ويصف هذا البروتوكول طريقة لرسم الخرائط مرناً قبل 3 ‘ نهاية تجهيز المواقع.
وأظهرت الدراسات في العقد الماضي مجموعة متنوعة معقدة ودينامية مرناً قبل الانقسام وردود الفعل بوليادينيليشن. مرناس مع مناطق 3 ‘أهمل طويلاً (تحيلها) يتم إنشاؤها في الخلايا المتمايزة حين تكاثر الخلايا تفضيلي التعبير عن النصوص مع قصيرة 3’ تحيلها. ونحن تصف البروتوكول A seq، الآن في نسخته الثانية، التي وضعت خريطة مواقع بوليادينيليشن على نطاق الجينوم ودراسة تنظيم مرناً قبل 3 ‘ نهاية المعالجة. كما يستفيد هذا البروتوكول الحالي من بوليادينيلاتي (ذيول poly(A)) التي يتم إضافتها أثناء نشوء حيوي لمعظم الثدييات مرناس لإثراء مرناس المجهزة تماما. محول الحمض النووي مع ديوكسيوراسيل في موقفها الرابعة تسمح معالجة دقيقة مرناً 3 ‘ نهاية الأجزاء للتسلسل. لا بما في ذلك زراعة الخلايا وليجيشنز بين عشية وضحاها، يتطلب البروتوكول وقت التدريب العملي على ح حوالي 8. جنبا إلى جنب معها، يتم توفير حزمة برامج سهلة الاستخدام لتحليل البيانات المشتقة من التسلسل. A-seq2 والبرامج المرتبطة بها تحليل توفر حلاً فعالة وموثوق بها للتعيين من قبل-مرناً 3 ‘ ينتهي في طائفة واسعة من الظروف، من 106 أو خلايا أقل.
التقاط وتسلسل مرناً 3 ‘ ينتهي يتيح دراسة تجهيز مرناً والتحديد الكمي للتعبير الجيني. سبب ذيولها poly(A)، مرناس التوكسينات يمكن أن تكون كفاءة تنقيته من ليساتيس خلية الإجمالي مع المعطل تداولها حبة اليغو-ديوكسيثيميديني (oligo(dT)) الجزيئات، التي يمكن أيضا أن رئيس الوزراء كدنا التوليف. بيد أن هذا النهج قد اثنين من العوائق. أولاً، يمكن أن تمتد من أ أن تكون داخلية للنصوص أيضا رئيس الوزراء توليف كدنا، أسفر عن مواقع زائفة poly(A). Poly(A) الثاني، ومتجانسة تمتد تحديات محددة للتسلسل، إلى جانب كونها غير مفيدة لتحديد نص. قد اقترحت نهوج مختلفة للتحايل على هذه القيود، مثل النسخ العكسي عن طريق poly(A) ذيول تليها “ح رناسي” الهضم (ف 3-seq 1)، استخدم من التمهيدي تسلسل مخصص المنتهي في 20 Ts (seq 2 ف- 2)، الاختيار الأولى من الأجزاء رنا مع ذيول poly(A) النيوكليوتيدات ما يزيد على 50 مع تمهيدي45 CU5T متبوعاً بالهضم “ح رناسي” (ما يلي: 3 ‘ 3)، واستخدام اليغو-dT التمهيدي الذي يحتوي على محول 3′ في دبوس (seq أ 4).
