Summary

可視化とアデノ随伴ウイルスと共焦点顕微鏡を用いた脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト オルガネラのライブ イメージング

Published: October 23, 2017
doi:

Summary

ミエリンオリゴデンドロ サイトは、迅速な活動電位伝搬と神経細胞の生存を促進します。ここで説明した、切片蛍光タンパク質のオリゴデンドロ サイト固有表現のプロトコルです以降のタイムラプス イメージングと脳スライス。さらに、無染色のミエリンを可視化するための簡単な手順が表示されます。

Abstract

神経細胞は、電気絶縁性およびミエリンオリゴデンドロ サイトの栄養サポートに依存します。オリゴデンドロ サイトの重要性にもかかわらず現在ニューロンを研究に使用する高度なツール部分的にしか撮影されているオリゴデンドロ サイトの研究者。セル型固有のウイルスの伝達による染色は、ライブ オルガネラ動態を研究するための有用なアプローチです。本稿での転写の制御の下で対象となるミトコンドリアの蛍光蛋白質遺伝子を運んでいるアデノ随伴ウイルス (AAV) の伝達によって脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト ミトコンドリアを可視化するためのプロトコルミエリン塩基性タンパク質のプロモーター。コロナ マウス脳切片切片を作るためのプロトコルが含まれています。[ミトコンドリアのタイムラプス イメージングのための手順に従います。これらのメソッドは、他の細胞器官に転送することができ、特に髄鞘の細胞小器官を調べる場合に役立ちますがあります。最後に、共焦点反射顕微鏡 (コア) による生活のスライスで無染色のミエリンの可視化を容易に利用できる手法について述べる。コアは、余分な機器を必要としないとライブ イメージング中に髄鞘を識別することができます。

Introduction

脳の白質は神経細胞の軸索が髄鞘、オリゴデンドロ サイトによって形成された特殊な拡張プラズマ膜に包まれたので構成されます。髄鞘が高速かつ信頼性の高い活動電位伝搬と有髄軸索の長期的な生存のため必要と髄鞘の損失は、神経機能障害を引き起こす可能性が。その重要性にもかかわらずオリゴデンドロ サイトのプロパティは、あまり知られてに比べニューロンとアストロ サイト。その結果、オリゴデンドロ サイトを勉強の少ないツールを開発されています。

生きるイメージング細胞小器官のミトコンドリア、endoplasmatic 小胞体 (ER) や小胞構造の異なる時間の経過とともに細胞小器官のダイナミックな変化を研究することができます。伝統的に、リビングのオリゴデンドロ サイトのイメージングをモノカルチャー1,2で行った。単作のオリゴデンドロ サイトはコンパクトなミエリンを表示しないし、切片または急性脳スライスが、局在と細胞内小器官の動きを勉強するときにしたがってより良いオプションをことがあります。細胞小器官と髄鞘蛋白の局在は有髄の軸索と周囲の髄鞘の間の短い距離のために挑戦することができます。したがって、光顕微鏡による免疫染色の手順だけでは、有髄軸索のミエリン鞘の細胞小器官とを区別するため空間分解能を持っていません。これは、細胞型-特異的発現プロモーターによって駆動される細胞小器官をターゲットとした蛍光タンパク質の遺伝子をウイルスの伝達によって解決できます。利点は、オルガネラ局在とダイナミクスの正確な評価を可能にする細胞特異とスパース表現です。トランスジェニック動物は、このような細胞小器官をターゲットとしたセル固有の式3を達成するためにも使用できます。しかし、生産やトランスジェニック動物のメンテナンスは高価です、通常ウイルスの方法によって達成することができますスパース表現を提供していません。

