Summary

Visualisation et l’imagerie direct des oligodendrocytes Organelles dans des tranches de cerveau organotypique utilisant Virus Adeno-associé et microscopie confocale

Published: October 23, 2017
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Summary

Oligodendrocytes myélinisantes favorisent la propagation du potentiel d’action rapide et la survie des neurones. Décrit ici est un protocole pour l’expression des protéines fluorescentes dans organotypique oligodendrocyte spécifique des tranches de cerveau avec l’imagerie Time-lapse ultérieur. En outre, une procédure simple pour la visualisation de la myéline non-colorées est présentée.

Abstract

Les neurones dépendent de l’isolation électrique et le soutien trophique des oligodendrocytes myélinisantes. Malgré l’importance des oligodendrocytes, les outils avancés actuellement utilisés pour étudier les neurones, en partie seulement ont été prises par des chercheurs de l’oligodendrocyte. Cellule spécifique au type de coloration par transduction virale est une approche utile pour étudier la dynamique de l’organite direct. Cet article décrit un protocole pour la visualisation des mitochondries des oligodendrocytes dans des tranches de cerveau organotypique de transduction avec adeno-associated virus (AAV) transportant des gènes mitochondries protéines fluorescentes ciblés sous le contrôle transcriptionnel de le promoteur de la protéine basique de la myéline. Il inclut le protocole pour faire des coupes de cerveau de souris coronale organotypique. Une procédure de Time-lapse imagerie des mitochondries puis suit. Ces méthodes peuvent être transférées vers les autres organites et peuvent être particulièrement utiles pour l’étude des organites dans la gaine de myéline. Enfin, nous décrivons une technique facilement accessible pour la visualisation de la myéline non colorée dans des tranches de vie par microscopie confocale réflectance (CoRe). Noyau a besoin d’aucun équipement supplémentaire et peut être utile pour identifier la gaine de myéline pendant la formation image live.

Introduction

La substance blanche du cerveau se compose des axones des cellules nerveuses enveloppés dans la myéline, une plasmalemme étendu spécialisé formé par les oligodendrocytes. La myéline est nécessaire pour la propagation du potentiel d’action rapide et fiable et une survie à long terme des axones myélinisés, et une perte de la myéline peut provoquer des dysfonctionnements neurologiques. Malgré leur importance, les propriétés des oligodendrocytes sont moins connues comparées avec les neurones et les astrocytes. Par conséquent, moins d’outils ont été développés pour l’étude des oligodendrocytes.

Vivre l’imagerie des organites cellulaires tels que les mitochondries, le réticulum endoplasmatic (ER) ou différentes structures vésiculaires peuvent être utiles d’étudier les changements dynamiques dans les organites au fil du temps. Traditionnellement, l’imagerie des oligodendrocytes vivant a été réalisée en monocultures1,2. Cependant, oligodendrocytes en monoculture n’affichent pas de myéline compacte et organotypique ou tranches de cerveau aiguë peuvent, par conséquent, être une meilleure option lorsque l’on étudie le mouvement des organites et localisation. Localisation de petits organites et de protéines de la gaine de myéline peut être difficile en raison de la courte distance entre les axones myélinisés et la gaine de myéline environnante. Ainsi, lumière immunostaining microscopiques procédures seul n’ont pas la résolution spatiale d’établir une distinction entre les organites dans la gaine de myéline et ceux dans les axones myélinisés. Cela peut être résolu par transduction virale avec des gènes codant pour des protéines fluorescentes organelle ciblées grâce aux promoteurs spécifiques à un type de cellule. Les avantages sont une expression spécifique des cellules et éparse, qui permet une évaluation précise de la localisation de l’organite et dynamique. Animaux transgéniques permet également d’atteindre telle une ciblées organite spécifique des cellules expression3. Cependant, la production et l’entretien des animaux transgéniques est coûteux et habituellement n’offre pas l’expression rare qui peut être obtenue par des méthodes virales.