الأسلوب A-seq2 5 وضعت مؤخرا يهدف إلى تجاوز التسلسل عن طريق poly(A) وفي نفس الوقت تقليل نسبة dimers التي يتم إنشاؤها بواسطة ربط الذاتي لمحولات، خاصة التي تحدث عند تركيز مولى للمحولات يفوق تركيز إدراج. ويمكن القضاء على هذه المشكلة عندما تكون متصلة كلا محولات لنفس النوع من نهايات بولينوكليوتيدي كما هو الحال في أ-seq2، أين هي متصلة المحولات 3 ‘إلى 5’ نهاية الأجزاء رنا والمحولات 5 ‘إلى 5’ ينتهي كدناس بعد النسخ العكسي. الأسلوب أكثر ملاءمة من أعمالنا المقترح سابقا A-seq-التي كان تسلسلها في 5 ‘-إلى-3’ التحكم في اتجاه مما يتطلب تحديداً الحمض النووي الريبي التجزؤ-، مع الحفاظ على درجة عالية من دقة في تحديد موقع poly(A). حوالي 80% من ما يلي التسلسل في عينات نموذجية خريطة فريدة للجينوم وتؤدي إلى كشف هوية من 20,000 أكثر مجموعات الموقع poly(A)، أكثر من 70% من أي تداخل مع المشروح 3 ‘ تحيلها.
وباختصار، يبدأ البروتوكول A-seq2 مع تجزئة مرناً وربط محولات عكس-تكملة 3 ‘إلى 5’ نهايات الأجزاء رنا. بولي (A)-تحتوي على الكشف ثم يتم عكس نسخها مع تمهيدي oligo(dT) طويلة النوكليوتيدات 25 (nt) يحتوي النوكليوتيدات مرساة في نهاية 3 ‘، من دو في موقف 4 وبيوتين في 5’ نهاية، يسمح ملزمة لكدنا الخرز streptavidin المغناطيسي. تتم إزالة معظم التمهيدي، بما في ذلك البيوتين، من كدنا قبل الانقسام في دو بمزيج الإنزيم المستخدم، التي تحتوي على “الحمض النووي اليوراسيل” glycosylase (UDG) و “الثامن اندونوكلياسي” جليكوسيلاسي لياز الحمض النووي. رد الفعل هذا يترك نهايات سليمة لربط محول 5 ‘، واليسار إتس الثلاثة بعد انشقاق تبقى لوضع علامة على موقع الذيل poly(A). لكل 5 ‘3’ المحولات ومرفقه بربط للمستلم 5 ‘ الغايات، يتم إنشاء لا dimers محول. يسمح قرار الكتلة في تسلسل الدولة من أحدث الصكوك الأربعة النوكليوتيدات عشوائية-أسعار الصرف السوقية قدم في بداية ما يلي: ويمكن أيضا بمثابة المعرف الفريد الجزيئية (أومي) لكشف وإزالة الآثار التضخيم PCR. يمكن زيادة حجم أومي كما فعلت في دراسات أخرى 6. ينشئ البروتوكول بما يلي: أن يتم عكس مكملة مرناً 3 ‘ينتهي، كل شيء بدءاً من تيترامير معشاة ذات شواهد تليها 3 Ts-تجهيز من القراءات التي لها للملخص التشخيصي 3 في نهاية يبدأ 5’ مع تصحيح PCR التضخيم التحف استغلال أميس، إزالة 3 ‘ تسلسل محول، وعكس التكامل. أيضا تحديد حسابياً القراءات التي قد تكون قد نشأت من فتيلة oligo(dT) الداخلية الغنية بالمواقع والتخلص منها. المواقع الزائفة التي تفتقر عموما إلى واحد من 18 تتسم جيدا وإشارات حفظت poly(A) الذي ينبغي أن يقع النيوكليوتيدات ~ 21 المنبع من موقع الانقسام الظاهر 7.
يتطلب البروتوكول وقت التدريب العملي على ح حوالي 8، لا عد زراعة الخلايا وليجيشنز بين عشية وضحاها. المرتبطة بها قراءة تحليل البرمجيات تمكن من تحديد موقع poly(A) درجة عالية من دقة. من موقع poly(A) إنشاء مجموعات استناداً إلى عينات 4 كذلك والضوء على هذه المخطوطة (اثنان replicates البيولوجية siRNA التحكم وخلايا سي-هنرنبك-تعامل) 84% التداخل مع جينات مشروح، وهذه، 75% من التداخل مع 3 ‘ UTR، 86% أما مع 3 ‘ UTR أو إكسون المحطة طرفية. معامل ارتباط Pearson للتعبير عن 3 ‘ ينتهي في عينات تكرار 0.92، وعادة ما يتم الحصول على قيم من خلال 0.9 مع الأسلوب. وهكذا، A-seq2 هو أسلوب مناسب يعطي نتائج جداً استنساخه.
