-dipendente delle modalità di divisione del vRGC è stato suggerito per essere umani specifici come la sovraespressione di β-catenina in topi conduce ad espansione corteccia tangenziali e successivamente corticale pieghevole20. Così, i nostri dati evidenziano che il sistema di organoid del forebrain-tipo rappresenta uno strumento promettente per studiare in maniera quantificabile gli aspetti umani specifici dello sviluppo corticale precoce in vitro.

Una sfida importante per il futuro è quello di mantenere l’omogeneità della organoids attraverso lunghi periodi di tempo al fine di ottenere il fenotipo neuronale più maturo. Questo potrebbe essere realizzato da una o più delle seguenti operazioni: coltura organoids in un bioreattore sistema14, applicando galleggianti ponteggi15, completando il mezzo di differenziazione con crescita neurale, o fattori di sopravvivenza neuronale. Infine, si potrebbe ottenere un aumento controllato nella complessità del cervello fondendo il proencefalo-tipo organoids con organoids cerebrale di diverse identità regionale21,22.

Presi insieme, il protocollo di organoid del forebrain-tipo presentato qui offre uno strumento affidabile e facilmente applicabile per la generazione dei primi strutture corticali in vitro. Il protocollo dà luogo a tessuto corticale precoce altamente omogeneo nelle diverse linee di iPSC e può essere utilizzato per generare in modo affidabile tessuto corticale individuo specifico. Così, il sistema è particolarmente adatto per applicazioni che richiedono un alto grado di omogeneità e riproducibilità come modellazione di malattia.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro è stato supportato dal Ministero dell’innovazione scienza e ricerca del Nord Reno-Westfalia (Junior Research Group) e da ERA-NET NEURON, JTC 2015 disturbi dello sviluppo neurologico, staminali-MCD.

Materials

A83-01 StemGent 130-106-274 500 nM
B27 Supplement Gibco 17504-044 1 to 100
Basement membrane extract (e.g. Geltrex) Gibco A14132-02
Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) Sigma-Aldrich A9501 0.15 µg/mL
Cell-dissociation reagent (TrypLE Express) Gibco 12605028
Counting chamber e.g. Fuchs-Rosenthal Karl Hecht 40449001
D-Glucose Carl Roth HN06.3 0.2 mg/mL
DMEM-F12 L-Glutamin Gibco 11320033
Embedding molds (Tissue-Tek Cryomold) Sakura Finetek 4565
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6511 0.5 mM 
Gelantin Sigma-Aldrich G1890
Heparin Sigma-Aldrich H3149-25KU 10 ug/mL
Inhibitor of WNT response (IWR-1) Enzo Life Science BML-WN103-0005 10 ug/mL
Insulin Sigma-Aldrich 91077C 2.5 µg/mL
IPSC medium for monolayer cultures (Pluripro) Cell Guidance Systems MK01
L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax) Gibco 35050038 1%
Low-adhesion 6 cm plates Labomedic 2081646L
Low-adhesion 10 cm plates Labomedic 2081646O
LDN-193189 Miltenyi Biotec 130-104-171 180 nM
N2 Supplement Gibco 17502-048 1 to 200
Non-essential amino acids Gibco 11140035 0.50%
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 4.00%
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 14190144
Plastic paraffin film (Parafilm) BRAND GMBH + CO KG 701606
ROCK inhibitor Y-27632 Cell Guidance Systems SM02-100 5 µM or 50 µM
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Tubes 15 mL Corning Life Sciences 734-0451 
Microscope Slides e.g. Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Scientific 4951PLUS4
Tissue culture 6 well plate Falcon 734-0019
Tissue culture 24 well plate Falcon 734-0949
Trypan blue stain Gibco 15250-061
Ultra-low-binding 96 well lipidure-coat plate A-U96 Amsbio AMS.51011610
Antibodies
Sox2 R&D Systems MAB2018
Pax6 Covance PRB-278P-100
Otx2 R&D Systems ab9566
Emx1 Sigma HPA006421
N-cadherin BD 610921
ZO-1 Life Tech 61-7300
P-Vimentin Biozol D076-3
Tpx2 Novus Biologicals NB500-179
Acetylated α-tubulin  NEB/CS 5335
Alexa488 anti ms Invitrogen A11001
Alexa488 anti rb Invitrogen A11008
Alexa555 anti ms Invitrogen A21424
Alexa555 anti rb Invitrogen A21429
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Referenzen

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Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (131), e56768, doi:10.3791/56768 (2018).
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