이 프로토콜 매핑 사전 mRNA 3′ 최종 사이트를 처리 하는 방법을 설명 합니다.
지난 10 년간에서 연구 사전 mRNA 절단, polyadenylation 반응의 복잡 하 고 동적인 다양 한을 밝혀졌다. 반면 확산 셀 우선적으로 표현 하는 성적 증명서와 함께 짧은 3′ Utr mRNAs 긴 3′ 번역 되지 않은 영역 (Utr) 차별화 된 세포에서 생성 됩니다. A-seq 프로토콜 polyadenylation 사이트 게놈 넓은 고 사전 mRNA 3′ 끝 처리의 규칙을 공부 하기 위해 개발 되었다 그것의 두 번째 버전에서 설명 합니다. 또한이 현재 프로토콜 활용 polyadenylate (poly(A)) 꼬리 완전히 처리 된 mRNAs에 대 한 풍부 하 대부분 포유류 mRNAs의 속은 동안 추가 됩니다. 4 위치에 deoxyuracil와 DNA 어댑터의 mRNA 3′ 끝 조각 시퀀싱에 대 한 정확한 처리 수 있습니다. 세포 배양과 하룻밤 ligations, 포함 하 여 아닙니다 프로토콜에는 약 8 h 실습 시간이 필요합니다. 그것은, 함께 파생된 시퀀싱 데이터의 분석을 위한 사용 하기 쉬운 소프트웨어 패키지를 제공 됩니다. A seq2 및 관련된 분석 소프트웨어 제공 사전-mRNA 3’의 매핑 하는 효율적이 고 신뢰할 수 있는 솔루션 10에서 조건의 넓은 범위에서 끝나는6 또는 적은 셀.
캡처 및 mRNA 3′ 끝의 연속 mRNA 처리의 연구 및 유전자 발현의 정량화를 허용 한다. 때문에 그들의 많은 꼬리, 진 핵 mRNAs 수 효율적으로 정화 구슬 움직일 올리고-deoxythymidine (oligo(dT)) 분자, cDNA 합성 프라임도 수는로 총 세포 lysates에서. 그러나,이 방법은 두 가지 단점이 있다. 첫째, a의 성적을 내부 뻗어 cDNA 합성, 가짜 많은 사이트 결과 프라임 또한 수 있습니다. 두 번째, 균질 많은 뻗어 시퀀싱, 제외 되지 않는 사본 식별에 대 한 정보에 대 한 구체적인 과제를 포즈. 다양 한 방법을 통해 많은 반전 녹음 방송 등 이러한 제한을 우회 하 제안 되었습니다 꼬리 뒤에 RNase H 소화 (3 P-seq 1), 20에서 끝나는 사용자 지정 시퀀싱 뇌관의 사용 Ts (2 P-seq 2)의 미리 RNase H 소화 (3′ 읽기 3), 그리고 머리 핀 (A-seq 4)에서 3′ 어댑터 포함 된 oligo dT 뇌관의 사용 다음 CU5T45 뇌관 50 개 이상의 뉴클레오티드의 많은 꼬리와 RNA 파편.
최근에 개발 된 A seq2 방법 5 시퀀싱 및 어댑터, 특히 발생의 각자 결 찰에 의해 생성 되는 이합체의 비율을 최소화 하기 위해 동시에 많은 통해 우회를 목표로 때 어댑터의 어 금 니 농도 삽입 농도를 보다 큽니다. 두 어댑터는 동일한 유형의 polynucleotide 끝 A-seq2, 후 반전 녹음 방송 RNA 조각과 cDNAs의 5′ 끝에 5′ 어댑터의 5′ 끝에 3′ 어댑터는 출혈 하는 어디에서 출혈 하는 경우에이 문제를 제거할 수 있습니다. 방법은 우리의 이전 제안된 A seq-는 5′-3 시퀀스는 보다 더 편리 하 게 ‘ 그로 인하여 정확 하 게 요구 하는 방향 제어 RNA 조각-, 많은 사이트 확인의 높은 정확도 유지 하면서. 전형적인 샘플에서 시퀀스 읽기의 약 80% 고유는 게놈 지도 고 20000 이상의 많은 사이트 클러스터와 주석 3’ Utr는 중복의 70% 이상의 식별.