العديد من الموارد الأساسية والعوامل المساعدة التي تشارك في تجهيز مرناً قبل 3 ‘ نهاية تتجلى في المناظر الطبيعية معقدة في المقابل بوليادينيليشن. بالإضافة إلى ذلك، بوليادينيليشن أيضا استجابة للتغيرات في العمليات الأخرى مثل النسخ والربط. 3 ‘نهاية الانقسام في مرناس قبل هي عادة تحديد مواقع استناداً إلى ذيول poly(A) المميزة التي يتم إضافتها إلى المنتجات انشقاق 5’. استخدام معظم وسائل الإشعال oligo(dT) الأطوال المتغيرة التي تسمح التحويل المحددة من بولي (أ)-تتضمن مرناس إلى كدناس في رد فعل نسخ عكسي. مشكلة شائعة لهذا النهج فتيلة الداخلية إلى تسلسل A الغنية نتج عنه انشقاق artifactual المواقع. وقد اقترحت اثنين من الأساليب التي تهدف إلى التحايل على هذه القطع الأثرية في مرحلة إعداد عينة. في أسلوب seq ف 3- 1، على وجه التحديد هي متصلة محولات لينتهي ذيول poly(A) مع مساعدة من اليغو جبيرة تليها الجزئي T1 رناسي الهضم والنسخ العكسي مع TTP في رد الفعل ديوكسينوكليوتيدي فقط. ثم يتم هضمها هيتيرودوبليكسيس poly(A)-poly(dT) الناتج مع “ح رناسي” والأجزاء رنا المتبقية هي معزولة ومتصلة لمحولات ومتسلسلة. طريقة بسيطة وأنيقة، ف 2-seq، يستخدم تسلسل مخصص التمهيدي تخطي وأبلغت تمتد oligo(dT) المتبقية في رد فعل تسلسل المؤلف نفسه 2. في أسلوب ذات صلة، 3 ‘ يقرأ 3، التمهيدي طويلاً على نحو غير عادي من 5 لنا و 45 واتس، التي تتضمن أيضا بيوتين هو تعتيق للجيش الملكي النيبالي مجزأة، تليها يغسل صارمة لتحديد لجزيئات الحمض النووي الريبي مع ذيول poly(A) النيوكليوتيدات ما يزيد على 50. على الرغم من أن يقرأ 3 ‘ تواتر فتيلة الداخلية يخفض بشكل كبير، فإنه لا تماما القضاء عليه 3. كما اقترحت بروتوكولات لتسلسل الحمض النووي الريبي مباشرة، ولكن القراءات الناتجة غير قصيرة ونسبة عالية من الخطأ وهذا النهج لم يكن كذلك نمواً 18،،من1920. بوليا-Seq والبروتوكولات Seq كوانت تجارياً ضم فتيلة oligo(dT) تقوم بخطوة فتيلة عشوائي لكدنا الثانية حبلا توليف 20. استخدام تبديل قالب رد فعل النسخ العكسي مع المنتسخة العكسية فيروس اللوكيميا مولوني موريني (مملف) يؤدي إلى توليد كدناس مع linkers في خطوة واحدة، ومما يمكن أن تظهر لا محول dimers Seq نظام تقييم الأداء وأساليب ساباس 21 , 22.
