라이브 셀 이미징은 동적 프로세스를 시각화 하는 강력한 도구입니다. 고정된 셀의 시험만 정적 사진을, 오해 및 과정에 대 한 혼란으로 이어질 수 있는 제공 합니다. 이 작품 이해, 약물 방출, 및 자주 나노 살아있는 세포에서의 세포내 지역화 하는 방법을 제공 합니다.
기존의 이미징 기술을 세포 프로세스에 대 한 자세한 정보를 제공할 수 있습니다. 그러나,이 정보는 그렇지 않으면 동적 시스템에서 정적 이미지에 근거 하 고 연속 단계는 쉽게 간과 되거나 오해. 라이브 셀 이미징 및 시간 경과 현미경 검사 법, 있는 살아있는 세포 수에 따라 몇 시간 또는 며칠 더 많거나 적은 연속 방식에서 들이 따라서 매우 유익한. 여기에 설명 된 프로토콜 살아있는 세포에서 독 소 루비 (dox)의 납품 후에 화학요법 나노 입자의 운명을 조사 수 있습니다. Dox는 intercalating 에이전트 생물학적으로 활성 되는 nanocarrier에서 발표 해야 합니다. 십년 이상에 대 한 임상 등록, 불구의 이해, 분석, 및 약물 방출 아직도 완전히 이해 된다. 이 기사에서는 지질 기반 나노 입자는 종양 세포에 의해 채택 하 고 천천히 저하 가설. 출시 된 dox 핵에 translocated 다음 이다. 고정 아티팩트를 방지 하기 위해, 라이브 셀 이미징 및 시간 경과 현미경 검사 법,이 실험 절차에 따라 적용할 수 있습니다.
세포 세포 상호 작용 같은 생물 학적 과정에 따라 수 간-세포내 수송, 세포 독성 화합물 통풍 관, 및 살아있는 세포와 조직에 단일 분자의 단백질 단백질 상호 작용 및 마지막에 큰 관심을 얻고 있다 10 년, “실시간”의 여분의 차원을 제공 합니다 이 원고에서 무료 dox dox 나노 (Dox-NP)에 통합의 세포내 운명에 따라 하는 방법 설명입니다.
나노 입자 특정 암 치료에 수십 년 동안 사용 되었습니다. 에이즈 관련 Kaposi 육 종, 치료에 대 한 난소 고급 유방암과 다중 골 수 종1, Dox NP 승인 되었습니다. 그것은 첫 번째 자주 나노 입자 개발 및 임상 설정에서 도입 중 하나 였다. 자유형, dox, 광대 하 게 충분 한 양의 종양 사이트에 접근을 제한 하는 혈액 순환에서 지워집니다. 또한, 치료는 심한 고 복용량 제한 부작용, 구내 염, 심장 마비 등을 동반 된다. Pegylated 자주 나노 입자에 캡슐화 순환 시간이 일2분에서 증가 합니다. 콜레스테롤을 포함 하는 이러한 유형의 liposome 상당히 안정적 이며 캡슐화 된 약물의 약 동학이이 안정성에 따라 결정 됩니다.
그러나,이 강성 단점이 있다. 세포 독성 종양 세포에 대 한 화합물의 기능은 첫 번째 평가 된 생체 외에서그리고 그 dox는 Dox-NP에서 세포 독성 분석 실험3,4보다 더 강력한 표시 되었습니다. 그것은 릴리스 및, 약의 세포질 통풍 관을 방지 하는 캐리어의 안정성 그리고이 현상 더 조사 가치가 가설 했다. 대상 사이트 (즉, 종양에서 세포 독성 구성 요소 (즉, dox)의 장애인된 bioavailability 귀착되 었 다 혈 류에서 공격적인 요소를 마지막에 그대로, 종양 사이트에 도달를 내장 기본 자주 속성 세포 핵)입니다. Dox NP 대담 자유 형식에 비해 응답을 개선, 비록 그것은 여전히 임상 값의 캡슐화는 크게5cardiotoxic 효과 감소. 다음 몇 년 동안, 다른 화합물 나노 캐리어6캡슐 했다. 또한, 반송파 수정 트리거 마약 릴리스 (즉, 종양 사이트)에서 가져왔지만 혈액 순환을7,8에 안정성을 유지. 조사 및 임상 사용의 년에 불구 하 고 같은 Dox NP nanocarriers의 intratumoral 운명을 아직 명확 하지 않다 완전히. 최근 간행물에서 그것 동안에 dox 리소좀9에 갇혀는 나노 전체적으로 채택 되는 표시 했다.
