Qui, si descrive una tecnica laparoscopica minimamente invasivo per il campionamento di serie del fegato e linfonodi mesenterici (MLN) in macachi che permette di aumentare la frequenza di campionamento, e riduce il rischio di complicanze chirurgiche rispetto ad eseguire una laparotomia.
I linfonodi mesenterici (MLN) e il fegato sono esposti a microbi e prodotti microbici dal tratto gastrointestinale (GI), che li rende unici immunologicamente. Il tratto GI e MLN associati sono siti di replicazione virale nelle prime fasi dell'infezione umana da virus dell'immunodeficienza (HIV) e la MLN sono probabili importanti siti serbatoio che ospitano cellule latentemente infette anche dopo prolungata terapia antiretrovirale (ART). Il fegato ha dimostrato di svolgere un ruolo significativo nella risposta immunitaria a lentivirus e sembra svolgere un ruolo significativo della clearance del virus dalla circolazione. primate non umano modelli (NHP) per l'HIV e la sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) imitano da vicino questi aspetti di infezione da HIV e di serie campionamento longitudinale siti primari di replicazione virale e le risposte immunitarie associate a questo modello contribuirà a chiarire gli eventi critici in infezione, patogenesi e l'impatto delle varie strategie di intervento su questi eventi. currtecniche ent pubblicato a campione fegato e MLN insieme coinvolgono chirurgia e / o necroscopia principale, che limita la capacità di indagare questi siti importanti in modo seriale nello stesso animale. Abbiamo precedentemente descritto una tecnica laparoscopica per la raccolta dei MLN. Qui, si descrive una tecnica laparoscopica minimamente invasiva per il campionamento longitudinale serie del fegato e MLN attraverso gli stessi due posizioni delle porte necessarie per la raccolta di MLN. L'uso degli stessi due porte minimizza l'impatto agli animali come sono necessarie incisioni aggiuntivi. Questa tecnica può essere utilizzata con aumentata frequenza di campionamento rispetto alla chirurgia addominale e riduce il rischio di complicazioni chirurgiche ed associato risposte infiammatorie locali e sistemici che potrebbero complicare l'interpretazione dei risultati. Questa procedura ha il potenziale per facilitare gli studi che coinvolgono modelli NHP migliorando nel contempo il benessere degli animali.
Il tratto gastrointestinale (GI) è più grande superficie mucosa del corpo ed è esposto ad una miriade di antigeni derivati da alimenti, agenti patogeni, e comunità batteriche endosimbiontica comunemente denominato microbiome 1, 2. linfonodi mesenterici (MLN) fiancheggiano il tratto gastrointestinale e sono un luogo principale della funzione immunitaria per promuovere le risposte infiammatorie o tolerogeniche verso questi diversi antigeni. L'organizzazione fisica del MLN crea un sistema di compartimenti in grado di rispondere ad antigeni localmente senza suscitare risposte sistemiche 3. Analogamente, il sangue di fogna tratto gastrointestinale al fegato attraverso la vena porta prima di tornare in circolazione, ed è quindi esposto a microbi e prodotti microbici che sono traslocati dal tratto GI nella lamina propria e inseriti nel flusso sanguigno 4. Il fegato funziona anche come secondaria linfoide organo unnd ha un gran numero di cellule immunitarie, compresi i macrofagi specializzati, per rimuovere i microbi traslocata 5, 6. Così, il MLN ed il fegato sono gli organi immunitarie primarie esposte a commensali e batteri patogeni nel tratto GI, nonché l'ambiente di antigeni da altre fonti, rendendoli unici e importanti dal punto di vista immunologico.
Il MLN sono siti critici per la valutazione degli effetti virologici e immunologici del virus dell'immunodeficienza umana (HIV) o infezione patogeno virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV), e sono probabilmente coinvolti nella diffusione precoce di SIV seguente sfida intrarettale. Galt è noto per essere un importante sito di persistente replicazione di HIV, nonostante il controllo effettivo della viremia da terapie antiretrovirali moderni (ART) 7. In modelli di infezione da SIV, MLN hanno dimostrato di essere importanti serbatoi di latent virus e maggioil serbatoio primario 8, 9. Il fegato è importante anche infezione lentivirale come dimostra l'accumulo di specifiche cellule T CD8 + SIV nei fegati di macachi durante l'infezione acuta SIV 10. Inoltre, è il principale organo responsabile per la cancellazione del virus dalla circolazione 11.