الأسلوب A-seq2 قدم هنا تبرز في استفادتها النوكليوتيدات كليفابل (dU) ضمن كتاب oligo(dT) بيوتينيلاتيد. يجمع هذا التعديل الأداة المساعدة لإثراء oligo(dT) المهجنة، بوليادينيلاتيد الأهداف مع إزالة معظم تسلسل25 اليغو (dT) من أجزاء معزولة قبل أن يتم إعداد المكتبات والحفاظ على الملخص الثلاثة، التي وتشير إلى وجود الذيل poly(A) السابقة. وفي المقابل، ترك الأساليب التي تستخدم “رناسي ح” لإزالة poly(A) من جزيئات الحمض النووي الريبي عشوائياً عدة كما. منذ في A-seq2، يتم تسلسل من 3 ‘ نهاية خيوط معنى المضادة، مواقع الانقسام ويتوقع أن تكون موجودة بعد عزر نننتت في بداية ما يلي تسلسل الخام. تيتراميرس معشاة ذات شواهد تخدم ليس فقط للسماح لقاعدة الدعوة بل أيضا في القضاء على بكر التضخيم التحف. كما يمكن أن تستوعب UMIs أطول. إمكانية فتيلة الداخلية لا تزال في seq2 أ ويتم معالجتها حسابياً، أولاً بتجاهل 3 ‘ينتهي مع تسلسل المتلقين للمعلومات المرمزة جينوميكالي، الغنية بألف ومن ثم طريق تجاهل 3’ نهاية الكتل التي يمكن أن تفسر فتيلة الداخلية في إشارة poly(A) الغنية بحد ذاتها. تحليل حديث للمواقع poly(A) الاستدلال فريد من خلال عدد كبير من البروتوكولات يشير إلى أن المواقع التي فريدة من نوعها إلى A-seq2 بتوزيع النوكليوتيدات المتوقعة وموقع داخل الجينات، مماثلة لغيرها 3 ‘ في نهاية تسلسل البروتوكولات.
هو خطوة حاسمة في seq2 بتحديد بوليادينيلاتيد الجيش الملكي النيبالي وإزالة الريباسي الكشف والكشف الصغيرة المختلفة. يتم ذلك بسهولة بمجموعة مرناً وعزل مع اليغو (dT)25 المغناطيسي الخرز. من حيث المبدأ، يعطي مجموع الجيش الملكي النيبالي معزولة مع الفينول الذي يحتوي على الحلول أيضا الجيش الملكي النيبالي التي يمكن أن تخضع لاختيار المزيد من طقم مرناً والعزل أو اليغو (dT) [اغروس] ذات جودة عالية. خطوة التي يمكن أن تختلف في seq2 أ هو العلاج مع التحلل القلوية التي يمكن اختصارها أو الموسعة للحصول على الأجزاء رنا ذات أحجام مختلفة. الحرجة أيضا إضافة 3 ‘داتب إلى 3’ نهايات الأجزاء رنا بوليميراز poly(A) بكفاءة. في البروتوكول هو موضح هنا، يتم تطبيق هذا العلاج على كافة الأجزاء رنا، لتجنب كونكاتيميريزيشن أثناء عملية التفاعل عملية ربط. وأخيراً، نلاحظ أنه على الرغم من أن الجيش الملكي النيبالي ليجاسى 1 يستخدم عادة ليجاسى الحمض النووي الريبي، فإنه أيضا ليجاتيس الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل كفاءة واحدة، كما فعلنا هنا سد محول إلى 5 ‘ نهاية الجزيئات كدنا.
وهكذا، A-seq2 فعالة وسهلة لتنفيذ البروتوكول المتعلق بتحديد مرناً قبل 3 ‘ نهاية تجهيز المواقع. ويمكن أن تشمل التطورات في المستقبل كذلك تقليل تعقيد البروتوكول وكمية المواد المطلوبة. تمكين مجموعة مرتبطة من أدوات تحليل البيانات الحسابية كذلك تجهيز 3 ‘ نهاية تسلسل ما يلي حصل مع طائفة واسعة من بروتوكولات متجانسة.
