Summary

Elektrophysiologische Aufzeichnung von<em> Drosophila</em> Trichoid Sensilla in Reaktion auf Odoranten der niedrigen Volatilität

Published: July 27, 2017
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Summary

Das Gesamtziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie man Geruchsstoffe mit geringer Flüchtigkeit für die Single-Sensillum-Aufzeichnung von Drosophila- olfaktorischen Rezeptor-Neuronen, die auf langkettige cutikuläre Pheromone reagieren, präsentieren kann.

Abstract

Insekten verlassen sich auf ihren Geruchssinn, um eine breite Palette von Verhaltensweisen zu führen, die für ihr Überleben kritisch sind, wie z. B. Nahrungssuchende, Raubtiervermeidung, Eiablage und Paarung. Unzählige Chemikalien unterschiedlicher Volatilitäten wurden als natürliche Geruchsstoffe identifiziert, die Insekten-Olfaktor-Rezeptor-Neuronen (ORNs) aktivieren. Allerdings wurde das Studium der olfaktorischen Reaktionen auf niedervolatile Geruchsstoffe durch eine Unfähigkeit behindert, solche Reize mit herkömmlichen Geruchsabgabemethoden effektiv zu präsentieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das die wirksame Darstellung von Geringheitsröhrchen mit geringer Volatilität für in vivo Single-Sensillum Recording (SSR) ermöglicht. Durch Minimierung 1 den Abstandes zwischen der Geruchsquelle und dem Zielgewebe, ermöglicht diese Methode zur Anwendung von biologisch ausgeprägten aber bisher unzugänglichen Riechstoffe, einschließlich Palmitoleinsäure, eine stimulierende Pheromon mit einer nachgewiesenen Wirkung auf ORNs in Balz und Paarungsverhalten beteiligt.Unsere Prozedur bietet somit eine neue Avenue, um eine Vielzahl von niedervolatilen Geruchsstoffen für das Studium der Insekten-Olfusion und Pheromon-Kommunikation zu untersuchen.

Introduction

Drosophila ORNs reagieren auf eine Vielzahl von Geruchsstoffen mit weitreichenden Kohlenstoffkettenlängen und einer Vielzahl von funktionellen Gruppen, einschließlich Estern, Alkoholen, Ketonen, Lactonen, Aldehyden, Terpenen, organischen Säuren, Aminen, Schwefelverbindungen, Heterocyclen und Aromaten 2 , 3 Geruchsstoffe, die in ihren physikalisch-chemischen Merkmalen variieren, können deutlich unterschiedliche Volatilitäten aufweisen, die durch den Dampfdruck der Verbindung gekennzeichnet sind. Bemerkenswerterweise unterscheiden sich biologisch relevante Geruchsstoffe für Drosophila melanogaster in ihrer Flüchtigkeit stark. Zum Beispiel reagieren Ir92a ORNs auf Ammoniak 4 , das sehr flüchtig ist, mit einem Dampfdruck von 6,432 mmHg bei 20 ° C. Im Gegensatz dazu reagieren Or67d ORNs auf ein männliches Pheromon, cis- Vccccylacetat ( c VA) 5 , 6 , dessen Dampfdruck 43 mmHg bei 20 ° C beträgt.

Ove_content "> Das Studium der olfaktorischen Reaktion auf Geruchsstoffe mit geringer Flüchtigkeit ist bei herkömmlichen Geruchsabgabemethoden besonders anspruchsvoll, bei denen die Geruchsstoffe über einen Trägerluftstrom über einen relativ langen Abstand ( dh mehrere Zentimeter) zugeführt werden, so dass die berichteten Geruchsreaktionen vorliegen Zu einem gegebenen geringe Volatilitätsgeruch kann je nach Ausgestaltung des Geruchsabgabesystems stark variieren. Beispielsweise reicht die berichtete Reaktion von Or67d ORNs auf eine hohe Dosis von c VA von ~ 40 7 -> 200 Spikes / s 6 Darüber hinaus ist die ineffektive Abgabe von c VA mit konventionellen Verabreichungsmethoden wahrscheinlich auf falsch-negative Ergebnisse zurückzuführen, was zu der Interpretation führt, dass c VA allein nicht ausreicht, um Or67d ORNs 8 zu aktivieren. Diese Interpretation wurde später von einer anderen Studie mit einem Nahbereichs-Geruchslieferungsverfahren 9. Es ist daher imperaUm ein robustes Geruchsabgabesystem für die effektive Darstellung von Geruchsstoffen mit geringer Volatilität zu entwickeln.

