כאן, אנו מתארים טכניקה לפרוסקופית זעיר-פולשנית, דגימה סדרתי של הכבד וקשרי הלימפה mesenteric (MLN) ב קופי המאפשר תדר הדגימה גדל, ומפחית פוטנציאל לסיבוכים כירורגיים בהשוואה ביצוע פיום.
בלוטות הלימפה mesenteric (MLN) ואת הכבד חשופים לחיידקים ומוצרים חיידקים ממערכת העיכול (GI), מה שהופך אותם ייחודית אימונולוגית. מערכת העיכול ואת MLN הקשורים הן באתרי התרבות הנגיף בשלב מוקדם וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) זיהום ואת MLN אתרים המאגר חשוב להניח כי הנמל תאים נגועים רדום גם לאחר טיפול תרופתי ממושך (ART). הכבד הוכח לשחק תפקיד משמעותי תגובה חיסונית lentiviruses ומופיע לשחק תפקיד משמעותי אישור של וירוס ממחזור. הפרימאטים הלא-אנושיים (NHP) מודלים ל- HIV תסמונת הכשל החיסוני הנרכש (איידס) מחקה היבטים אלה של הידבקות ב- HIV ודגימה האורך סדרתי של האתרים העיקריים של שכפול נגיפי ואת התגובה החיסונית קשורה במודל זה יעזור להבהיר אירועים קריטיים זיהום, בפתוגנזה , ואת ההשפעה של אסטרטגיות התערבות שונות על אירועים אלה. currאף אוזן גרון שפורסם טכניקות לדגום בכבד MLN יחד לערב ניתוח גדול ו / או necropsy, אשר מגביל את היכולת לחקור אתרים חשובים אלה באופן סדרתי באותה חיה. תיארנו בעבר בטכניקה לפרוסקופית לאיסוף mln. כאן, אנו מתארים טכניקה לפרוסקופית זעירה-פולשנית, דגימה אורכת סדרה של כבד MLN דרך אותו בשני מיקומי יציאת נדרש לאיסוף mln. השימוש באותו שתי יציאות ממזער את ההשפעה על החיות כמו שום חתכים נוספים נדרשים. טכניקה זו יכולה לשמש עם תדר דגימה גדל לעומת ניתוח בטן גדול ומפחיתה הפוטנציאל לסיבוכים כירורגיים הקשורים לתגובות דלקתיות מקומיות מערכתיות שעלולות לסבך פרשנות של תוצאות. יש הליך זה פוטנציאל להקל מחקרים שכללו דגמים NHP תוך שיפור רווחת בעלי החיים.
העיכול (GI) בדרך היא המשטח הרירי הגדול ביותר בגוף, והוא חשוף מספר עצום של אנטיגנים שמקורם במזון, פתוגנים, וקהילות חיידקים endosymbiotic המכונה כמו Microbiome 1, 2. בלוטות לימפה Mesenteric (MLN) קו העיכול והם אתר המנהלת של תפקוד מערכת החיסון לקידום תגובות דלקתיות או tolerogenic כלפי אנטיגנים מגוונים אלה. הארגון הפיזי של MLN יוצר מערכת ממודרת שיכול לתת מענה אנטיגנים מקומי בלי לעורר 3 תגובות מערכתיות. באופן דומה, הדם מתנקז העיכול אל הכבד דרך וריד השער לפני החזרה במחזור, ובכך נחשף חיידקים ומוצרי חיידקים אשר translocated מן העיכול לתוך שכבת הרירית המיוחדת ונכנס הדם 4. הכבד מתפקד גם בתור איבר משני הלימפהיש nd מספר רב של תאי מערכת החיסון, כולל מקרופאגים מיוחדים, כדי להסיר חיידקים translocated 5, 6. לפיכך, MLN ואת הכבד הם האיברים החיסון הראשוני חשוף commensal וחיידקים פתוגניים מ העיכול, כמו גם את המילייה של אנטיגנים ממקורות אחרים, מה שהופך אותם ייחודית וחשובה מבחינה אימונולוגית.
MLN אתרים קריטי להערכה של השפעות וירולוגית ו אימונולוגית של נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) או וירוס הכשל החיסוני הקופי פתוגניים (SIV) זיהום, והם קרוב לוודאי מעורבים הפצת מוקדם של SIV בעקבות האתגר intrarectal. גוט-מזוהה רקמת הלימפה ידוע להיות אתר מרכזי של שכפול HIV מתמיד, למרות שליטה אפקטיבית של viremia ידי טיפולים אנטירטרוויראלי המודרני (ART) 7. במודלי זיהום SIV, MLN הוכח להיות מאגרים חשובים של נגיף רדום והוא רשאילהיות המאגר 8 העיקרי, 9. הכבד הוא גם חשוב זיהום lentiviral כפי שמעיד ההצטברות של תאים ספציפיים SIV CD8 + T ב הכבד של קופי במהלך הזיהום חריף SIV 10. יתר על כן, זה הוא האיבר העיקרי אחראי ניקוי הווירוס ממחזור 11.
