여기서는 샘플링 주파수 증가를 허용하고, 개복술을 수행하는 수술에 비해 부작용의 가능성을 감소 원숭이에서 간 및 장간막 림프절 (MLN)의 직렬 샘플링하는 최소 침습 복강경 기술을 설명한다.
장간막 림프절 (MLN)과 간은 그들을 면역 학적으로 독특한 제작, 위장 (GI) 기관에서 미생물 및 미생물 제품에 노출되어있다. 위장관 및 관련 MLN 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감염 초기 바이러스 복제의 사이트이며, MLN도 장기간 항 레트로 바이러스 치료 (ART) 후 잠복 감염된 세포를 항구 가능성이 중요한 저수지 사이트입니다. 간은 렌티 바이러스에 면역 반응에 중요한 역할을하는 것으로 순환에서 바이러스의 정리에 중요한 역할을 할 것으로 보인다되었습니다. 인간이 아닌 영장류가 HIV와 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS)에 대한 (NHP) 모델은 밀접하게 감염에서 중요한 이벤트를 해명하는 데 도움이 될 것입니다 HIV 감염과 바이러스 복제 및이 모델에 관련된 면역 반응의 주 사이트의 일련 종 샘플링의 이러한 측면을 모방, 병인 그리고 이러한 이벤트에 대한 다양한 개입 전략의 영향. CURR천만에 게시 된 기술은 간을 샘플링하고 MLN 함께 같은 동물에서 직렬 방식이 중요한 사이트를 조사 할 수있는 능력을 제한하는 주요 수술 및 / 또는 검시를 포함한다. 우리는 이전에 MLN의 컬렉션에 대한 복강경 기술을 설명했다. 여기서는 MLN의 수집에 필요한 같은 두 포트를 통해 지역 간 MLN 직렬 길이 샘플링하는 최소 침습 복강경 기술을 설명한다. 추가 절개가 필요하지 않습니다 같은 두 개의 포트의 사용은 동물에 미치는 영향을 최소화 할 수 있습니다. 이 기술은 주요 복부 수술에 비해 증가 샘플링 주파수 사용 및 수술 합병증의 가능성을 감소 및 결과의 해석을 복잡하게 할 수 로컬 및 전신 염증 반응을 연결할 수 있습니다. 이 절차는 동물 복지를 향상시키는 동시에 NHP 모델을 포함하는 연구를 촉진하기 가능성이있다.
위장 (GI) 관은 신체에서 가장 큰 점막 표면이며 일반적으로 마이크로 바이 (1, 2)로 지칭 식품, 병원균, 박테리아 및 endosymbiotic 커뮤니티로부터 유도 항원의 무수에 노출된다. 장간막 림프절 (MLN)은 위장관 라인 이러한 다양한 항원에 대한 염증 또는 tolerogenic 반응을 촉진 면역 기능의 주요 사이트입니다. MLN의 물리적 조직은 로컬 전신 반응 (3)을 도출하지 않고 항원에 반응 할 수있는 구획 시스템을 만듭니다. 마찬가지로, 순환 복귀, 따라서 고유 층으로 위장관에서 전좌와 혈류 4를 입력 한 미생물 및 미생물 제품에 노출되기 전에 포털 정맥의 방법으로 간을 위장관 빼낸 혈액. 간은 또한 차 림프 기관 A와 기능ND는 전위 된 미생물 5, 6을 제거하는 전문 식세포를 포함하는 면역 세포의 큰 숫자를 가지고 있습니다. 따라서, MLN과 간은 위장관에서 공생과 병원성 세균에 노출 차 면역 기관뿐만 아니라 다른 소스에서 항원의 환경이되어 면역 학적 관점에서 그들이 독특하고 중요한 만들기.
MLN 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 또는 병원성 유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV) 감염의 바이러스 학적 및 면역 학적 효과의 평가를위한 중요한 사이트이며, 가능성이 직장 내 반칙으로 SIV의 조기 보급에 참여하고 있습니다. 창자 관련 림프 조직은 현대적인 항 레트로 바이러스 치료 (ART) (7)에 의한 바이러스 혈증의 효과적인 통제에도 불구하고, 지속적인 HIV 복제의 주요 사이트로 알려져있다. SIV 감염 모델에서, MLN 잠재 바이러스의 중요한 저수지 것으로 나타났다 및 수도있다주 저장 8,9 될. 급성 SIV 감염 원숭이 10시 간에서의 SIV 특이 CD8 + T 세포의 축적에 의해 입증되는 바와 같이 간은 렌티 바이러스 감염과 같은 중요하다. 또한, 순환 11에서 바이러스를 삭제에 대한 책임이있는 주요 기관이다.
HIV와 SIV 감염이 변경된 GI의 미생물과 관련된, 위장관 상피 무결성을 중단하고, 주변 순환 (12), (13)에 결장에서 미생물 및 미생물 제품의 전위를 증가했다. 이러한 프로세스는 지역 및 전신 면역 활성화와 관련, 및 HIV 감염자 14 이환율과 사망률을 증가합니다. SIV 감염, 박테리아 MIC 전좌의 축적, 반면 MLN 15에서 관찰 된간에서 robial 제품은 기관 (16)에 염증과 손상을 초래할 것으로 나타났다. 따라서, HIV 및 SIV 감염의 맥락에서, MLN 간은 GI 상주 균에 의해 구동되는 염증 과정을 이해하는데 매우 유익 할 수있다.
여기서, 우리는 비 – 인간 영장류 (NHPs)에 직렬 MLN의 채취 및 간을위한 최소 침습 복강경 기술을 제시한다. 우리는 각 수술 사이에 각 동물 160일로 2 회, 샘플링, 두 개의 건강한 여성 붉은 털 원숭이 (RMS)에이 기술의 성공적인 성능을 보여줍니다. 우리는 두 시점 사이의 매우 일관된 데이터를 평가하고 유동 세포 계측법 사용하여 각 기관 내에서 키 백혈구 및 림프구 인구를 비교하고, 입증이 샘플을 사용하기에 이동합니다.
여기서 우리는이 연구에 설명되지 않은 이들과 다른 동물에서 100 % 성공률을했다 일련 MLN의 수집 및 간 조직 검사를위한 최소 침습 기술을 보여줍니다. 또한, 시간에 걸쳐 같은 동물이 기술의 사용은 어떤 부작용과 관련되지 않았습니다. 실제로, SIV, 유인원 / 인간 면역 결핍 바이러스 (SHIV), 또는 Zika 바이러스 (게시되지 않은 데이터)에 감염된 동물의 다른 집단에서이 기술의 사용으로 인한 합병증은 없었다. 마찬가지로,이 수술은 심지어 이전에 주요 복부 수술을받은 동물과 혈소판 동물 (게시되지 않은 데이터)에 성공적으로 입증되었습니다. 우리는 추가로 절개에 대한 필요성을 회피간에 MLN에서 스위칭 할 때 이들 샘플은 카메라 위치를 반전 같은 두 개의 포트를 통해 수집 될 수 있음을 보여 주었다. MLN의 수집에 영향을 미치는 요인은 이전 13보고되었다.
<p3 MLN 3 간 생검 각각의 네 개의 컬렉션까지 클래스 = "jove_content은"> 합병증없이 각각의 동물에 시간에 걸쳐 수행 된 데이터에 성공 환율 변동, 또는 변경 수집. 또한,이 복강경 MLN / 간 수집 기술이 성공적으로 광범위하게 평가 가능 같은 마취제 행사 말초 림프절 내시경 상하 GI 생검, 골수 흡입, 뇌척수액의 컬렉션 및 정맥 천자와 같은 또 다른 과정과 결합 된 바이러스 학적 및 직렬 방식으로 면역 학적 반응 (게시되지 않은 데이터).완료 45 분 두 ~ 0.5 cm 절개를 통해 수행된다 – 전체 절차는 일반적으로 30 걸린다. 비만 동물에서는 더 큰 절개 할 필요가있을 수있다 -을 통해 MLN를 검색 (1 ~ 1.5 cm)를 완료하기 위해 추가 시간이 필요할 수 있습니다. 광범위한 장간막 지방과 동물은 종종 D에 상당한 경험을 필요로주변 지방에서 MLN을 ifferentiate. MLN은 종종 장간막 혈관을 따라 발견과 혈관의 분기점 근처 더 널리 퍼진 것 같다된다. 이 기술의 중요한 양상은 장간막에서 복부 절개를 통해 표면화 될 충분한 이동성을 갖도록 선택 MLN을 필요로한다는 것이다. 그 결과,이 기술은 장간막의 루트에 MLN 가까이를 수집하는 데 사용할 수 없습니다. 때문에 확대, 그것은 카메라와 함께 MLN를 식별하고, MLN에 근접 파악하는 위치와 그것이 표면화되면 노드를 식별하는 데 도움이 쉽게 시간입니다.
Trendelenburg 위치의 사용은 항상 MLN 수집에 필요하지 않을 수 있으며, MLN 쉽게 Trendelenburg 위치를 사용하지 않고 검색 할 수있는 경우는 두개쪽으로 이동에서 장기를 차단하므로 간 조직 검사를 쉽게 할 수 있습니다. 때때로, Trendelenburg 위치에 배치 한 후, 간은 횡격막해야 대항 이동 부드럽게 다시 조직 검사 모음 이전 위치로 조작 할 수. MLN 컬렉션의 포트 위치가 좌측에있는 바와 같이들은 캐뉼라에 가까운만큼, 간 생검은 일반적 좌측 및 좌측 측면 간 중간 엽에서 촬영된다.
MLN 수집 간 생검 하류 다양한 분석을위한 충분한 세포 수율을 제공하고, 수집 된 세포의 높은 가능성을 보여 주었다. 여기에, 세포는 백혈구와 림프구 인구의 유세포 분석을 위해 염색,이 두 가지 중요한 면역 기관 사이의 키 차이가 밝혀졌다. 예를 들어, MLN이 높은 염증성 관리뿐만 아니라 CD4 + T의 중요성에 대한 수집 및 적응 면역 반응을 전파하기위한 중앙 점과 MLN의 중요성 때문에, 간장에 비해 CD4 + T 세포에 대한 풍부하고 환경에 tolerogenic 응답은식이 섭취와 GI 상주 미생물에서 유래 된 항원S = "외부 참조"> 24. 그러나, 간은 크게 MLN에 비해 CD14 + 백혈구에 대한 풍부한했다. CD14은 단핵구 및 대 식세포에 주로 발현 및 세균성 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) (25)에 대한 수용체 복합체의 주요 구성 요소이다. 실제로, 가용성 CD14의 증가 된 혈장 농도는 미생물의 전좌 및 HIV의 면역 활성화 및 병원성 SIV 감염 (26)과 연관된다. MLN 비교할 때 즉, 간에서 CD14 + 백혈구 고주파수 가능성이 큰 장기 세균 부담 기인한다.
여기서 우리는 일련 MLN의 수집 및 부작용을 주도하지 않은 복강경 항목에 대한 두 개의 작은 절개를 이용하여 간 생검에 대한 신속하고 최소 침습 수술 기법을 보여줍니다. 이 샘플은 괞 찮아을 주요 면역 학적, 바이러스 학적, 미생물 학적 프로세스를 평가하는 유용한 경로를 제공면역 조직으로부터 분리하고 고유 한 MLN 간에서 CE. 마찬가지로, 간 조직 검사는 종종 큰 간 손상 (16)을 유도 결합 HIV / SIV, 약물 치료, 그리고 전위 된 미생물의 효과의 장기 평가를 위해 중요하다. MLN 간은 GI의 미생물에 노출 된 면역 기관이기 때문에 또한, 능력이 시간에 걸쳐 이들 기관에 내성을 평가하기 위해 마이크로 바이 옴 호스트 면역 항상성을 유지하는 역할을 이해하기위한 훌륭한 플랫폼을 제공합니다. 함께 찍은 간 평가 및 MLN 백신 및 치료 효능, SIV 바이러스 저수지 통관, 일반 점막 면역의 맥락에서 주요 중요하다. 최소한의 침습적 인 방법을 통해 이러한 샘플을 수집 할 수있는 능력은 현재 게시 된 기술과 동물의 생리에 미치는 영향 존재보다 절차와 관련된 염증 덜 위험이 있다는 것을 의미한다. 푸에진짜야, 우리는에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다 면역 시스템의 또 다른 중요하고 서로 다른 부분의 샘플링이 가능하도록 동일한 두 포트 위치를 통해 비장의 수집과 MLN의 수집 및 간 결합 가능성을 평가합니다 질병 모델의 수.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 NIH 교부금 번호 P51OD010425에 의해 지원되었다.
Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
Hospira Lactated Ringer's 250 ml | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
Multipurpose Rigid Scope, 2.7mm x 187.5mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
Exam and Protective Sheath for 2.7mm x 187.5mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
Rigid scope, 5mm x 300mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
Veress Needle, 2mm x 80mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
Solid Probe with Markings, 5mm x 320mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5mm x 240mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
Biopsy Forceps, 3.5mm X 310mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
CO2 | Airgas | CD USPE | |
RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
5mL Syringe | BD | 309646 | |
50mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
5mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
LSR II Flow Cytometer | BD | NA |