HIV e SIV infezione sono associati con alterata microbioti GI, interrotto integrità epiteliale GI, e una maggiore traslocazione di microbi e prodotti microbici dal colon nella periferia e circolazione 12, 13. Questi processi sono associati con l'attivazione immunitaria locale e sistemica, e aumentata morbidità e mortalità in HIV individui infetti 14. In infezione SIV, batteri traslocati sono stati osservati nel MLN 15, considerando che l'accumulo di microfonoprodotti robial nel fegato ha dimostrato di causare infiammazione e danni all'organo 16. Così, nel contesto di HIV e SIV infezioni, il MLN e fegato possono essere altamente informativo per la comprensione dei processi infiammatori guidati da batteri GI residente.
Qui, presentiamo una tecnica laparoscopica minimamente invasivo per il campionamento di serie del MLN e fegato nei primati non umani (NHP). Dimostriamo performance di successo di questa tecnica su due sani macachi rhesus femmina (RMS), il campionamento ogni animale due volte, con 160 giorni tra ogni intervento chirurgico. Andiamo a utilizzare questi esempi per valutare e confrontare chiave leucociti e linfociti popolazioni all'interno di ciascun organo citometria a flusso, e dimostrare dati altamente coerenti tra i due punti di tempo.
Qui, dimostriamo una tecnica minimamente invasiva per la raccolta di serie MLN e biopsie epatiche che ha avuto un tasso di successo del 100% in questi e altri animali non descritti in questo studio. Inoltre, l'uso di questa tecnica sugli stessi animali attraverso il tempo non è stato associato ad eventi avversi. In effetti, non ci sono state complicazioni derivanti dall'uso di questa tecnica in altre coorti di animali che sono stati infettati con SIV, Simian / virus dell'immunodeficienza umana (SHIV), o il virus Zika (dati non pubblicati). Allo stesso modo, questa chirurgia è dimostrata efficace anche negli animali che avevano precedentemente sottoposti a chirurgia addominale maggiore, e negli animali trombocitopenica (dati non pubblicati). Abbiamo dimostrato che questi campioni possono essere raccolti attraverso gli stessi due porte invertendo la posizione della telecamera quando si passa da MLN al fegato evitando la necessità di incisioni addizionali. Fattori che influenzano la raccolta di MLN sono stati precedentemente segnalati 13.
<pclass = "jove_content"> Fino a quattro raccolte di 3 MLN e 3 biopsie epatiche ciascuno sono stati effettuati nel tempo sui singoli animali, senza complicazioni, variazioni dei tassi di successo, o modifiche ai dati raccolti. Inoltre, questa tecnica di raccolta / epatica laparoscopica MLN è stato unito con successo con altre procedure come la raccolta di linfonodi periferici, endoscopiche biopsie GI superiore e inferiore, aspirazione del midollo osseo, raccolta del fluido cerebrospinale, e venipuntura allo stesso evento anestetico permettendo di valutare ampiamente virologico e risposte immunologiche in modo seriale (dati non pubblicati).L'intera procedura richiede in genere 30 – 45 minuti per completare e si realizza attraverso due ~ 0,5 cm incisioni. Negli animali obesi, può essere necessario fare una grande incisione (~ 1-1,5 cm) per recuperare MLN attraverso e può richiedere più tempo per completare. Gli animali con vasta grasso mesenterico richiedono spesso una significativa esperienza a differentiate MLN dal grasso circostante. MLN si trovano spesso lungo la vascolarizzazione mesenterica e sembrano essere più frequenti nei pressi di punti di ramificazione nei vasi. Un aspetto critico di questa tecnica è che richiede l'MLN selezionati per avere una sufficiente mobilità nel mesentere essere esteriorizzato attraverso l'incisione addominale. Di conseguenza, questa tecnica non può essere utilizzata per raccogliere MLN vicino alla radice del mesentere. A causa di ingrandimento, è a volte più facile identificare MLN con la telecamera, e cogliere in prossimità della MLN può aiutare con localizzare e identificare il nodo una volta che è esteriorizzato.
