Перепрограммирование первичной амниотической жидкости и мембраны клеток для плюрипотентности в условиях Xeno бесплатно
Summary
Этот протокол описывает перепрограммирования первичных амниотической жидкости и мембраны мезенхимальных стволовых клеток в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием-интеграция episomal подход в полной мере химически определенных условий. Описаны процедуры извлечения, культуры, перепрограммирования и характеристика результате индуцированных плюрипотентных стволовых клеток жесткими методами.
Abstract
Аутологичные клетки терапии получил на шаг ближе к реальности с введением индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Фетальных стволовых клеток, например, амниотической жидкости и мембраны мезенхимальных стволовых клеток, представляют собой уникальный тип недифференцированных клеток с обещанием в тканевой инженерии и для перепрограммирования в iPSC для будущих мероприятий педиатрических и банковских стволовых клеток. Протокола, представленные здесь описывает оптимизированная процедура для извлечения и культивирования первичных амниотической жидкости и мембраны мезенхимальных стволовых клеток и генерации episomal индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из этих клеток в полностью химически определенной культуры условия использования человеческого рекомбинантного vitronectin и среднего E8. Характеристика новых линий, применяя строгие методы – проточной цитометрии, конфокальная томография, тератома формирования и транскрипционный анализ профиля – также описал. Вновь созданный линии Экспресс маркеры эмбриональных стволовых клеток – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – при отрицательной для маркера SSEA-1. Линий стволовых клеток образуют тератомы ТКИД бежевый мышей в 6-8 недель и тератомы содержат представителя всех трех зародышевых тканей. Транскрипционный анализ профиля линий, представив глобальное выражение microarray данных алгоритм оценки плюрипотентности bioinformatic считаются все линии плюрипотентных и таким образом, этот подход является привлекательной альтернативой для животных тестирования. Новые линии iPSC легко может использоваться в нижнем течении экспериментов, связанных с оптимизации дифференциации и тканевой инженерии.
Introduction
Технология индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) приносит потенциал клеточной терапии замены, болезни и развития моделирования и наркотиков и токсикологические скрининг1,2,3. Терапии концептуально может быть достигнуто путем инъекции клеток, in vitro продифференцировано имплантации ткани (например, сердечный патчи), или руководствуясь регенерации с помощью тканевой инженерии. Амниотической жидкости (Канадские) и мембраны стволовых клеток (АМСГ) являются отличным источником клеток для этих мероприятий либо непосредственно4,5,6,7 или в качестве начальной популяции клеток для перепрограммирования в плюрипотентности8,9,10,,1112.
Ранних подходов используется неопределенный культуры систем или перепрограммирования методы, которые требуют предусматривать геномной интеграции конструкции9,10,,1112. Более недавние исследования занятых xeno свободной среде, хотя менее определенной матрицы вложение базальной мембраны (BMM) был использован, для создания iPSC от амниотической жидкости эпителиальных клеток. Однако пробирного формирования тератома не был включен в исследование наряду с богатством in vitro и молекулярных данных. Амниотической жидкости эпителиальные клетки были обнаружены примерно пищеводный перепрограммирования большую эффективность по сравнению с новорожденным фибробластов13. В другом исследовании мезенхимальные стволовые клетки амниотической жидкости были также признаны быть перепрограммированы в iPSC с гораздо более высокой эффективности12.
Плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в тканях представитель всех 3 зародышевых и таким образом имеют широкий потенциал. Педиатрических больных выиграют от уборки, перепрограммирования и тканевая инженерия их аутологичные стволовые клетки амниотической жидкости пренатально и амниотической мембраны стволовых клеток перинатально. Кроме того относительно низкий уровень дифференциации фетальных стволовых клеток (ниже, чем взрослые стволовые клетки14,15) теоретически могут помочь в решении наблюдается сохранение эпигеномные предвзятости из исходных ячеек в iPSC16.
Здесь мы представляем собой протокол для перепрограммирования амниотической жидкости и мембраны стволовых клеток для плюрипотентности в химически определены xeno бесплатно E8 среднего рекомбинантных vitronectin17 (СТС) с помощью episomal плазмид18. Основным преимуществом амниотической жидкости и мембраны клеток как источник клеток для перепрограммирования заключается в их наличие предварительной и перинатально и таким образом этот подход будет главным образом пользу исследования в педиатрических тканевой инженерии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Первоначальный этап формирования iPSC из фетальных стволовых клеток влечет за собой извлечение исходных ячеек из фетальных тканей, их культуры, расширение и внедрение episomal перепрограммирования плазмид. Этот этап следует период культуры около 14-18 дней до первого полностью перепрограмми…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Тюрингия Medizinische Fonds в Цюрихском университете, Forschungskredit университете Цюриха,Ch SCIEX NMS под 10,216 стипендии и 12.176, Швейцарское общество кардиологии, Швейцарский Национальный научный Фонд под Грант [320030-122273] и [310030-143992], 7-й Рамочной программы, жизнь клапана, Европейской Комиссией в рамках гранта [242008], Ольга Mayenfisch фонд, Фонд EMDO, целевой дотации 2012 больницы университета Цюриха, и внутреннее финансирование института рака Митчелл.
Materials
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | tissue dissociation system, dissociator |
| Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) | Thermo-Fisher | 3120032 | |
| 70 µm cell strainers | Corning | 10054-456 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo-Fisher | 32404014 | |
| rocking platform | VWR | 40000-300 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339652 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339650 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC-3156 | basal medium for AFMC medium |
| FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) | Prospec Bio | CYT-218 | bFGF, supplement for AFMC medium |
| EGF Human, Pichia | Prospec Bio | CYT-332 | EGF, supplement for AFMC medium |
| LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant | Prospec Bio | CYT-022 | IGF, supplement for AFMC medium |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified | Thermo-Fisher | 10439024 | FBS |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo-Fisher | 15240062 | for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells! |
| Accutase cell detachment solution | StemCell Technologies | 07920 | cell detachment enzyme |
| CryoStor™ CS10 | StemCell Technologies | 07930 | complete freezing medium |
| PBS, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 10010023 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | for plasmid isolation |
| pEP4 E02S EN2K | Addgene | 20925 | EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4 |
| pEP4 E02S ET2K | Addgene | 20927 | ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4 |
| pCEP4-M2L | Addgene | 20926 | M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28 |
| NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000C | spectrophotometer |
| Neon® Transfection System | Thermo-Fisher | MPK5000 | transfection system, components: Neon pipette – transfection pipette Neon device – transfection device |
| Neon® Transfection System 10 µL Kit | Thermo-Fisher | MPK1025 | consumables kit for the Neon Transfection System, it contains: Neon tip – transfection tip Neon tube – transfection tube buffer R – resuspension buffer buffer E – electrolytic buffer |
| Stemolecule™ Sodium Butyrate | StemGent | 04-0005 | small molecule enhancer of reprogramming |
| TeSR-E8 | StemCell Technologies | 05940 | E8 medium |
| Vitronectin XF™ | StemCell Technologies | 07180 | VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer |
| CellAdhere™ Dilution Buffer | StemCell Technologies | 07183 | vitronectin dilution buffer |
| UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | dilute with PBS to 0.5 mM before use |
| EVOS® FL Imaging System | Thermo-Fisher Scientific | AMF4300 | LCD imaging microscope system |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | phase contrast cell culture microscope | |
| Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo-Fisher | 28908 | dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week |
| Perm Buffer III | BD Biosciences | 558050 | permeabilization buffer, chill to -20 °C before use |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 557782 | isotype control for Oct3/4A, Nanog |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 557783 | isotype control for Sox2 |
| Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 561628 | |
| Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 560791 | |
| Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 562139 | |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 401617 | isotype control for TRA-1-60 |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401618 | isotype control for TRA-1-81 |
| Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 330613 | |
| Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330705 | |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 400129 | isotype control for SSEA-1 |
| Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401321 | isotype control for SSEA-4 |
| Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 323010 | |
| Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330407 | |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 | Jackson Immunoresearch | 115-606-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 | Jackson Immunoresearch | 115-546-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D21490 | stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution |
| Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | basement membrane matrix (BMM) |
| scid-beige mice, female | Taconic | CBSCBG-F | |
| RNeasy Plus Mini Kit (50) | Qiagen | 74134 | RNA isolation kit |
| T-25 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156367 | |
| T-75 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156499 | |
| Nunc™ tissue-culture dish | Thermo-Fisher | 12-567-650 | 10 cm tissue culture dish |
| 6-well plates, tissue-culture treated | Thermo-Fisher | 140675 | |
| Neubauer counting chamber (hemacytometer) | VWR | 15170-173 | |
| Mr. Frosty™ Freezing Container | Thermo-Fisher | 5100-0001 | freezing container |
| FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml | Corning | 352058 | 5 ml polystyrene tubes |
| Eppendorf tubes, 1.5 ml | Thermo-Fisher | 05-402-96 | 1.5 ml microcentrifuge tubes |
| PCR tubes, 200 µl | Thermo-Fisher | 14-222-262 | |
| pipette tips, 100 to 1250 µl | Thermo-Fisher | 02-707-407 | narrow-bore 1 mL tips |
| pipette tips, 5 to 300 µl | Thermo-Fisher | 02-707-410 | |
| pipette tips, 0.1 to 10 µl | Thermo-Fisher | 02-707-437 | |
| wide-bore pipette tips, 1000 µl | VWR | 89049-166 | wide-bore 1 mL tips |
| glass Pasteur pipettes | Thermo-Fisher | 13-678-20A | |
| ethanol, 200 proof | Thermo-Fisher | 04-355-451 | |
| vortex mixer | VWR | 10153-842 | |
| chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass | Thermo-Fisher | 155409 | glass-bottom confocal-grade cultureware |
| 22G needles | VWR | 82002-366 | |
| insulin syringes | Thermo-Fisher | 22-253-260 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixation of explanted teratomas |
| Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip | Illumina | BD-103-0204 | expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer |
| PrimeView Human Genome U219 Array Plate | Thermo-Fisher | 901605 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest |
| GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array | Thermo-Fisher | 902482 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest |
| PluriTest® | Coriell Institute | www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data – *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data | |
| CellNet | Johns Hopkins University | cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data – *.cel files, soon to support RNA sequencing data |
Referenzen
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (3), 194-200 (2016).
- Schmidt, D., et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source. Circulation. 116 (11 Suppl), I64-I70 (2007).
- Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth. Placenta. 32, S316-S319 (2011).
- Weber, B., et al. Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation. Biomaterials. 33 (16), 4031-4043 (2012).
- Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects. Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).
- Slamecka, J., et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).
- Jiang, G., et al. Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
- Pipino, C., et al. Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking. Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).
- Cai, J., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells. J Biol. Chem. 285 (15), 11227-11234 (2010).
- Ge, X., et al. Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells. Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).
- Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res. Ther. 6 (1), (2015).
- Kang, N. -. H., et al. Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells. Cancer Gene Ther. 19 (8), 517-522 (2012).
- Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol. Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
- Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
- Adewumi, O., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
- Müller, F. -. J., et al. A bioinformatic assay for pluripotency in human cells. Nature Methods. 8 (4), 315-317 (2011).
- Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering. Cell. 158 (4), 903-915 (2014).
- Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma. STEM CELLS. 25 (3), 723-730 (2007).
- Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).
- Müller, F. -. J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