La méthode décrite ici utilise la transduction virale des oligodendrocytes avec mitochondrial ciblée des protéines fluorescentes (dsred ou vert fluorescent protéine GFP) conduit par le promoteur de la protéine basique de la myéline (MBP-mito-dsred ou MBP-mito-GFP) pour visualiser mitochondries dans des tranches de cerveau organotypique oligodendrocyte. En outre, l’expression d’une protéine fluorescente dans le cytoplasme (GFP utilisé conjointement avec mito-dsred ou tdtomato utilisé avec mito-GFP) est utilisée pour permettre la visualisation de la morphologie cellulaire, y compris les compartiments cytoplasmiques de la gaine de myéline. Le protocole prévoit la procédure pour faire des coupes de cerveau d’organotypique (une version modifiée du protocole décrit par De Simoni et Yu, 20064,,5). Nous décrivons ensuite la procédure d’imagerie Time-lapse pour étudier le mouvement mitochondriale. Cette procédure utilise un microscope confocal vertical avec un échange continu d’imagerie moyen, une installation qui permet une application facile de drogues ou d’autres modifications moyennes pendant la formation image. La procédure d’imagerie Time-lapse peut être effectuée sur n’importe quel microscope confocal, avec certains équipements supplémentaires pour le maintien des tranches de vie tel que décrit ci-dessous. Le protocole contient également plusieurs conseils pour optimiser l’imagerie et de réduire de phototoxicité.

Enfin, un moyen simple et rapide de visualiser la myéline non-colorées par microscopie confocale réflectance (CoRe) est décrite. Cela peut être utile pour identifier la gaine de myéline pendant la formation image live. Ces dernières années, plusieurs techniques ont été développées à la myéline image sans aucune coloration requise, mais la plupart d’entre eux nécessite des équipements et l’expertise6,7,8. La procédure décrite ici utilise les propriétés réfléchissantes de la gaine de myéline et est une version simplifiée unique-excitation d’onde de la microscopie confocale facteur de réflexion spectrale (SCoRe, dans lequel plusieurs laser des longueurs d’onde est combinés afin de visualiser la myéline) 9. coRe peut être fait sur n’importe quel microscope confocal disposant d’un laser à 488 nm et un filtre d’émission de 470-500 nm passe-bande ou un filtre accordable d’émission.

Protocol

les procédures décrites ici ont été approuvés par l’autorité norvégienne de recherche des animaux. Fournisseurs et les numéros de catalogue pour les consommables et autres requis matériel n’existe pas dans la liste du matériel à la fin du document. 1. préparation de tranches organotypique Remarque : cette recette utilise deux souriceaux à jour après la naissance, 7-9 (7-9), qui donne 24 tranches organotypique divisés sur deux Pétri de six puits…

Representative Results

Organotypique des tranches de cerveau qui ont été cultivées et transduites tel que décrit ci-dessus montrent une distribution clairsemée des oligodendrocytes corticales exprimant mito_dsred et GFP. Immunohistochimie avec des anticorps contre Olig2 et MBP a confirmé que l’expression spécifique d’oligodendrocytes (Figure 1). Pour l’imagerie live, oligodendrocytes transduits ont été reco…

Discussion

Le protocole permettant la culture organotypique décrite ici est une version modifiée de18 du protocole décrit par De Simoni et Yu (2006)5. Les changements les plus importants ont été décrites ci-dessous. Tampon Tris est ajouté au milieu de culture, ce qui améliore la survie des tranches en dehors de l’incubateur au cours de la transduction virale et la modification du milieu cellulaire. La procédure de stérilisation de confettis est également modifiée. Alors …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Linda Hildegard Bergersen et Magnar Bjørås pour accéder à la cellule de laboratoire et équipement, personnel Janelia biologie moléculaire ressource partagée pour la production de virus et de plasmide et Koen Vervaeke pour assistance avec mesures de puissance de laser. Ce travail a été financé par l’Association norvégienne de la santé, le Conseil norvégien de la recherche et de l’équipement de microscopie a été financée par Norbrain.

Materials

Agarose  Sigma  A9539
BD Microlance 19G BD 301500 Needles used for in- and outlet of bath
Bioxide gas AGA 105701
Brand pipette bulbs Sigma-Aldrich Z615927 Pipette bulbs
Bunsen burner (Liquid propane burner) VWR 89038-530
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments 64-0106  Temperature controller – thermometer part
CaCl2 Fluka 21100
CO2  AGA 100309 CO2 for incubator
Cover glass, square Corning Thermo  Fischer Scientific 13206778 To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly.
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Delicate forceps Finescience 11063-07 For dissection
Diamond scriber pen Ted Pella Inc. 54463
Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm VWR 612-1702 Glass pipettes
Double edge stainless steel razor blade Electron Microscopy Sciences #7200 Razor blade for vibratome
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Gibco-Invitrogen 24010-043
Filter paper circles Schleicher & Schuell 300,220 Filter paper used for filtration of PFA
Fun tack Loctite 1270884 Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath
Hand towel C-Fold 2 Katrin 344388
Harp, Flat for RC-41 Chamber, Warner Instruments  64-1418 Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3 Sigma H-7006
Holten LaminAir, Model 1.2 Heto-Holten 96004000M Laminar flow hood
Horse serum, heat inactivated Gibco-Invitrogen 26050-088
KCl Sigma P9541
LCR Membrane, PTFE,  Millipore FHLC0130 Confetti 
Leica VT1200 Leica 14048142065 Vibratome
MEM-Glutamax with HEPES Thermo  Fischer Scientific 42360024
MgCl2 R.P. Normapur 25 108.295
Micro Spoon Heyman Type B Electron Microscopy Sciences 62411-B Small, rounded spatula with sharpened end for dissection
Millex-GP filter unit Millipore SLGPM33RA Syringe filter unit
Millicell cell culture insert, 30 mm Millipore PICM03050 Cell culture inserts
Minipuls 3 Speed Control Module GILSON F155001 Peristaltic pump for live imaging – Control module part (connect to two-cannel head)
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S8282
NaHCO3 Fluka 71628
Nunclon Delta Surface Thermo  Fischer Scientific 140675 Culture plate
Nystatin Suspension Sigma-Aldrich N1638
Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC  Zeiss 441452-9900-000  Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR
Parafilm VWR 291-1211
Paraformaldehyde, granular Electron Microscopy Sciences #19208
PC-R perfusion chamber SiSkiYou  15280000E Bath for live imaging
Penicillin-Streptomycin, liquid Invitrogen 15070-063
Petri dish 140 mm  Heger 1075 Large Petri dish 
Petri dish 92×16 mm  Sarstedt  82.1473 Medium Petri dish 
Petridish 55×14,2 mm VWR 391-0868 Small Petri dish
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417 PBS tablets
R2 Two Channel Head  GILSON F117800 Peristaltic pump for live imaging – Two channel head part (requires control module)
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel VWR 82027-528 Large spatula for dissection
Sand paper VWR MMMA63119 Optional, for smoothing broken glass pipettes
Scissors,  17,5 cm Finescience 14130-17 Large scissors for dissection
Scissors, 8,5  Finescience 14084-08 Small, sharp scissors for  dissection
Single edge, gem blade Electron Microscopy Sciences #71972 Single edge razor blade
Single inline solution heater SH-27B Warner Instruments 64-0102 Temperature controller – heater part
Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm Millipore SCGPT05RE Filter to sterilize solutions
Super glue precision Loctite 1577386
Surgical scalpel blade no. 22 Swann Morton Ltd. 209 Rounded scalpel blade
Temperature controller TC324B Warner Instruments 64-0100 Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly)
Trizma base Sigma  T1503
Trizma HCl Sigma T3253
Water jacketed incubator series II Forma Scientific 78653-2882 Incubator

Referenzen

  1. Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
  2. Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
  3. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  5. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  6. Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
  7. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
  8. Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
  9. Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
  10. Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
  11. Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
  12. Gow, A., Friedrich, V. L., Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
  13. Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
  14. Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
  15. Jackson, J. G., O’Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
  16. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
  17. Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
  18. Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
  19. Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
  20. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurowissenschaften. 305, 86-98 (2015).
  21. Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
  22. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  23. Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
  24. Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
  25. Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).

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Diesen Artikel zitieren
Kennedy, L. H., Rinholm, J. E. Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56237, doi:10.3791/56237 (2017).

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