L'uso della posizione di Trendelenburg non può sempre essere necessaria per la raccolta MLN, e se MLN possono essere facilmente recuperate senza l'uso di Trendelenburg può rendere biopsie epatiche facile poiché impedisce gli organi da spostare cranialmente. A volte, dopo il posizionamento nella posizione di Trendelenburg, il fegato è spostata verso l'alto contro il diaframma e mosto essere delicatamente manipolato in posizione prima della raccolta biopsia. Come il posizionamento porta per la raccolta MLN è a sinistra, biopsie epatiche sono tipicamente prelevati dai lobi epatici mediale laterale sinistra e sinistra quanto sono più vicini alla cannula.
Raccolta MLN e biopsie epatiche forniti ampi rendimenti cellulari per una varietà di analisi a valle e mostravano elevata vitalità delle cellule raccolte. Qui, le cellule sono state colorate per l'analisi di citometria di flusso di leucociti e linfociti popolazioni, e le differenze principali tra questi due importanti organi del sistema immunitario sono stati chiariti. Ad esempio, il MLN erano altamente arricchito per le cellule T CD4 + rispetto al fegato, data l'importanza della MLN come punti centrali di raccolta e di diffusione di risposte immunitarie adattative, nonché l'importanza di CD4 + T per la gestione infiammatori e risposte tolerogeniche per l'ambiente antigeni derivati dalla dieta e microrganismi GI residentes = "xref"> 24. Tuttavia, il fegato è stata significativamente arricchito per CD14 + leucociti rispetto al MLN. CD14 è espresso prevalentemente sui monociti e macrofagi ed è un componente chiave del complesso recettore per lipopolisaccaride batterico (LPS) 25. Infatti, l'aumento delle concentrazioni plasmatiche di CD14 solubile sono associati con traslocazione microbica e attivazione immunitaria HIV e SIV infezioni patogene 26. Così, frequenze più elevate di CD14 + leucociti nel fegato probabilmente il risultato di una maggiore carica batterica in questo organo rispetto al MLN.
Qui, dimostriamo una tecnica chirurgica mini-invasiva e rapida per la raccolta di serie del MLN e biopsie epatiche utilizzando solo due piccole incisioni per l'ingresso laparoscopica, che non ha portato ad alcun esito avverso. Questi campioni forniscono un percorso utile per valutare principali processi immunologici, virologici e microbiologici che prendono plaCe nel MLN e fegato, che sono separati e unico da immunità sistemica. Analogamente, biopsie epatiche sono critici per la valutazione a lungo termine degli effetti di HIV / SIV, terapie farmacologiche, e microbi traslocati, che spesso si combinano per indurre danno epatico significativo 16. Inoltre, poiché la MLN e il fegato sono gli organi del sistema immunitario esposti a GI microbiota, la capacità di valutare l'immunità in questi organi attraverso il tempo fornisce una piattaforma eccellente per la comprensione del ruolo che il microbiome gioca nel mantenere l'omeostasi immunitaria ospite. Nel loro insieme, la valutazione del fegato e MLN è di grande importanza nel contesto del vaccino e efficacia terapeutica, SIV pallone reservoir virale, e l'immunità mucosale generale. La capacità di raccogliere questi campioni attraverso un approccio minimamente invasivo significa che c'è meno rischio di infiammazione correlati alla procedura di esiste con tecniche attualmente pubblicati e minore impatto sulla fisiologia degli animali. Nel Future, sarà valutata la possibilità di combinare la raccolta di MLN e fegato con la raccolta di milza attraverso le stesse due posizioni delle porte per consentire il campionamento di un altro elemento importante e distinta del sistema immunitario che ha dimostrato di giocare un ruolo significativo nel un certo numero di modelli di malattia.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dal NIH codice di autorizzazione P51OD010425.
Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
Hospira Lactated Ringer's 250 ml | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
Multipurpose Rigid Scope, 2.7mm x 187.5mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
Exam and Protective Sheath for 2.7mm x 187.5mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
Rigid scope, 5mm x 300mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
Veress Needle, 2mm x 80mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
Solid Probe with Markings, 5mm x 320mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5mm x 240mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
Biopsy Forceps, 3.5mm X 310mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
CO2 | Airgas | CD USPE | |
RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
5mL Syringe | BD | 309646 | |
50mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
5mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
LSR II Flow Cytometer | BD | NA |