記載されているメソッドはここ (MBP 水戸下流か MBP 水戸 GFP) を視覚化するミエリン塩基性タンパク質プロモーターによって駆動されるミトコンドリアをターゲットとした蛍光蛋白質 (下流または緑色蛍光タンパク質 GFP) とオリゴデンドロ サイトのウイルスの伝達を使用します。脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト ミトコンドリア。さらに、別の蛍光蛋白質 (GFP 水戸した dsred と併用または水戸 GFP を使用 tdtomato) 細胞質内の式は、髄鞘の細胞コンパートメントを含む細胞形態の可視化を有効にするためです。プロトコルには、脊髄の脳のスライス (・ デ ・ シモーニとゆう、2006年4,5で記述されたプロトコルの修正されたバージョン) を行うための手順が含まれています。我々 はミトコンドリアの動きを研究するためタイムラプス イメージング手順を説明します。この手順は、イメージング メディア、イメージング中に薬やその他の媒体の変更の簡単なアプリケーションを可能にするセットアップの継続的な交流と直立した共焦点顕微鏡を使用します。タイムラプス イメージング手順は、以下のように生活のスライスを維持するためのいくつかの余分な機器と、共焦点顕微鏡で実行できます。プロトコルには、画像を最適化し、毒性を削減するいくつかのヒントも含まれています。

最後に、共焦点反射顕微鏡 (コア) 無染色ミエリンを視覚化するための迅速かつ簡単な方法を説明します。これは、ライブ イメージング中に髄鞘を識別することができます。近年、いくつかのテクニックは、必要な任意の染色することがなくイメージ ミエリンに開発されているが、これらのほとんどは、特定機器と専門知識6,7,8を必要とします。ここで説明する手順ミエリン鞘の反射のプロパティを使用して、分光共焦点の顕微鏡検査の簡略化された単一励起波長バージョン (スコアは、いくつかのレーザーの波長はミエリンを視覚化する結合されます)9. コアは、488 nm レーザーと 470 500 nm バンドパス排出フィルターまたは可変発光フィルター、共焦点顕微鏡で行うことができます。

Protocol

ここで説明する手順は、ノルウェーの動物研究の権威によって承認されています。サプライヤーおよび消耗品等のカタログ番号必要な機器が、ドキュメントの最後に材料のリストで利用できる。 1。 切片スライス準備 注: このレシピ使用 2 つのマウスの子犬生後 7-9 (p7-9)、2 つの六つの文化料理に分かれて 24 切片スライスをもたらす。無菌フードで?…

Representative Results

脊髄脳スライス培養され、上記のように導入は、mito_dsred と GFP を表現する皮質のオリゴデンドロ サイトの疎な分布を示した。Olig2 および MBP 抗体で免疫染色式がオリゴデンドロ サイト (図 1) に固有であることを確認しました。 ライブ イメージングのため導入されたオリゴデンドロ サイトは並行 (<s…

Discussion

ここで説明した切片の文化を作るためのプロトコルは・ デ ・ シモーニと優 (2006 年)5で記述されたプロトコルの修正版18です。最も重要な変更は、以下に概説されています。Tris バッファーは、ウイルス伝達の間にインキュベーター外スライスの生存率と細胞培地の変更を向上させる文化メディアに追加されます。紙吹雪の殺菌のプロシージャも変更されま…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

リンダ ヒルデガルト Bergersen とアクセス用 Magnar Bjørås 細胞研究室と装置、プラスミドのウイルス産生 Janelia 分子生物学共有リソース スタッフ、レーザー パワー測定について公園 Vervaeke に感謝しますノルウェーの健康協会、ノルウェーの研究評議会によって資金が供給されたこの作品、顕微鏡装置 Norbrain によって資金を供給されました。