Vor kurzem haben wir mehrere langkettige cutikuläre Fettsäuren als Liganden für Or47b ORNs identifiziert. Sie sind im Typ 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4) untergebracht. Unter den langkettigen Fettsäure-Geruchsstoffen fanden wir, dass Palmitoleinsäure als aphrodisiakales Pheromon wirkt, das die männliche Balz durch die Aktivierung von Or47b ORNs 1 fördert. Jedoch wurde in einer anderen Studie, die ein herkömmliches Geruchsverabreichungsverfahren verwendete, Methyllaurat gezeigt, um Reaktionen von Or47b-ORNs hervorzurufen, während Palmitoleinsäure keine Antwort hervorrief, wenn sie aus dem gleichen Abstand 10 präsentiert wurde . Im Vergleich zu c VA sind langkettige Fettsäuren noch weniger flüchtig, mit Dampfdrücken von weniger als 0,001 mmHg bei 25 ° C 11 . Die inhärent geringe Flüchtigkeit von langkettigen Fettsäure-Geruchsstoffen, die eine effiziente Darstellung der Antenne ausschließtKonventionelle Geruchsabgabesysteme, wahrscheinlich die falsch-negativen Ergebnisse 10 . Diese Inkonsistenz hebt die Unzulänglichkeit konventioneller Geruchsabgabesysteme bei der Präsentation von Geringmachter-Geruchsstoffen hervor. Es wurde zuvor gezeigt, dass die effektive Abgabe von Fliegen-Cuticular-Gerüchen eine enge Nähe zwischen der Geruchsquelle und dem Zielgewebe 6 erfordert. Um also die Wirkungen von biologisch aktiven Pheromonen vollständig zu charakterisieren, während man den Abstand, von dem sie wahrscheinlich von Fruchtfliegen in der Natur 12 , 13 angetroffen werden, imitiert, haben wir vereinbart, dass der minimalen Abstand in unserem Verfahren eine hohe Priorität eingeräumt werden muss.

Unsere Methode hat weitere Vorteile, einschließlich der Kompatibilität mit Standard-Elektrophysiologie Rigs und Techniken. Vorhandene Rig-Setups erfordern eine minimale Modifikation, um dieses Protokoll aufzunehmen, und die meisten SSR-Schritte erfordern nur geringfügige Anpassungen. DiesMacht unsere Technik für Forscher, die in SSR erfahren sind, leicht zugänglich. Darüber hinaus ermöglicht unsere Technik die Präsentation von geringen Volatilitätsgerüchen mit scharfem Einsetzen und Offset, Korrelation der Stimulusabgabe mit neuronaler Reaktion. Schließlich erleichtert das Hardware-Layout einen schnellen Austausch zwischen Duftkartuschen und beschleunigt die Datenerfassung über einen gewünschten Dosierungsbereich.

Wir beginnen mit der Überprüfung der Vorbereitung von Referenz- und Aufzeichnungselektroden, Adult Hemolymph-Like (AHL) -Lösung, Odorant-Patronen und dem entsprechenden Olfaktometer. Wir diskutieren dann die Vorbereitung der Palmitoleinsäure-Geruchslösungen, gefolgt von der Vorbereitung der Fliege zur Aufzeichnung. Wir betrachten die Kriterien für die Auswahl eines Trichoid-Sensillums, um die Positionierung der Odoranzpatrone aufzuzeichnen und genauer zu untersuchen, bevor repräsentative Daten, die mit dieser Methode gewonnen wurden, präsentiert werden. Schließlich schließen wir durch die Erforschung nützlicher Anwendungen dieser techniqUe, einige begegnete Probleme und ihre Lösungen.

Protocol

1. Vorbereitung der Hardware für at4 Aufnahme Zur Herstellung von Elektroden mit Aluminosilikatglas-Kapillaren (OD 1,0 mm, ID 0.64 mm) ein Pipetten-Puller-Instrument verwenden. Stumpfen Sie die Spitze der Referenzelektrode leicht mit einem Paar feiner Pinzette, um das Einsetzen in den Clypeus der Fliege zu erleichtern ( dh eine abgerundete Platte an der Vorderseite des Fliegenkopfes, über den Mundstücken). HINWEIS: In dieser Studie wurden 7 Tage alte WT-Männer (Berlin) verwendet. Verwenden…

Representative Results

Unsere Technik wurde erfolgreich angewendet, um die relative Wirksamkeit der trans ( Abbildung 5A ) gegenüber cis ( Fig. 5B ) Isomeren der Palmitoleinsäure zu bestimmen. Unsere repräsentativen Daten zeigen, dass trans- Palmitoleinsäure ein effektiverer Ligand für Or47b-ORNs im Vergleich zur cis- Isoform ist ( Abbildung 5C ). Ein einzelnes Neuron wurde von jed…

Discussion

Hier haben wir ein Verfahren beschrieben, mit dem die Reaktionen von Or47b ORNs auf Palmitoleinsäure robust induziert und aufgezeichnet werden können. Wir haben eine herkömmliche Langstrecken-Geruchsabgabemethode 2 , 7 , 10 modifiziert , um das Problem der unzureichenden Pheromon-Geruchsabgabe zu beheben. Wir haben das Problem der geringen Geruchsbelastung angesprochen, indem wir die Verbindung über Odorantpatron…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Ye Zhang für die Hilfe mit den Musterspuren und Tin Ki Tsang für die Hilfe mit den Bildern. Diese Arbeit wurde von einem Ray Thomas Edwards Foundation Early Career Award und einem NIH Grant (R01DC015519) an C.-YS und NIH Zuschüsse (R01DC009597 und R01DK092640) an JWW unterstützt

Materials

Prep Setup & Miscellaneous Materials
Pipette Puller Instrument  Sutter Instruments
Novato CA USA
P97 Pipette Puller
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments
Sarasota FL USA
1B100F-4 to make holding rods
Aluminosilicate Glass Capillaries  Sutter Instruments
Novato CA USA
AF100-64-10 to make electrodes
Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific
Pittsburgh PA USA
12-550-143 for fly-prep station
Permanent Double Sided Tape Scotch
St. Paul MN USA
NA for fly-prep station
Upright microscope Olympus
Shinjuku Tokyo Japan
BX51 for recording rig
Plastalina modeling clay Van Aken
North Charleston SC USA
B0019QZMQQ for prep station and to stablize the holding rod
Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm Nalgene
Rochester NY USA
#156-4045 to sterilize AHL solution
Name Company    Catalog Number Comments
Cartridge Materials    
200 µL pipette tip  VWR
Radnor PA USA
53508-810 to make odor cartridges and fly prep
Filter Paper Whatman
Maidstone Kent UK
740-E to make odor cartridges 
Vacuum Desiccator  Cole-Parmer
Vernon Hills IL USA
VX-06514-30 to vaporize ethanol solvent
Name Company    Catalog Number Comments
Odorant Materials    
cis-palmitoleic acid Cayman Chemical
Ann Arbor MI USA
#10009871 (CAS # 373-49-9) Or47b odorant
trans-palmitoleic acid Cayman Chemical
Ann Arbor MI USA
#9001798 (CAS # 10030-73-6) Or47b odorant
Ethanol Spectrum Chemical MFG. 
New Brunswick NJ USA
E1028-500MLGL to dilute palmitoleic acid 
Name Company    Catalog Number Comments
Rig Setup Materials    
Odorant Cartridge Micromanipulator Siskiyou
Grants Pass OR USA
MX130R to position the olfactometer
Flow Vision software  Alicat
Tuscon AZ USA
FLOWVISIONSC software to control flow rate
Mass Controller Alicat
Tuscon AZ USA
MC-2SLPM-D to control the flow rate for humidified air
Mass Controller Alicat
Tuscon AZ USA
MC-500SCCM-D to control the flow rate for odor stimulation
Clampex Molecular Devices
Sunnyvale CA USA
Ver. 10.4 Data acquisition software
Air delivery tube Ace Glass
Vineland NJ USA
8802-936  to deliver humidified air
50x objective lens  Olympus
Shinjuku Tokyo Japan
LMPLFL50X recording rig
Clampfit 10 Molecular Devices
Sunnyvale CA USA
Ver. 10.4 software for spike analysis 
Igor Pro 6 WaveMetrics
Lake Oswego OR USA
Ver. 6.37 software for data analysis 
Audio Monitor ALA Scientific Instruments
Farmingdale NY USA
NPIEXB-AUDIS-08B Aurally reports individual spikes
Extracellular Amplifier ALA Scientific Instruments
Farmingdale NY USA
NPIEXT-02F to increase the amplitude of electrical signals
Valve Controller Warner Instruments    VC-8 to control the opening of the valve for odor stimulation
Recording Electrode Micromanipulator Sutter Instruments
Novato CA USA
MP-285 to position recording electrode
Headstage Amplifier ALA Scientific Instruments
Farmingdale NY USA
EQ-16.0008 to increase the amplitude of electrical signals
Oscilloscope Tektronix
Beaverton OR USA
TDS2000C Visual report of individual spikes

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Ng, R., Lin, H., Wang, J. W., Su, C. Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility. J. Vis. Exp. (125), e56147, doi:10.3791/56147 (2017).

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