The authors have nothing to disclose.
يشكر المؤلفون السيدة بياتريس ديميترياديس للحصول على مساعدة خلية ثقافة. هذا العمل كان تدعمه “مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية” منح #31003A_170216 و 51NF40_141735 (الجيش الملكي النيبالي نككر & المرض).
Materials | |||
Agarose, ultra pure | Invitrogen | 16500-500 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
Cordycepin triphosphate (3’ dATP) | SIGMA | C9137 | |
DNA low bind vials, 1.5 ml | Eppendorf | 22431021 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA | D8637 | |
Dynabeads mRNA-DIRECT Kit | Ambion | AM61012 | |
GR-Green dye | Excellgen | EG-1071 | use 1:10,000 dillution |
HiSeq 2500 or NextSeq 500 next generation sequencers | Illumina | inquire with supplier | |
KAPA HiFi Hotstart DNA polymerase mix | KAPA/Roche | KK2602 | |
Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
Poly(A) polymerase, yeast | Thermo Fisher Scientific | 74225Z25KU | |
Poly(A) polymerase, E.coli | New England Biolabs | M0276L | |
Polynucleotide kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0032 | |
QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
RNA ligase 1, high concentration | New England Biolabs | M0437M | includes PEG-8000 |
RNeasy MinElute RNA Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
RNase H | New England Biolabs | M0279 | |
RNasin Plus, ribonuclease inhibitor | Promega | N2618 | |
Superscript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientiific | 18090050 | |
Turbo DNase | Ambion | AM2238 | |
USER enzyme mix | New England Biolabs | M5505 | |
Dyna-Mag-2 magnetic rack | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Heated mixer with heated lid |
MicroSpin columns | GE-Healthcare | 27-5325-01 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Buffers | |||
Alkaline hydrolysis buffer, 1.5 x | Mix 1 part 0.1 M Na2CO3 and 9 parts 0.1 M NaHCO3. Add EDTA to 1 mM. Adjust pH to 9.2. Store aliquots at -20 °C. | ||
5x poly(A) polymerase buffer | Thermo Fisher Scientiific | 100 mM Tris-HCl, pH 7.0, 3 mM MnCl2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mg/ml acetylated BSA, 50% glycerol | |
Biotin binding buffer | 20 mM TrisCl pH 7.5, 2 M NaCl, 0.1% NP40 | ||
TEN buffer | 10 mM TrisCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.02% NP40 | ||
Name | Company | Catalog Number | Sequence |
Oligonucleotides according to Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kits, for GA-IIx and Hiseq2000/2500 sequencers | Microsynth | ||
revRA3 (RNA) | Microsynth | 5’ amino CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA 3’ | |
revDA5 | Microsynth | 5’ amino GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3’ | |
Bio-dU-dT25, RT primer | Microsynth | 5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3' (V = G, A or C) | |
PCR primer forward, RP1 | Microsynth | 5' AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTC CGA 3' | |
PCR primer reverse, RPI1, barcode in bold | Microsynth | 5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA TCGTGATGTGACTGGAGTTCCTTG GCACCCGAGAATTCCA 3' | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Oligonucleotides according to Illumina TruSeq HT-Small RNA Sample Prep Kits, for HiSeq2000/2500 and NextSeq500 sequencers | |||
HT-rev3A (DNA/RNA) | Microsynth | 5'-amino-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT CTTCCrGrAUrC-3' | |
HT-rev5A | Microsynth | 5' amino-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT TCCGATCTNNNN 3' | |
Bio-dU-dT25, RT primer | Microsynth | 5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3' | |
PCR primers forward (D501-506) | Microsynth or Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACAC GACGCTCTTCCGATCT -3' | |
PCR primers reverse (D701-D712) | Microsynth or Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3' | |
Documentation for Illumina multiplexing: | Illumina | https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf |