Chromatin Immunoprecipitation을 이용한 c-KIT 리간드 프로모터 분석
Summary
DNA- 단백질 상호 작용은 여러 생물학적 과정에 필수적입니다. 세포 기능을 평가하는 동안 DNA- 단백질 상호 작용의 분석은 유전자 조절을 이해하는 데 없어서는 안될 필수 요소입니다. Chromatin immunoprecipitation (ChIP)은 생체 내에서 그러한 상호 작용을 분석하는 강력한 도구 입니다.
Abstract
DNA 복제 및 수리, DNA 재조합 및 유전자 발현을 포함한 여러 세포 과정은 단백질과 DNA 간의 상호 작용을 필요로합니다. 따라서 DNA- 단백질 상호 작용은 세포 분화, 세포 증식, 세포주기 조절, 염색체 안정성, 후성 유전자 조절 및 세포 변형과 같은 여러 생리적, 병리 생리 학적 및 생물학적 기능을 조절합니다. 진핵 세포에서 DNA는 히스톤 및 비 히스톤 단백질과 상호 작용하고 염색질로 응축됩니다. 전기 이동 (젤) 이동성 이동 분석 (EMSA) 및 DNase I 발자국과 같은 몇 가지 기술 도구를 사용하여 DNA- 단백질 상호 작용을 분석 할 수 있습니다. 그러나 이러한 기술은 세포 내에서가 아니라 in vitro에서 단백질 -DNA 상호 작용 을 분석합니다. Chromatin immunoprecipitation (ChIP)은 특정 DNA 결합 부위에서 단백질을 포착하여 DNA- 단백질 상호 작용을 확인하는 기술입니다s의 염색질 컨텍스트 내에서. 이것은 DNA- 단백질 상호 작용을 고정시킨 후 관심 단백질의 면역 침전에 의해 이루어진다. 이어서, 단백질이 결합 된 게놈 부위가 특성화된다. 여기에서 우리는 ChIP를 기술하고 논의하고 티로신 – 아밀로오스의 프로모터 영역 내에서 전사 인자 SMAD2의 SMAD 결합 요소 (SBE) 로의 형질 전환 성장 인자 -β (TGF-β) – 유도 된 결합의 동정을위한 분석적 가치를 입증한다. 단백질 키나아제 키트 (c-KIT) 수용체 리간드 줄기 세포 인자 (SCF).
Introduction
진핵 생물의 핵에서는 DNA가 히스톤 단백질과 비 히스톤 단백질과 상호 작용하고 염색질로 응축된다. 생리 학적, 병태 생리 학적 및 세포 생물학적 상황에서 세포 기능은 염색질 – 조정 된 유전자 발현에 의해 공간적 및 일시적으로 조절된다. DNA- 단백질 상호 작용은 DNA 복제, 재조합 및 수리뿐만 아니라 단백질 발현과 같은 세포 과정의 조절에 필수적인 역할을한다. 따라서, DNA- 단백질 상호 작용의 분석은 유전자 발현 및 세포 기능의 평가에 없어서는 안될 도구입니다.
Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA)와 DNase I footprinting 1,2 와 같은 시험 관내에서 DNA- 단백질 상호 작용을 평가하는 몇 가지 기술이 있습니다. 그러나 이러한 기술은 염색질 및 세포 내에서 단백질 -DNA 상호 작용을 분석하지 못합니다. 칩 i이 기술은 특정 DNA 결합 부위에 결합 된 단백질을 포착하여 염색질 컨텍스트 내에서 DNA- 단백질 상호 작용의 확인을 용이하게합니다. 이 기술은 원래 Gimour와 Lis가 Escherichia coli 와 Drosophila melanogaster 3 , 4 에서 특정 유전자에 결합하는 RNA 중합 효소 II의 평가를 위해 개발되었습니다. 이것은 DNA- 단백질 복합체를 고정시킨 후 염색질 추출을 수행하고 ~ 200 염기쌍 (bp) 단편으로 DNA를 절단함으로써 수행됩니다. 이어서, DNA- 결합 된 관심 단백질은 면역 침전에 의해 분리된다. DNA- 단백질 교차 결합의 역전 후, DNA를 정제하고 분석한다. 몇 가지 방법은 단백질 결합 사이트의 분석을 위해 사용할 수 있으며 대상 유전자 내 단백질 바인딩 사이트의 핵산 시퀀스에 따라 달라질 수 있습니다. DNA 서열이 알려져있는 경우, 표준 Pol알려진 결합 부위에 인접한 특정 프라이머 쌍을 사용하여 ymerase Chain Reactions (PCR)을 적용 할 수 있습니다. 정량 실시간 PCR (qRT-PCR)도 사용할 수 있습니다 6 . 서열이 알려지지 않은 경우 ChIP는 DNA 마이크로 어레이 (ChIP-on-chip), DNA 시퀀싱 (ChIP-seq) 또는 클로닝 기술 7 , 8 , 9 와 결합 될 수있다.
TGF-β 경로는 강력한 종양 억제 기능을 가지고 있으며 세포 분화의 핵심 경로입니다. TGF-β1 리간드와 동족 수용체 복합체의 결합을 통해 활성화되어 SMAD2 / 3 전사 인자의 세린 – 포스 포 릴화를 일으킨다. 공통 중재자 인 SMAD4와의 결합 이후에, SMAD- 복합체는 핵으로 전위되어 표적 유전자의 프로모터 영역 내의 SBE와 결합하여 세포주기, 세포 사멸 및 세포 특이성을 조절하는 유전자를 조절한다에. TGF-β 자극에 대한 전사 반응은 세포 유형 및 상황에 따라 다릅니다 10 . 최근에 우리는 TGF-β와 c-KIT 경로 사이에 긍정적 인 피드백 고리를 기술했다. 이 모델에서, TGF-β1- 활성화 SMAD2는 c-KIT 리간드 프로모터에 결합하여 그 발현 및 분비를 유도한다. 이어서, c-KIT 리간드는 자동 및 준 – 유사 방식으로 c-KIT 수용체를 활성화시킨다. c-KIT 수용체 활성화는 JAK1 / 2를 통한 STAT3 Tyr705- 인산화를 초래한다. STAT3 활성화 및 핵 전좌 이후, STAT3은 TGF-β1 리간드 유전자에 결합하고 그 발현을 조절한다.
여기에서 우리는 c-KIT 수용체 리간드 프로모터에 대한 SMAD2 결합의 확인과 신호 변환기 (and) Transcription 3 (STAT3의 TGF-β1- 유전자).
Protocol
Representative Results
Discussion
이 보고서에서 우리는 c-KIT 리간드 프로모터 내 SBE에 SMAD2의 TGF-β1 유도 된 결합과 TGF-β1 리간드 유전자 내에서 STAT3의 인식 서열에 TGF-β1에 의해 유도 된 결합을 입증했다. 우리는 염색질 면역 침전을 사용하여 두 전사 인자 모두의 사이토 카인 유도 결합을 증명한다.
크로마토 그래피 면역 침전은 DNA에 대한 관심있는 단백질의 직접 결합을 입증하고, DNA에 대한 단백질 결합을 …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 TX 텍사스 주 MD 앤더슨 암 센터 (Houston, TX) (시작 자금, BB)의 지원을 받았다.
Materials
| HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| Hep3B cells | ATCC | HB-8064 | |
| TGF-β1 | R&D Systems | 101-B1 | Used at a concentration of 10 ng/ml |
| Anti-SMAD2 antibody | Cell Signalling Technology | 5339 | Amount used per IP: 3 µg |
| Anti-STAT3 antibody | Cell Signalling Technology | 4904 | Amount used per IP: 3 µg |
| ChIP-IT Protein G Magnetic Beads | Active Motif | 53033 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Active Motif | 37490 | |
| Micrococcal Nuclease | Cell Signalling Technology | 10011 | |
| PCR forward primer: PAI-1 | Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’ | ||
| PCR reverse primer: PAI-1 | Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’ | ||
| PCR forward primer: SCF | Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ | ||
| PCR reverse primer: SCF | Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’ |
Referenzen
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