Summary

Sequestri di Electroconvulsive in ratti e frazionamento dei loro ippocampi di esaminare grippaggio-indotto cambiamenti nella densità postsinaptica proteine

Published: August 15, 2017
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Summary

Sequestro di electroconvulsive (ECS) è un modello sperimentale animale della terapia electroconvulsive per la depressione grave. ECS globalmente stimola l’attività nell’ippocampo, che conduce a sinaptogenesi e plasticità sinaptica. Qui, descriviamo i metodi per induzione ECS in ratti e per frazionamento subcellulare dei loro ippocampi per esaminare le modifiche grippaggio-indotto proteine sinaptiche.

Abstract

Sequestro di electroconvulsive (ECS) è un modello animale sperimentale di terapia elettroconvulsiva, il trattamento più efficace per la depressione grave. ECS induce i grippaggi tonico-clonic generalizzati con bassa mortalità e morte neuronale ed è un modello ampiamente usato ai farmaci antiepilettici schermo. Qui, descriviamo un metodo di induzione ECS nel quale viene erogata una corrente di 55-mA breve per 0,5 s per uomo ratto 200-250 g di peso tramite elettrodi clip orecchio. Tale stimolazione bilaterale prodotto fase cloniche 4-5 che è durato circa 10 s. Dopo la cessazione dell’ECS acuta o cronica, maggior parte dei ratti ha recuperati per essere relativamente al comportamento indistinguibile da sham ratti “nessuna crisi”. Perché ECS eleva a livello globale l’attività cerebrale, è stato utilizzato anche per esaminare le alterazioni di attività-dipendente di proteine sinaptiche e loro effetti sulla forza sinaptica utilizzando più metodi. In particolare, frazionamento subcellulare della densità post-sinaptica (PSD) in combinazione con Western blotting consente la determinazione quantitativa dell’abbondanza di proteine sinaptiche presso questa struttura sinaptica specializzata. In contrasto con un precedente metodo di frazionamento che richiede grandi quantità di cervello del roditore, descriviamo qui un metodo di frazionamento su piccola scala per isolare il PSD da ippocampi di un singolo ratto, senza centrifugazione in gradiente di saccarosio. Utilizzando questo metodo, mostriamo che le frazioni isolate di PSD contiene proteine di membrana postsinaptica, tra cui PSD95, GluN2B e GluA2. Presinaptici marcatore synaptophysin e proteina citoplasmatica solubile α-tubulina sono stati esclusi dalla frazione PSD, dimostrando il successo isolamento PSD. Inoltre, ECS cronica diminuita espressione di GluN2B in PSD, che indica che il nostro metodo di frazionamento PSD su piccola scala può essere applicata per rilevare i cambiamenti nelle proteine PSD hippocampal da una singolo ratto dopo trattamenti genetici, farmacologici o meccanici .

Introduction

Terapia di Electroconvulsive è stata utilizzata per trattare pazienti con disturbi depressivi maggiori, tra cui grave depressione farmaco-resistenti, depressione bipolare, malattie di Parkinson e schizofrenia1,2. In questa terapia, il sequestro viene generato da stimolo elettrico consegnato alla testa dei pazienti anestetizzati via epicranica elettrodi1,2,3. Ripetitivo di ECS è stato clinicamente utile per i disturbi depressivi resistenti alla droga1,2,3. Tuttavia, l’esatto meccanismo alla base dell’efficacia a lungo termine dell’effetto antidepressivo in esseri umani è rimanere evasivo. ECS è un modello animale della terapia electroconvulsive ed è ampiamente utilizzato per studiare il meccanismo terapeutico. Nei roditori, ECS acuta sia cronico trattamento ECS promuovere neurogenesi adulta negli ippocampi e riorganizzare la rete neurale4,5, che rischia di contribuire al miglioramento della flessibilità cognitiva. Inoltre, global elevazione dell’attività cerebrale di ECS altera l’abbondanza delle trascrizioni, come un cervello derivato fattore neurotropo6e più proteine, tra cui metabotropici del glutammato recettore 17 e la N-metil-D-aspartato (NMDA) tipo glutammato recettore subunità7. Questi cambiamenti sono coinvolte nel mediare la modifica a lungo termine del numero di sinapsi, la struttura e la forza in ippocampo7,8,9.

Nei modelli ECS, stimolazione elettrica viene consegnata ai roditori tramite elettrodi impiantati stereotassicamente, elettrodi corneali o elettrodi auricolari per evocare i grippaggi tonico-clonic generalizzati10,11. Stereotassica impianto di elettrodi comporta un’operazione al cervello e richiede tempi significativi per migliorare le abilità chirurgica dello sperimentatore per minimizzare il danno. Meno invasivi elettrodi corneali potrebbero causare secchezza e abrasione corneale e richiede anestesia. L’uso di elettrodi clip orecchio ignora queste limitazioni perché può essere utilizzati su roditori senza chirurgia o anestesia e causare lesioni minime. Infatti, abbiamo trovato che corrente consegnati a sveglio ratti tramite clip orecchio elettrodi attendibilmente induce grippaggi tonico-clonic fase 4-5 e altera le proteine sinaptiche nel loro ippocampi10.

Per esaminare l’ECS indotte abbondanza di proteine sinaptiche nelle regioni specifiche del cervello dei roditori, è importante scegliere i metodi sperimentali che sono più adatti per la loro rilevazione e quantificazione. Frazionamento subcellulare del cervello consente l’isolamento grezza delle proteine citosoliche solubili; proteine di membrana; proteine dell’organello-limiti; e anche proteine in speciali strutture subcellulari, come ad esempio le PSD12,13,14. Il PSD è un dominio subcellulare denso e ben organizzato in neuroni in cui proteine sinaptiche sono altamente concentrati e vicino la membrana postsinaptica12,13,15. L’isolamento del PSD è utile per lo studio di proteine sinaptiche, arricchito il PSD, dal cambiamenti dinamici nell’abbondanza e nella funzione dei recettori postsinaptici del glutammato, ponteggi proteine e proteine di transduction del segnale nel PSD12 , 15 , 16 , 17 sono correlati con plasticità sinaptica e la synaptopathy osservata in diversi disturbi neurologici17,18. Un precedente metodo di frazionamento subcellulare utilizzato per purificare il PSD ha coinvolto l’isolamento della frazione detersivo-insolubili dalla frazione grezza della membrana del cervello tramite la centrifugazione differenziale di saccarosio gradienti14, 19. la grande sfida con questo metodo tradizionale è che richiede grandi quantità di roditore cervelli14,19. Preparazione dei roditori di 10-20 per isolare la frazione PSD per ogni trattamento richiede costi vasto e investimento di tempo e non è praticamente fattibile se ci sono molti trattamenti.

Per superare questa sfida, abbiamo adattato un metodo più semplice che direttamente consente di isolare la frazione PSD, senza saccarosio mediante centrifugazione in gradiente20,21e rivisto per essere applicabile all’isolamento PSD da ippocampi di un singolo ratto cervello. Il nostro metodo di frazionamento PSD su piccola scala produce circa 30-50 µ g di proteine PSD da 2 ippocampi, sufficiente per l’impiego in diversi saggi biochimici, tra cui immunoprecipitazione e Western blotting. Macchiarsi occidentale dimostra il successo del nostro metodo per isolare il PSD rivelando l’arricchimento della proteina di densità postsinaptica 95 (PSD-95) e l’esclusione di marcatore presinaptici synaptophysin e proteina citoplasmatica solubile α-tubulina. Nostra induzione ECS e metodi di frazionamento PSD su piccola scala sono facilmente adattabili ad altre regioni del cervello del roditore e consentono di valutare gli effetti di ECS sull’espressione di proteine PSD in modo relativamente semplice e affidabile.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali tra cui animali soggetti sono state approvate dal comitato di utilizzo presso la University of Illinois a Urbana-Champaign e istituzionali animali cura. 1. mantenere una colonia di ratto Allevare ratti Sprague-Dawley (Vedi la Tabella materiali) e mantenerli in condizioni standard con un ciclo luce-buio 12 h e ad libitum accesso a cibo e acqua. Svezzare i cuccioli di ratto al giorno postnatale (P) 28 e ospitarli in gruppi di 2…

Representative Results

Utilizzando la procedura dettagliata presentato qui, una scossa elettrica (55 mA, 100 impulsi/s per 0,5 s) consegnati tramite clip orecchio elettrodi indotti non ricorrenti fase 4-5 grippaggi tonico-clonic in ratti (Figura 1A-B). Un totale 8 di ratti ha ricevuto induzione ECS acuta e visualizzato grippaggi tonico-clonic fase 4-5. I grippaggi è durato circa 10 s e tutti i ratti hanno recuperati entro 1-2 min di cessazione di sequestro. Ratti …

Discussion

Qui, descriviamo un metodo di induzione ECS in ratti che suscita la stimolazione globale dell’attività neuronale in loro ippocampi. ECS è un modello animale di elettroshockterapia, che è clinicamente utilizzato per trattare disturbi depressivi refrattario droga in esseri umani1,2,3. Nonostante l’uso della terapia di electroconvulsive per trattare la depressione severa, il preciso meccanismo di fondo rimane poco chiaro. Perch?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano il Dr. Eric C. Bolton per averci permesso di utilizzare la centrifuga per frazionamento e Dr. Graham H. Diering nel laboratorio del Dr. Richard L. Huganir di John Hopkins University per averci fornito il protocollo su piccola scala per il frazionamento di PSD.

Materials

Spargue-Dawley rat Charles River Laboratories ECS supplies
A pulse generator Ugo Bsile, Comerio, Italy 57800 ECS supplies
MilliQ water purifying system EMD Millipore Z00Q0VWW Subcellular fractionation supplies
Sucrose Em science SX 1075-3 Subcellular fractionation supplies
Na4O7P2 SIGMA-ALDRICH 221368 Subcellular fractionation supplies
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) SIGMA-ALDRICH E9884 Subcellular fractionation supplies
HEPES SIGMA-ALDRICH H0527 Subcellular fractionation supplies
Okadaic acid TOCRIS 1136 Subcellular fractionation supplies
Halt Protease Inhibitor Thermo Scientific 78429 Subcellular fractionation supplies
NaVO3 SIGMA-ALDRICH 72060 Subcellular fractionation supplies
EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters Fisher Scientific SCGPS05RE Subcellular fractionation supplies
Iris Scissors WPI (World Precision Instruments) 500216-G Subcellular fractionation supplies
30 mm tissue culture dish Fisher Scientific 08-772B Subcellular fractionation supplies
Glass homogenizer and a Teflon pestle VWR 89026-384 Subcellular fractionation supplies
1.7 mL microcentrifuge tube DENVILLE SCIENTIFIC INC.  C2170 (1001002) Subcellular fractionation supplies
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge  Thermo Fisher 75004521 Subcellular fractionation supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL Thermo Fisher #23228 Western blot supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL Thermo Fisher #1859078 Western blot supplies
SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) BIO-RAD #4561086S Western blot supplies
Running Buffer Made in the lab Western blot supplies. 
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel BIO-RAD #1658004 Western blot supplies
Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane  Milipore IPVH00010 Western blot supplies
Transfer Buffer Made in the lab Western blot supplies. 
Tris-base Fisher Scientific BP152-1 Western blot supplies
Glycine Fisher Scientific BP381-5 Western blot supplies
Sodium dodecyl sulfate SIGMA-ALDRICH 436143 Western blot supplies
Methanol  Fisher Scientific A454-4 Western blot supplies
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 detergent for PSD isolation
Mini Trans-Blot Module  BIO-RAD #1703935 Western blot supplies
Nonfat instant dry milk Great value Western blot supplies
Multi-purposee rotator  Thermo Scientific Model-2314 Western blot supplies
Hyblot CL Autoradiography Film DENVILLE SCIENTIFIC INC.  E3018 (1001365) Western blot supplies
Enhanced chemifluorescence substrate  Thermo Scientific 32106 Western blot supplies
a Konica SRX-101A film processor KONICA MINOLTA SRX-101A Western blot supplies
Name of Antibody
PSD-95 Cell Signaling #2507 Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
Synaptophysin Cell Signaling #4329 Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
alpha-Tubulin Santacruz SC-5286 Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluN2B Neuromab 75-097 Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluA2 Sigma-aldrich Sab 4501295 Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
STEP Santacruz SC-23892 Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoReserch laboratory 715-035-150 Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoReserch laboratory 711-035-152 Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey

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Diesen Artikel zitieren
Jang, S., Jeong, H. G., Chung, H. J. Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins. J. Vis. Exp. (126), e56016, doi:10.3791/56016 (2017).

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