간단 하 게, A seq2 프로토콜 mRNA 조각화 및 역 보수 3′ 5′ RNA 파편의 끝에 어댑터의 결 찰으로 시작합니다. 폴 리 (A)-포함 된 RNAs는 다음 역 3′ 끝, 위치 4에서 뒤 끝에 5′, biotin에 앵커 뉴클레오티드를 포함 하는 25 뉴클레오티드 (nt) 긴 oligo(dT) 뇌관 복사할 자기 streptavidin 구슬에 cDNA의 바인딩 허용. 뇌관, biotin, 등의 대부분 사용자 효소 혼합, Uracil DNA glycosylase (UDG)와 DNA glycosylase lyase Endonuclease VIII를 포함 하 여 분열 뒤에 여는 cDNA에서 제거 됩니다. 이 반응 후 분열 남아 많은 꼬리의 위치를 표시 하는 5′ 어댑터, 그리고 3 Ts 왼쪽의 결 찰에 대 한 그대로 끝 나뭇잎. 5’과 3′ 어댑터 받는 사람 5′ 끝에 결 찰에 의해 연결 된 때문에 아무 어댑터 이합체 생성 됩니다. 4 개의 뉴클레오티드 무작위-메 읽기의 시작 부분에 도입-의 상태–예술 시퀀싱 악기 클러스터 해상도 허용 하 고 또한 검색 및 제거의 PCR 증폭 유물에 대 한 독특한 분자 식별자 (우미) 될 수 있습니다. 다른 연구 6일 우미의 크기 더 늘릴 수 있습니다. 프로토콜 생성 mRNA 3′ 끝, 모든 무작위 tetramer 3 Ts. 처리는 그들의 5′ 끝 시작의 PCR 증폭 유물에 의해 교정에 3 진단 Ts 읽기의 뒤와 시작에 무료 리버스는 읽기 악용 하는 Umi, 3′ 어댑터 시퀀스의 제거 및 보완성을 역방향. 내부 A-풍부한 사이트에서 oligo(dT) 못쓰게에서 발생 할 수 읽기 또한 컴퓨터로 확인 하 고 삭제. 가짜 사이트는 일반적으로 하나 잘 특징 18의 부족 고 되어야 보존된 많은 신호 명백한 분열 사이트 7~ 21 뉴클레오티드 상류.
프로토콜 세포 배양과 하룻밤 ligations 안 세 약 8 h 실습 시간에 필요 합니다. 관련 된 읽기 분석 소프트웨어를 사용 하면 매우 정확 하 게 많은 사이트 확인. 많은 사이트에서 클러스터 추가이 원고 (제어 siRNA와 si HNRNPC 대우 셀의 두 생물 학적 복제) 84% 중복, 주석이 달린된 유전자와 이들의 75%와 3′ UTR, 중복 및 중 86%에서 강조 4 샘플을 기반으로 생성 한 3′ UTR 또는 터미널 exon입니다. 피어슨 상관 계수는 복제 예제에 3′ 끝의 표현의 0.92, 이며 0.9의 값 일반적으로 방법으로 얻을 수 있습니다. 따라서, A seq2 재현성 결과 제공 하는 편리한 방법입니다.
핵심 및 보조 요인 사전 mRNA 3′ 끝 처리에 관련 된 수많은 대응 하 게 복잡 한 polyadenylation 풍경에 반영 됩니다. 또한, polyadenylation 녹음 및 접합 등 다른 프로세스에 있는 변화에 반응 이기도합니다. 사전-mRNAs에 3′ 끝 분열 사이트는 일반적으로 5′ 분열 제품에 추가 된 특성 많은 꼬리에 따라 식별 됩니다. 대부분의 방법은 사용 폴 리 (A)의 특정 변환을 허용 하는 가변 길이의 oligo(dT) 뇌관-반전 녹음 방송 반응에서 cDNAs mRNAs를 포함. 이 방법의 일반적인 문제는 A 풍부한 시퀀스 artifactual 분열 사이트 결과에 내부 못쓰게. 샘플 준비의 단계에서이 유물을 우회 하는 것을 목표로 하는 두 가지 방법이 제안 되었습니다. 3 P-seq 방법 1, 어댑터는 특히 부분 RNase T1 소화 및 유일한 deoxynucleotide로 반응에서 TTP와 반전 녹음 방송 부 목 oligo의 도움으로 많은 꼬리의 끝에 출혈 됩니다. 결과 poly(A)-poly(dT) heteroduplexes 다음 RNase H로 소화 하 고 나머지 RNA 파편 절연, 어댑터, 출혈 및 시퀀스. 간단 하 고 우아한 방법, 2 P-seq, 시퀀싱 반응에서 나머지 oligo(dT) 스트레치 2동일한 저자 의해 보고 되었다 건너뛰는 사용자 지정 시퀀싱 뇌관을 사용 하. 관련 방법에서 3′ 읽고 3, 5의 비정상적으로 긴 뇌관 우리와 45도는 비오 틴을 포함 하는 Ts 조각난된 RNA, 50 개 이상의 뉴클레오티드의 많은 꼬리와 RNA 분자에 대 한 선택에 엄격한 세척 뒤에 단련. 3′ 읽기 대폭 줄여 내부 못쓰게의 주파수, 그것은 완전히 제거 하지 그것 3. 또한 직접 RNA 시퀀싱에 대 한 프로토콜 제안 되었습니다, 하지만 결과 읽기 짧은 오류의 높은 비율을가지고 고이 접근 하지 않은 추가 개발된 18,,1920. PolyA Seq와 상용화 양의 Seq 프로토콜 기반 oligo(dT) 못쓰게 cDNA 두 번째 가닥 종합 20임의의 못쓰게 단계를 결합 한다. 서식 파일 스위치 반전 녹음 방송 반응 역전사 Moloney Murine 백혈병 바이러스 (MMLV)와 함께 사용 단일 단계에서 링커 cDNAs의 세대를 리드 하 고 그로 인하여 아무 어댑터 이합체는 파-Seq 및 SAPAS 메서드에 나타날 수 있습니다. 21 , 22.
A seq2 메서드 여기 biotinylated oligo(dT) 뇌관 내 쪼갤 뉴클레오티드 (뒤)의 그것의 사용에서 밖으로 서 제시. 이 수정 결합 풍부 때 교배 하는 oligo(dT), polyadenylated 라이브러리를 준비 하기 전에 격리 된 조각에서 올리고 (dT)25 시퀀스의 대부분의 제거와 대상과 3 ts, 보존의 유틸리티는 많은 꼬리의 이전 존재를 나타냅니다. 반면, RNase H 임의로 많은 RNA 분자에서 제거를 사용 하는 방법을 여러 가지로 둡니다. A-seq2, 시퀀싱 방지 감각 가닥의 3′ 끝에서 이루어집니다, 이후 분열 사이트를 원시 시퀀스 읽기의 시작 부분에 NNNNTTT 모티브 후 예상 됩니다. 무작위 tetramers PCR 증폭 유물의 제거에서 뿐만 아니라 호출 기본 허용 뿐만 아니라 제공 합니다. 더 이상 Umi 또한 가질 수 있습니다. 내부 못쓰게 가능성 A seq2에 남아 및 계산 해결, 먼저 3’를 삭제 하 여 genomically 인코딩, A 부유한 다운스트림 순서 그리고 3’에서 내부 못쓰게에 의해 설명 될 수 있는 최종 클러스터를 삭제 하 여 종료 합니다 자체 A 풍부한 많은 신호. 프로토콜의 많은 수에 의해 고유 하 게 유추 하는 많은 사이트의 최근 분석 A seq2에 고유한 사이트 예상된 뉴클레오티드 유통 및 유전자, 다른 3’와 비슷한 내 위치 시퀀싱 프로토콜을 종료 했음을 나타냅니다.
A seq2에서 중요 한 단계는 polyadenylated RNA의 선택과 리보솜 RNAs 및 다양 한 작은 RNAs의 제거. 이것은 가장 쉽게 올리고 (dT)25 자석 구슬 가진 mRNA 격리 키트에 의해 이루어집니다. 원칙적으로, 총 RNA 격리 솔루션을 또한 포함 하는 페 놀과 고품질 대상이 될 수 있는 추가 선택에 mRNA-절연 키트 또는 올리고 (dT) agarose RNA를 제공 합니다. A seq2에 변화 될 수 있는 단계 단축 하거나 다양 한 크기의 RNA 파편을 얻을 수 확장 될 수 있는 알칼리 가수분해와 치료입니다. 중요 한 많은 중 합 효소에 의해 RNA 파편의 3′ 끝에 3′ dATP의 추가 효율적 이기도 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜에이 치료는 동안을 피하기 위해 concatemerization 결 찰 반응 모든 RNA 조각에 적용 됩니다. 마지막으로, 우리는 주의 RNA 리가 1은 일반적으로 RNA 리가로 사용 됩니다, 그것은 또한 ligates 효율적으로 단 하나 좌초 된 DNA, 우리 선 cDNA 분자의 5′ 끝에 어댑터를 여기 다.