HIV וזיהומים SIV המשויכים החיידקים במערכת העיכול שינו, שיבשו שלמות האפיתל GI, והגדילה טרנסלוקציה של חיידקים ומוצרי חיידקים מהמעי אל הפריפריה במחזור 12, 13. תהליכים אלה הקשורים הפעלה חיסונית מקומית מערכתית, וגדילה לתחלואה ולתמותה ואנשים נגועים באיידס 14. בשנת זיהום SIV, חיידקים translocated נצפו ב MLN 15, ואילו הצטברות של מיקרופוןמוצרי robial בכבד הוכח לגרום לדלקת פגיעה באיבר 16. לפיכך, בהקשר של HIV ודלקות SIV, את MLN והכבד יכול להיות אינפורמטיבי מאוד להבנת תהליכים דלקתיים מונע על ידי חיידקים במערכת העיכול-תושב.
כאן, אנו מציגים טכניקה לפרוסקופית זעיר-פולשנית, דגימה סדרתי של MLN והכבד אצל פרימטים לא אנושיים (NHPs). אנו להפגין ביצועים מוצלחים של טכניקה זו על שני קופי רזוס נקבה בריא (RMS), דגימת כל חיה פעמים, עם 160 ימים בין כל ניתוח. אנחנו הולכים על מנת להשתמש בדגימות הללו כדי להעריך ולהשוות אוכלוסיות לויקוציטים ו הלימפוציטים מפתח בתוך כל איבר באמצעות cytometry זרימה, ולהפגין נתונים עקביים ומתמשך בין שתי נקודות הזמן.
הנה, אנחנו מדגימים טכניקה פולשנית עבור אוסף סדרה של MLN ו ביופסיות כבדות כי הייתה שיעור הצלחה 100% בחיות אלו ואחרות לא המתוארים במחקר זה. יתר על כן, שימוש בטכניקה זו על אותו החיים ברחבי זמן לא היה קשור בשום תופעות לוואי. ואכן, לא חלו סיבוכים הנובעים משימוש בטכניקה זו בקבוצות אחרות של בעלי חיים שהיו נגועים ב- SIV, הקופי / וירוס הכשל החיסוני האנושי (שיב), או וירוס זיקה (נתונים שלא פורסמו). בדומה לכך, הניתוח הזה הוכיח את יעילותו גם אצל בעלי חיים שעברו ניתוח בטן גדול בעבר, והן חיות thrombocytopenic (נתונים שלא פורסמו). הראינו כי דגימות אלה ניתן לאסוף באמצעות אותם שני פורטים על ידי היפוך מיקום המצלמה בעת מעבר MLN בכבד הימנעות צורך חתכים נוספים. גורמים המשפיעים על האוסף של MLN דווחו בעבר 13.
<p class = "jove_content"> עד ארבע קולקציות של 3 MLN ו 3 ביופסיות כבדות כל בוצע לאורך זמן על בעלי חיים בודדים בלי סיבוכים, שינויים בשערי ההצלחה, או שינויים בנתונים שנאספו. בנוסף, טכניקת אוסף MLN / כבד לפרוסקופיים זה כבר משולב בהצלחה עם הליכים אחרים כגון אוסף של LNs פריפריה, ואת עליונות אנדוסקופית נמוכות ביופסיות GI, שאיבת מוח עצם, אוסף נוזל השדרתי, ו venipuncture באותו אירוע ההרדמה המאפשר הערכה מקיפה של וירולוגית ותגובות חיסוניות באופן סדרתי (נתונים שלא פורסמו).ההליך כולו בדרך כלל לוקח 30 – 45 דקות כדי להשלים מושגת באמצעות שני ~ 0.5 חתכים ס"מ. אצל בעלי חיים שמנים, ייתכן שיהיה צורך לבצע חתך גדול יותר (~ 1 – 1.5 ס"מ) כדי לאחזר MLN דרך ולהצריך זמן נוסף כדי להשלים. בעלי חיים עם שומן mesenteric נרחב קרובות דורשים ניסיון משמעותי דifferentiate MLN מן השומן שמסביב. MLN נמצא בדרך כלל לאורך כלי דם mesenteric ו נראה נפוצה יותר ליד נקודות סניף הכלי. היבט קריטי של הטכניקה הזו הוא שהיא דורשת MLN הנבחרת יש ניידות מספיק לפדר להיות exteriorized דרך החתך בבטן. כתוצאה מכך, הטכניקה הזו לא ניתן להשתמש כדי לאסוף MLN קרוב לשורש לפדר. בשל ההגדלה, זה לפעמים יותר קל לזהות MLN עם המצלמה, ואוחזים בסמיכות לבית MLN יכול לעזור באיתור וזיהוי הצומת לאחר שהוא exteriorized.
תנוחת Trendelenburg לא תמיד תידרש לאיסוף MLN, ואם MLN ניתן לאחזר בקלות ללא שימוש בעמדת Trendelenburg זה יכול לעשות ביופסיות כבדות יותר קלה כפי שהוא ימנע את האיברים מן ההסטה cranially. לפעמים, אחרי מיקום עמדת Trendelenburg, הכבד מוסט למעלה נגד הסרעפת וחייבת לטפל בעדינות חזרה למקומו לפני לאוסף ביופסיה. כמיקום היציאה לאיסוף MLN הוא שמאלה, ביופסיות כבדות בדרך כלל נלקחות מן האונות בכבד המדיאלי לרוחב שמאל שמאל כפי שהם קרובים הצינורית.
MLN נאסף ביופסיות כבדות ספקו תשואות תא מספיק עבור מגוון רחב של זרם ניתוחים והראו כדאיויות גבוהות של התאים שנאספו. הנה, התאים היו מוכתמים עבור ניתוח התזרים cytometric של אוכלוסיות לויקוציטים ו לימפוציטים, ואת ההבדלים עיקריים בין שני האיברים חיסוניים חשובים האלה לובנו. לדוגמה, MLN היו מועשר עבור תאים מסוג CD4 + T לעומת הכבד, בשל החשיבות של MLN כנקודות מרכזי לאיסוף והפצת המערכת החיסונית אדפטיבית, כמו גם את החשיבות של CD4 + T לניהול דלקתיות תגובות tolerogenic אל המילייה אנטיגנים שמקורם צריכה תזונתית ומיקרואורגניזמים GI-התושבs = "Xref"> 24. עם זאת, הכבד הועשר משמעותי עבור CD14 + לויקוציטים בהשוואת mln. CD14 מתבטא בעיקר על מונוציטים מקרופאגים ומהווה מרכיב מרכזי של מתחם קולטן עבור lipopolysaccharide חיידקים (LPS) 25. ואכן, ריכוזי פלזמה מוגברים CD14 המסיס הקשורים טרנסלוקציה חיידקי הפעלה חיסונית ב HIV ודלקות SIV פתוגניים 26. לפיכך, תדירות גבוהה יותר של CD14 + לויקוציטים בכבד תוצאה מסתברת מנטל חיידקי יותר האיבר הזה בהשוואה mln.
הנה, אנחנו מדגימים טכניקה כירורגית מהירה זעירה-פולשנית, אוסף סדרה של MLN ו ביופסיות כבדות רק באמצעות שני חתכים קטנים לכניסה לפרוסקופי כי לא הובילה לשום תוצאות שליליות. דגימות אלה משמשות ערוץ שימושי להעריך Virological אימונולוגית, מפתח, ואת תהליכי מיקרוביולוגים כי לקחת PLACE ב MLN והכבד, נבדלות וייחודיות מחסינות מערכתית. באופן דומה, ביופסיות כבד הן קריטיות עבור הערכה ארוכת טווח של תופעות של HIV / SIV, טיפולים תרופתיים, חיידקים translocated, אשר לעתים קרובות לשלב כדי לגרום נזק כבד משמעותית 16. יתרה מזאת, מאחר MLN והכבד הם איברים חיסוניים חשופים חיידקים במערכת עיכול, את היכולת להעריך חסינות באיברים אלה על פני הזמן מספק פלטפורמה מצוינת להבנת התפקיד כי Microbiome משחק בשמירה על הומאוסטזיס החיסון של פונדקאי. יחדיו, הערכה של הכבד MLN הנה בעלת חשיבות רבה בהקשר של חיסון efficacies הטיפולית, אישור למאגר ויראלי SIV, וחסינות רירית בכלל. היכולת לאסוף דגימות אלה באמצעות גישה פולשנית כלומר יש פחות סיכון של דלקת הקשורים בהליך מ קיים עם טכניקות שפורסמו כרגע ופחות השפעה על פיזיולוגית החיות. ב פוture, נוכל להעריך את הפוטנציאל לשלב את אוסף MLN וכבד עם האוסף של טחול באמצעות אותם שני מקומות הנמל כדי לאפשר דגימה של עוד חלק חשוב וייחודי של מערכת החיסון כי הוכח לשחק תפקיד משמעותי מספר מודלי מחלה.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי P51OD010425 מספר מענק NIH.
Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
Hospira Lactated Ringer's 250 ml | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
Multipurpose Rigid Scope, 2.7mm x 187.5mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
Exam and Protective Sheath for 2.7mm x 187.5mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
Rigid scope, 5mm x 300mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
Veress Needle, 2mm x 80mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
Solid Probe with Markings, 5mm x 320mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5mm x 240mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
Biopsy Forceps, 3.5mm X 310mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
CO2 | Airgas | CD USPE | |
RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
5mL Syringe | BD | 309646 | |
50mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
5mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
LSR II Flow Cytometer | BD | NA |