ここでは、増加したサンプリング周波数を可能にし、開腹術を行うと比較した場合、外科的合併症の可能性を低減マカクにおける肝臓及び腸間膜リンパ節(MLN)の連続サンプリング用の低侵襲腹腔鏡技術が記載されています。
腸間膜リンパ節(MLN)および肝臓はそれらを免疫学的にユニークな作り、胃腸(GI)管からの微生物および微生物産物にさらされています。胃腸管および関連MLNは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染の初期のウイルス複製のサイトであり、MLNでも長期の抗レトロウイルス療法(ART)の後に潜伏感染細胞を抱く可能性の高い重要な貯留サイトです。肝臓は、レンチウイルスに対する免疫応答に重要な役割を果たすことが示されており、循環からのウイルスのクリアランスに重要な役割を果たしていると思われました。非ヒト霊長類(NHP)HIVおよび後天性免疫不全症候群(AIDS)のためのモデルは密接にHIV感染し、このモデルにおけるウイルス複製のプライマリサイトと関連する免疫応答のシリアル縦サンプリングのこれらの側面を模倣するが、感染における重要なイベントを解明するのに役立ちます、病因、およびこれらのイベントのさまざまな介入戦略の影響。 CURR肝臓及びMLNをサンプリングするENT公表の技術が一緒に同じ動物でシリアル形式でこれらの重要な場所を調査する能力を制限する大手術および/または剖検を伴います。我々は以前MLNの収集のための腹腔鏡技術を記載しています。ここでは、MLNの収集のために必要な同じ2つのポートの位置によって肝臓およびMLNのシリアル縦サンプリングのための低侵襲腹腔鏡技術を説明します。追加の切開が必要とされないように、同じ2つのポートの使用は、動物への影響を最小限に抑えます。この技術は、主要な開腹手術に比べて増加したサンプリング周波数で使用すると、手術合併症の可能性を低減し、結果の解釈を複雑にし得る局所的および全身性炎症反応を関連付けることができます。この手順は、動物福祉を向上させながら、NHPモデルを含む研究を促進する可能性を秘めています。
胃腸(GI)管は、身体の最大の粘膜表面であり、食物に由来する抗原、病原体、及び一般microbiome 1、2と呼ば内共生細菌群集の無数に露出しています。腸間膜リンパ節(MLN)は、胃腸管を並べると、これらの多様な抗原に対する炎症性または寛容原性応答を促進するための免疫機能の主な部位です。 MLNの物理的な構成は、全身応答3を誘発することなく、ローカルに抗原に応答することができ、区画システムを作成します。同様に、循環に戻るので、粘膜固有層に胃腸管から転し、血流4を入力している微生物や微生物産物にさらされる前に、門脈を介して肝臓への胃腸管の排水溝からの血液。肝臓は、二次リンパ器官Aとして機能しますNDは転位微生物5,6を除去するための特殊なマクロファージを含む免疫細胞の多数を、有しています。このように、MLNおよび肝臓は、消化管からの共生や病原性細菌にさらされ、一次免疫器官であるだけでなく、他のソースからの抗原の環境、免疫学的観点から、それらはユニークで重要な作り。
MLNは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)または病原性サル免疫不全ウイルス(SIV)感染のウイルス学的および免疫学的効果の評価のために重要な部位であり、そしておそらく直腸内攻撃後のSIVの早期普及に関与しています。腸管関連リンパ組織は、近代的な抗レトロウイルス療法(ART)7によるウイルス血症の効果的な制御にもかかわらず、持続的なHIV複製の主要部位であることが知られています。 SIV感染モデルにおいて、MLNは潜伏ウイルスおよび月の重要なリザーバーであることが示されています一次リザーバ8、9です。肝臓は、急性SIV感染マカク10中の肝臓におけるSIV特異的CD8 + T細胞の蓄積によって証明されるように、レンチウイルス感染症にも重要です。さらに、それは循環11からウイルスをクリアするための責任の主要な器官です。
HIVおよびSIV感染が変更されたGIの微生物叢に関連付けられている、GI上皮の完全性を破壊し、そして周囲と循環12、13に結腸から微生物および微生物産物のトランスロケーションを増加させました。これらのプロセスは、ローカルおよび全身の免疫活性化に関連し、そしてHIV感染者14に罹患率と死亡率が増加しています。 SIV感染では、転細菌は、マイクの蓄積に対し、MLN 15で観察されています肝臓でrobial製品は、炎症および臓器16に損傷をもたらすことが示されています。このように、HIVとSIV感染症のコンテキストで、MLNおよび肝臓はGI常駐菌によって駆動炎症プロセスを理解するために非常に有益することができます。
ここでは、MLNおよび非ヒト霊長類(NHPS)で肝臓の連続サンプリングのための低侵襲腹腔鏡技術を提示します。私たちは、それぞれの手術の間で160日で、各動物を2回サンプリングし、2匹の健康な女性アカゲザル(RMS)でこの技術の成功したパフォーマンスを発揮します。我々は2つの時点の間で非常に一貫性のあるデータを評価し、フローサイトメトリーを用いて各臓器内のキー白血球やリンパ球の集団を比較し、証明するために、これらのサンプルを使用するために行きます。
ここでは、本研究では説明しませんこれらおよび他の動物に、100%の成功率を持っていたシリアルMLNの収集及び肝生検のための低侵襲技術を実証します。さらに、時間にわたって同じ動物でのこの技術の使用は、有害事象と関連付けられていません。実際、SIV、サル/ヒト免疫不全ウイルス(SHIV)、又はZikaウイルス(未発表データ)で感染させた動物の他のコホートにおけるこの技術の使用から生じる合併症はなかったです。同様に、この手術はしても、以前に、主要な腹部の手術を受けた動物および血小板減少症の動物(未発表データ)に成功しました。我々は、これらのサンプルは、追加の切開の必要性を回避する肝臓へのMLNから切り替えたときのカメラの位置を逆にして同じ2つのポートを介して収集することができることを実証しました。 MLNのコレクションに影響を与える要因には、以前に13に報告されています。
<pそれぞれが収集したデータへの合併症、成功率の変化、または変更することなく、個々の動物の時間にわたって実行されている3回のMLNおよび3肝生検の4集まで、クラス=「jove_content」>。また、この腹腔鏡MLN /肝臓収集技術がうまくそのようなの広範な評価を可能にする同一の麻酔イベントで周辺のLN、内視鏡上部および下部GI生検、骨髄吸引、脳脊髄液コレクションの収集、および静脈穿刺のような他の処置と組み合わされていますウイルス学的および連続様式で免疫応答(未発表データ)。完了するために45分間二~0.5センチ切開部を介して達成される – 全体の手順は、典型的には30を取ります。肥満動物では、より大きな切開を作るために必要があるかもしれない – を通じてMLNを取得するために(〜1〜1.5センチ)と完了するために追加の時間を必要とするかもしれません。豊富な腸間膜脂肪と動物は、多くの場合、dと豊富な経験を必要とします周囲の脂肪からifferentiate MLN。 MLNは、多くの場合、腸間膜血管系に沿って発見され、血管中の分岐点に近いより一般的であるように思われています。この技術の重要な側面は、それが腸間膜に腹部切開を通して体外にするのに十分な可動性を有するように選択MLNを必要とすることです。結果として、この技術は、腸間膜の根元に近いMLNを収集するために使用することができません。倍率に、時間にカメラでMLNを識別すること、およびMLNに近接して把持することが体外にされると、ノードの位置を特定し、識別を支援することができ容易です。
トレンデレンブルグの位置の使用は、常にMLNの収集のために必要とされないこと、およびMLNは簡単にトレンデレンブルグの位置を使用せずに取り出すことができるならば、それは頭側シフトから臓器を防ぐことができますよう、肝生検を容易にすることができます。時には、トレンデレンブルグの位置に配置した後、肝臓は、横隔膜や必見に対してシフトアップされますそっと前生検コレクションに元の位置に戻し操作します。 MLN収集のためのポートの配置が左にあるとして、彼らは、カニューレに近いとして、肝生検は通常、左横および左内側肝葉から取得されます。
MLN収集し、肝生検は、下流分析の様々な十分な細胞収量を提供し、収集された細胞の高い生存率を示しました。ここでは、細胞は白血球やリンパ球集団のフローサイトメトリー分析のために染色し、これらの二つの重要な免疫器官の間の主な違いは明らかにしました。例えば、MLNが高度炎症性管理のため、ならびにCD4 + Tの重要性に収集および適応免疫応答を広めるための中心点としてMLNの重要性のために、肝臓に比べてCD4 + T細胞について富化し、そして環境への寛容原性応答は、食事摂取量とGI-常駐微生物由来の抗原S = "外部参照"> 24。しかし、肝臓は大幅MLNに比べてCD14 +白血球のために富んでいました。 CD14は、単球およびマクロファージ上で主に発現し、細菌性リポ多糖(LPS)25のための受容体複合体の重要な構成要素です。実際、可溶性CD14の増加した血漿中濃度は、微生物転及びHIV病原性SIV感染26で免疫活性化と関連しています。 MLNと比較するとこのように、肝臓におけるCD14 +白血球の高い周波数は、おそらく、この器官におけるより大きな細菌負荷に起因します。
ここでは、任意の有害転帰に至っていない腹腔鏡エントリの2つだけ小さな切開を使用してシリアルMLNの収集及び肝生検のための迅速かつ低侵襲性の外科技術を実証します。これらのサンプルは、ナンプラーを取るキー免疫学、ウイルス学、微生物学的およびプロセスを評価するために便利なルートを提供します全身性免疫とは別のユニークであるMLNおよび肝臓、中のCe。同様に、肝生検はしばしば重大な肝障害16を誘導するために組み合わせるHIV / SIV、薬物療法、および転微生物の影響の長期評価のために重要です。 MLNおよび肝臓がGI微生物叢にさらされた免疫器官であるため、また、時間を越えこれらの器官で免疫力を評価する能力はmicrobiomeは、宿主の免疫恒常性の維持に果たす役割を理解するための優れたプラットフォームを提供します。まとめると、肝臓及びMLNの評価は、ワクチンや治療効能、SIVウイルスリザーバーのクリアランス、および一般的な粘膜免疫の関係で非常に重要です。低侵襲的アプローチを介してこれらのサンプルを収集する能力は、現在公開された技術および動物の生理にあまり影響で存在するよりも、手順に関連する炎症の少ないリスクがあることを意味します。 FUでトゥーレ、我々は中に重要な役割を果たすことが示されている免疫系の別の重要かつ明確な部分のサンプリングを可能にするために同じ2つのポートの位置によって脾臓のコレクションをMLNの収集と肝臓を結合する可能性を評価します疾患モデルの数。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、NIH助成金番号P51OD010425によってサポートされていました。
Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
Hospira Lactated Ringer's 250 ml | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
Multipurpose Rigid Scope, 2.7mm x 187.5mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
Exam and Protective Sheath for 2.7mm x 187.5mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
Rigid scope, 5mm x 300mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
Veress Needle, 2mm x 80mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
Solid Probe with Markings, 5mm x 320mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5mm x 240mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
Biopsy Forceps, 3.5mm X 310mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
CO2 | Airgas | CD USPE | |
RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
5mL Syringe | BD | 309646 | |
50mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
5mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
LSR II Flow Cytometer | BD | NA |