따라서, A seq2 효율적이 고 사전 mRNA 3′ 끝 처리 사이트의 식별을 위한 프로토콜을 구현 하기 쉬운 이다. 향후 개발 더 필요한 자료의 양과 프로토콜의 복잡성을 포함할 수 있습니다. 전산 데이터 분석 도구를 더 관련 된 세트의 3′ 끝 읽기 다양 한 프로토콜 얻은 시퀀싱 균질 처리 가능
The authors have nothing to disclose.
저자는 세포 배양에 대 한 부인 베아트리스 Dimitriades 감사합니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 교부 금 #31003A_170216 및 51NF40_141735에 의해 지원 되었다 (NCCR RNA & 질병).
Materials | |||
Agarose, ultra pure | Invitrogen | 16500-500 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
Cordycepin triphosphate (3’ dATP) | SIGMA | C9137 | |
DNA low bind vials, 1.5 ml | Eppendorf | 22431021 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA | D8637 | |
Dynabeads mRNA-DIRECT Kit | Ambion | AM61012 | |
GR-Green dye | Excellgen | EG-1071 | use 1:10,000 dillution |
HiSeq 2500 or NextSeq 500 next generation sequencers | Illumina | inquire with supplier | |
KAPA HiFi Hotstart DNA polymerase mix | KAPA/Roche | KK2602 | |
Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
Poly(A) polymerase, yeast | Thermo Fisher Scientific | 74225Z25KU | |
Poly(A) polymerase, E.coli | New England Biolabs | M0276L | |
Polynucleotide kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0032 | |
QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
RNA ligase 1, high concentration | New England Biolabs | M0437M | includes PEG-8000 |
RNeasy MinElute RNA Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
RNase H | New England Biolabs | M0279 | |
RNasin Plus, ribonuclease inhibitor | Promega | N2618 | |
Superscript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientiific | 18090050 | |
Turbo DNase | Ambion | AM2238 | |
USER enzyme mix | New England Biolabs | M5505 | |
Dyna-Mag-2 magnetic rack | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Heated mixer with heated lid |
MicroSpin columns | GE-Healthcare | 27-5325-01 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Buffers | |||
Alkaline hydrolysis buffer, 1.5 x | Mix 1 part 0.1 M Na2CO3 and 9 parts 0.1 M NaHCO3. Add EDTA to 1 mM. Adjust pH to 9.2. Store aliquots at -20 °C. | ||
5x poly(A) polymerase buffer | Thermo Fisher Scientiific | 100 mM Tris-HCl, pH 7.0, 3 mM MnCl2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mg/ml acetylated BSA, 50% glycerol | |
Biotin binding buffer | 20 mM TrisCl pH 7.5, 2 M NaCl, 0.1% NP40 | ||
TEN buffer | 10 mM TrisCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.02% NP40 | ||
Name | Company | Catalog Number | Sequence |
Oligonucleotides according to Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kits, for GA-IIx and Hiseq2000/2500 sequencers | Microsynth | ||
revRA3 (RNA) | Microsynth | 5’ amino CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA 3’ | |
revDA5 | Microsynth | 5’ amino GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3’ | |
Bio-dU-dT25, RT primer | Microsynth | 5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3' (V = G, A or C) | |
PCR primer forward, RP1 | Microsynth | 5' AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTC CGA 3' | |
PCR primer reverse, RPI1, barcode in bold | Microsynth | 5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA TCGTGATGTGACTGGAGTTCCTTG GCACCCGAGAATTCCA 3' | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Oligonucleotides according to Illumina TruSeq HT-Small RNA Sample Prep Kits, for HiSeq2000/2500 and NextSeq500 sequencers | |||
HT-rev3A (DNA/RNA) | Microsynth | 5'-amino-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT CTTCCrGrAUrC-3' | |
HT-rev5A | Microsynth | 5' amino-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT TCCGATCTNNNN 3' | |
Bio-dU-dT25, RT primer | Microsynth | 5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3' | |
PCR primers forward (D501-506) | Microsynth or Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACAC GACGCTCTTCCGATCT -3' | |
PCR primers reverse (D701-D712) | Microsynth or Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3' | |
Documentation for Illumina multiplexing: | Illumina | https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf |