Summary

Reprogrammierung primäre Fruchtwasser und Membrane Zellen zur Pluripotenz in Xeno-freien Bedingungen

Published: November 27, 2017
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Reprogrammierung von primären amniotische Flüssigkeit und Membran mesenchymalen Stammzellen in induzierte pluripotente Stammzellen unter Verwendung eines nicht-Integration von episomal Ansatzes in vollem Umfang chemisch definierten Bedingungen. Verfahren der Gewinnung, Kultur, Neuprogrammierung und Charakterisierung der daraus resultierenden induzierten pluripotenten Stammzellen durch strenge Methoden werden detailliert beschrieben.

Abstract

Autologe zellbasierte Therapien bekam einen Schritt näher an der Realität mit der Einführung von induzierten pluripotenten Stammzellen. Fetaler Stammzellen, wie Fruchtwasser und Membran mesenchymale Stammzellen, stellen eine einzigartige Art von undifferenzierten Zellen mit Versprechen in Gewebe-Engineering und Reprogrammierung in iPSC für zukünftige pädiatrische Interventionen und Stammzell-banking. Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt ein optimiertes Verfahren zur Gewinnung und Kultivierung primäre amniotischen Flüssigkeit und Membran mesenchymalen Stammzellen und generiert episomal induzierte pluripotente Stammzellen aus diesen Zellen in vollem Umfang chemisch definierte Kultur Bedingungen, die Nutzung von menschlichen rekombinante Vitronectin und E8 Medium. Charakterisierung der neuen Linien durch die Anwendung strenger Methoden – Durchflusszytometrie, konfokale Bildgebung, Teratom Bildung und transkriptionelle profiling – wird ebenfalls beschrieben. Die neu erzeugten Linien auszudrücken Marker von embryonalen Stammzellen – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – wobei negativ für die SSEA-1-Markierung. Die Zelllinien bilden darum in scid-Beige Mäuse in ca. 6-8 Wochen und die darum enthalten Gewebe repräsentativ für alle drei Mikrobeschichten. Transkriptionelle Profilierung der Linien mit dem Absenden globalen Ausdruck Microarray Daten zu einem Bioinformatic Pluripotenz Bewertung Algorithmus als alle Linien pluripotenten und daher ist dieser Ansatz eine attraktive Alternative zu Tierversuchen. Die neuen iPSC-Linien können problemlos in nachgeschalteten Experimente mit der Optimierung von Differenzierung und Tissue Engineering verwendet werden.

Introduction

Die Technologie von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) bringt über mögliche Zellersatztherapien, Krankheit, Medikament und Entwicklungsstörungen Modellierung und toxikologischen Screening1,2,3. -Ersatz-Therapien können konzeptionell durch Zelle Injektion erreicht werden, in-vitro-differenzierte Gewebe (z. B. kardiale Patches) Implantation oder geführte Regenerierung mittels Gewebetechnik. Fruchtwasser (AFSC) und Membran-Stammzellen (AMSC) sind eine ausgezeichnete Quelle von Zellen für diese Interventionen entweder direkt4,5,6,7 oder als ein Ausgangspunkt Zellpopulation Umprogrammierung in Pluripotenz8,9,10,11,12.

Frühe Ansätze verwendet nicht definierte Kultur-Systeme oder Neuprogrammierung Methoden, die beinhalten genomischen Integration von9,10,11,12konstruiert. Eine neuere Studie beschäftigt ein Xeno-freies Medium, obwohl eine weniger definierte Basalmembran Anlage Matrix (BMM) verwendet wurde, um iPSC aus amniotische Flüssigkeit Epithelzellen zu generieren. Teratom Bildung Assay war jedoch nicht in die Studie zusammen mit einer Fülle von in-vitro- und molekulare Daten enthalten. Amniotische flüssige epitheliale Zellen erwiesen sich als eine etwa 8-fold höhere Neuprogrammierung Effizienz im Vergleich zu Neugeborenen Fibroblasten13haben. In einer anderen Studie fanden mesenchymaler Stammzellen aus Fruchtwasser auch in iPSC mit einem viel höheren Wirkungsgrad12neu programmiert werden.

Pluripotente Stammzellen unterscheiden sich in Geweben repräsentativ für alle 3 Mikrobeschichten und somit das größte Potenzial haben. Pädiatrische Patienten könnten davon profitieren die Ernte, Neuprogrammierung und Tissue Engineering ihre autologe amniotische Flüssigkeit Stammzellen pränatal und perinatal amniotischen Membran-Stammzellen. Darüber hinaus konnte das relativ niedrige Niveau der Differenzierung von embryonalen Stammzellen (niedriger als adulte Stammzellen14,15) theoretisch helfen bei der Bewältigung des beobachteten Eigentumsvorbehalts epigenetische Voreingenommenheit von Quellzellen iPSC16.

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für die Umprogrammierung Fruchtwasser und Membran Stammzellen zur Pluripotenz in chemisch Xeno-freie E8 Medium für rekombinante Vitronectin17 (VTN) mit episomal Plasmide18definiert. Der Hauptvorteil der amniotischen Flüssigkeit und Membran-Zellen als eine Quelle der Zellen für eine Anpassung liegt in ihrer Verfügbarkeit Pre und perinatal und somit würde dieser Ansatz vor allem Forschung zugute, in pädiatrischen Gewebetechnik.

Protocol

Das Protokoll folgt institutionellen Richtlinien der Ethik-Kommission für Forschung am Menschen. Schriftliche Einwilligung des Patienten wurde für die Verwendung von Fruchtwasser für die Forschung erhalten. Dieses Protokoll folgt die Politik der institutionellen Animal Care und Use Committee von der University of South Alabama. 1. Isolierung und Kultur der primären Fruchtwasser mesenchymalen Stammzellen Beschichtung von amniotische Flüssigkei…

Representative Results

Informierter Zustimmung wurde von Patienten erhalten vor der Ernte Fruchtwasser für genetische Testzwecke und eine kleine aliquoten des Fluids für die Forschung zu widmen. Ohne Zustimmung ist erforderlich für die Nutzung der amniotic Membrane in der Forschung, da die Plazenta medizinischen Abfälle darstellt. Amniotische Flüssigkeit und Membran Stammzellen typische mesenchymalen Anzeigeeigenschaften, morphologisch ihre Zellen sind spindelförmig und Phase-hell. Bei der Umprogrammierun…

Discussion

Die erste Phase der iPSC-Generation von fetalen Stammzellen beinhaltet die Gewinnung von die Quellzellen aus fetaler Gewebe, ihre Kultur, Ausbau und Einführung von episomal Neuprogrammierung Plasmide. Dieser Phase folgt eine Kulturdauer von ca. 14-18 Tage, bevor die ersten voll umprogrammierten Kolonien erweitert werden können. Die Abschlussphase ist Reifung der iPSC-Klone. Die ersten Gewinnung von Stammzellen amniotischen Membran wird mittels einer kombinierten mechanische und enzymatische Verdauung von der Amnion err…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch den Fonds Medizinische Forschung an der UZH Forschungskredit der Universität Zürich, The SCIEX NMSCh unter Stipendien 10.216 und 12.176, der Schweizerischen Gesellschaft für Kardiologie, The Swiss National Science unterstützt. Stiftung unter Grant [320030-122273] und [310030-143992], das 7. Rahmenprogramm, Leben Ventil, Europäische Kommission unter Grant [242008], die Olga Mayenfisch Stiftung, die EMDO Stiftung, Gründungshilfe 2012 von der Universitätsklinik Zürich, und interne Finanzierung des Mitchell Cancer Institute.

Materials

Tumor Dissociation Kit, human Miltenyi Biotec 130-095-929 tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 tissue dissociation system, dissociator
Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) Thermo-Fisher 3120032
70 µm cell strainers Corning 10054-456
RPMI 1640 medium Thermo-Fisher 32404014 
rocking platform VWR 40000-300
50 ml centrifuge tubes Thermo-Fisher 339652
15 ml centrifuge tubes Thermo-Fisher 339650
EBM-2 basal medium Lonza CC-3156 basal medium for AFMC medium
FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) Prospec Bio CYT-218 bFGF, supplement for AFMC medium
EGF Human, Pichia Prospec Bio CYT-332  EGF, supplement for AFMC medium
LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant Prospec Bio CYT-022 IGF, supplement for AFMC medium
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified Thermo-Fisher 10439024 FBS
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo-Fisher 15240062  for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells!
Accutase cell detachment solution StemCell Technologies 07920 cell detachment enzyme
CryoStor™ CS10 StemCell Technologies 07930 complete freezing medium
PBS, pH 7.4 Thermo-Fisher Scientific 10010023 
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen 12362 for plasmid isolation
pEP4 E02S EN2K Addgene 20925 EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2K Addgene 20927 ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4
pCEP4-M2L Addgene 20926 M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28
NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000C spectrophotometer
Neon® Transfection System Thermo-Fisher MPK5000 transfection system, components:
Neon pipette – transfection pipette
Neon device – transfection device
Neon® Transfection System 10 µL Kit Thermo-Fisher MPK1025 consumables kit for the Neon Transfection System, it contains:
Neon tip – transfection tip
Neon tube – transfection tube
buffer R – resuspension buffer
buffer E – electrolytic buffer
Stemolecule™ Sodium Butyrate StemGent 04-0005 small molecule enhancer of reprogramming
TeSR-E8 StemCell Technologies 05940 E8 medium
Vitronectin XF™ StemCell Technologies 07180 VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer
CellAdhere™ Dilution Buffer StemCell Technologies 07183 vitronectin dilution buffer
UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo-Fisher 15575020 dilute with PBS to 0.5 mM before use
EVOS® FL Imaging System Thermo-Fisher Scientific AMF4300 LCD imaging microscope system
CKX53 Inverted Microscope Olympus phase contrast cell culture microscope
Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo-Fisher 28908 dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week
Perm Buffer III BD Biosciences 558050 permeabilization buffer, chill to -20 °C before use
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 557782 isotype control for Oct3/4A, Nanog
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 557783 isotype control for Sox2
Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 561628
Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 560791
Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 562139
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 401617 isotype control for TRA-1-60
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 401618 isotype control for TRA-1-81
Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 330613
Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 330705
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 400129 isotype control for SSEA-1
Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 401321 isotype control for SSEA-4
Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 323010
Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 330407
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 Jackson Immunoresearch 115-606-068 use at a dilution of 1:600 or further optimize
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 Jackson Immunoresearch 115-546-068 use at a dilution of 1:600 or further optimize
DAPI Thermo-Fisher Scientific D21490 stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution
Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free Corning 356231 basement membrane matrix (BMM)
scid-beige mice, female Taconic CBSCBG-F
RNeasy Plus Mini Kit (50) Qiagen 74134 RNA isolation kit
T-25 flasks, tissue culture-treated Thermo-Fisher 156367
T-75 flasks, tissue culture-treated Thermo-Fisher 156499
Nunc™ tissue-culture dish Thermo-Fisher 12-567-650  10 cm tissue culture dish
6-well plates, tissue-culture treated Thermo-Fisher 140675
Neubauer counting chamber (hemacytometer) VWR 15170-173
Mr. Frosty™ Freezing Container Thermo-Fisher 5100-0001  freezing container
FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml Corning 352058 5 ml polystyrene tubes
Eppendorf tubes, 1.5 ml Thermo-Fisher 05-402-96 1.5 ml microcentrifuge tubes
PCR tubes, 200 µl Thermo-Fisher 14-222-262
pipette tips, 100 to 1250 µl Thermo-Fisher 02-707-407 narrow-bore 1 mL tips
pipette tips, 5 to 300 µl Thermo-Fisher 02-707-410
pipette tips, 0.1 to 10 µl Thermo-Fisher 02-707-437
wide-bore pipette tips, 1000 µl VWR 89049-166 wide-bore 1 mL tips
glass Pasteur pipettes Thermo-Fisher 13-678-20A
ethanol, 200 proof Thermo-Fisher 04-355-451
vortex mixer VWR 10153-842
chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass Thermo-Fisher 155409 glass-bottom confocal-grade cultureware
22G needles VWR 82002-366
insulin syringes Thermo-Fisher 22-253-260
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L fixation of explanted teratomas
Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip Illumina BD-103-0204 expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer
PrimeView Human Genome U219 Array Plate Thermo-Fisher 901605 expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest
GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array Thermo-Fisher 902482 expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest
PluriTest® Coriell Institute www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data – *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data
CellNet Johns Hopkins University cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data – *.cel files, soon to support RNA sequencing data

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Slamecka, J., Laurini, J., Shirley, T., Hoerstrup, S. P., Weber, B., Owen, L., McClellan, S. Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions. J. Vis. Exp. (129), e56003, doi:10.3791/56003 (2017).

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