Materials

Agarose  Sigma  A9539
BD Microlance 19G BD 301500 Needles used for in- and outlet of bath
Bioxide gas AGA 105701
Brand pipette bulbs Sigma-Aldrich Z615927 Pipette bulbs
Bunsen burner (Liquid propane burner) VWR 89038-530
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments 64-0106  Temperature controller – thermometer part
CaCl2 Fluka 21100
CO2  AGA 100309 CO2 for incubator
Cover glass, square Corning Thermo  Fischer Scientific 13206778 To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly.
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Delicate forceps Finescience 11063-07 For dissection
Diamond scriber pen Ted Pella Inc. 54463
Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm VWR 612-1702 Glass pipettes
Double edge stainless steel razor blade Electron Microscopy Sciences #7200 Razor blade for vibratome
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Gibco-Invitrogen 24010-043
Filter paper circles Schleicher & Schuell 300,220 Filter paper used for filtration of PFA
Fun tack Loctite 1270884 Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath
Hand towel C-Fold 2 Katrin 344388
Harp, Flat for RC-41 Chamber, Warner Instruments  64-1418 Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3 Sigma H-7006
Holten LaminAir, Model 1.2 Heto-Holten 96004000M Laminar flow hood
Horse serum, heat inactivated Gibco-Invitrogen 26050-088
KCl Sigma P9541
LCR Membrane, PTFE,  Millipore FHLC0130 Confetti 
Leica VT1200 Leica 14048142065 Vibratome
MEM-Glutamax with HEPES Thermo  Fischer Scientific 42360024
MgCl2 R.P. Normapur 25 108.295
Micro Spoon Heyman Type B Electron Microscopy Sciences 62411-B Small, rounded spatula with sharpened end for dissection
Millex-GP filter unit Millipore SLGPM33RA Syringe filter unit
Millicell cell culture insert, 30 mm Millipore PICM03050 Cell culture inserts
Minipuls 3 Speed Control Module GILSON F155001 Peristaltic pump for live imaging – Control module part (connect to two-cannel head)
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S8282
NaHCO3 Fluka 71628
Nunclon Delta Surface Thermo  Fischer Scientific 140675 Culture plate
Nystatin Suspension Sigma-Aldrich N1638
Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC  Zeiss 441452-9900-000  Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR
Parafilm VWR 291-1211
Paraformaldehyde, granular Electron Microscopy Sciences #19208
PC-R perfusion chamber SiSkiYou  15280000E Bath for live imaging
Penicillin-Streptomycin, liquid Invitrogen 15070-063
Petri dish 140 mm  Heger 1075 Large Petri dish 
Petri dish 92×16 mm  Sarstedt  82.1473 Medium Petri dish 
Petridish 55×14,2 mm VWR 391-0868 Small Petri dish
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417 PBS tablets
R2 Two Channel Head  GILSON F117800 Peristaltic pump for live imaging – Two channel head part (requires control module)
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel VWR 82027-528 Large spatula for dissection
Sand paper VWR MMMA63119 Optional, for smoothing broken glass pipettes
Scissors,  17,5 cm Finescience 14130-17 Large scissors for dissection
Scissors, 8,5  Finescience 14084-08 Small, sharp scissors for  dissection
Single edge, gem blade Electron Microscopy Sciences #71972 Single edge razor blade
Single inline solution heater SH-27B Warner Instruments 64-0102 Temperature controller – heater part
Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm Millipore SCGPT05RE Filter to sterilize solutions
Super glue precision Loctite 1577386
Surgical scalpel blade no. 22 Swann Morton Ltd. 209 Rounded scalpel blade
Temperature controller TC324B Warner Instruments 64-0100 Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly)
Trizma base Sigma  T1503
Trizma HCl Sigma T3253
Water jacketed incubator series II Forma Scientific 78653-2882 Incubator

Referenzen

  1. Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
  2. Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
  3. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  5. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  6. Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
  7. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
  8. Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
  9. Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
  10. Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
  11. Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
  12. Gow, A., Friedrich, V. L., Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
  13. Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
  14. Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
  15. Jackson, J. G., O’Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
  16. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
  17. Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
  18. Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
  19. Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
  20. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurowissenschaften. 305, 86-98 (2015).
  21. Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
  22. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  23. Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
  24. Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
  25. Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Kennedy, L. H., Rinholm, J. E. Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56237, doi:10.3791/56237 (2017).

View Video