나노 및 약물 방출의 세포질 통풍 관에는 최고의 라이브 셀 이미징 사용 하 여 모니터링할 수 있는 동적 프로세스입니다. 또한, 클래식 조직학, 셀에서 알을 품는 그리고 잘못 된 결과 줄 수 그 후 고정, 고정 자주 캐리어를 파괴 하 고 유물을 소개 하는 경우. 라이브 셀 이미징에 대 한 주요 요구 사항 시각화, 형광, 선호에 의해 원하는 과정입니다. Dox, 같은 특정 화합물 있다 본질적인 붉은 형광. 또한, 형광 마커는 캐리어에 소개 될 수 있다 고 휴대 organelles 라이브 셀 마커를 사용 하 여 구상 될 수 있다. 이 방법에서는, 매개 변수, 캐리어, 마약 릴리스 및 캐리어 및 마약, 셀룰러 현지화의 다양 한 군데 고 분석 될 수 있습니다. 여기, 메서드는 dox Dox-NP 여러 종양 세포에서의 세포 운명 뒤에 실시간으로 설명 합니다. 또한,이 방법은 쉽게 적용할 수 있습니다 (예를 들어, 나노 입자10청구) 대상 및 실행에 대 한 이상적인 조건을 만들려고 마약 릴리스 (예: 고 열7).
과거에 관측 된 고정 거의 즉시 자주 nanocarriers를 파괴할 수 있다 고 DXR 발표 양식 이러한 파괴 리는 여전히 핵, 입력 시간 했다 매우 어렵고 심지어 잘못 된 데이터의 해석 만들기. 일부 미세한 조정, 살아있는 세포 및 조직 화학요법 운명 수 정기적으로 조사 확인 또는 조직학 관측 전복. 최근 종이 자유롭고 캡슐화 된 dox 라이브 셀 시간 경과 영상9를 사용 하 여 치료 하는 셀에 통풍 관, 릴리스 및 DXR의 지역화를 보여주었다. 이 작품에서는 좀 더 자세하게에서 실험적인 체제를 설명합니다. 이 모델을 사용 하 여, 그것은 핵에 dox의 즉각적인 교통을 시각화 수 그것은 지속적으로 셀 결국 죽을 때까지 축적. 대조적으로, Dox NP를 사용 하면 적은 양의 나온된 dox 핵에서 발견 된다. 지속적인 노출 결과 연속 DXR 형성, 형광 신호 이지만 Dox에 훨씬 낮은-NP-dox 처리 세포 대 세포 농도 후속 세포 독성에 차이 나타내는. 또한, 라이브 셀 표식을 사용 하 여 그것, Dox NP에는 셀을 노출할 때 DXR 및는 nanocarrier에에서 있는 리소좀 표시 했다. 이 완전 한 liposome 셀에 의해 채택 되 고 이러한 나노 입자의 통풍 관 동안 endocytic 통로의 참여 보여줍니다 나타냅니다. 핵에서 DXR 나온된 dox에서 명확 하 게 이다. 그러나, DXR와 캐리어 공동 지역화와 리소좀에 갇힌 것이 방법을 사용 하 여, 아니에요 아직 결정적인이 캡슐화 여부 dox를 발표. 나노 입자의 본질적인 안정성 dox 릴리스는 리소좀에 지역화 방지 가능 하다.
이 프로토콜에서 라이브 셀 이미징 맞춤 단계 홀더 (사양 요청에 주어질 수 있다)를 가진 특정 현미경 설치를 사용 하 여 증명 됩니다. 그러나, 가장 confocal 현미경 제조 수행 라이브 셀 이미징 하는 인큐베이터의 범위를 제공 합니다. 세포 배양 조건 (즉, 온도, CO2, pH, 습도, 및 불 임)을 보존은이 산부인과의 주요 기준 이며 적절 한 상태를 확인 하기 위해 몇 가지 예비 테스트는 추가 설명입니다. 자동화 된 데이터 수집 프로그램은 또한 동일한 제조 업체에 의해 전달할 수 있습니다. “멀티 위치” 옵션 통계 분석 정제 동일한 약 실에서 여러 위치에 이미지를 가능 하 게. 그러나,이 원고에 언급 된 매크로에서이 옵션 고정된 XYZ 위치, Z-드리프트에 대 한 수정 가능성 있는 손실 됩니다 필요 합니다. 이 매크로에 분석에 대 한 초점 비행기 사용 Z-차원 검사를 포함할 수 있습니다. 그러나,이 여분의 검색, phototoxicity의 가능성을 증가 하 고 표백 필요 합니다.
모든 형광 측정, 것과 같이 과도가 문제다, 다른 세포질 통풍 관을 가진 두 화합물을 비교 하는 경우에 특히. 형광 강도 통풍 관, 농도, 및 약물 노출 시간 속도에 뿐만 아니라, 화합물의 본질적인 신호에 따라 종속 되지 않습니다. 그림 3에서 보듯이, 반면에 Dox NP 처리 셀에서 아무 신호를 볼 dox 처리 셀의 핵 DXR 콘텐츠 표시, 이미입니다. 증가 하는 이득에 의해서만 수 Dox NP 처리 셀에서 DXR 구상 될, dox 처리 셀에 과도에 지도. 또한,도 침, Dox NP heterogeneously 배포는 아래 피할 수 없는 발생할 수 있습니다-또는 노출 과도. 세포질 DXR 함정 수사를 조사 하는 경우에 특히 이득 개별 세포 (그림 5B 및 5c)을 구별 하는 것 크게 감소 되었다. 따라서, 픽셀 밀도로 표현 하는 측정 결과의 적절 한 해석에 대 한 대표적인 이미지에 의해 동반 되어야 합니다.
Phototoxicity 표백, 낮은 신호 대 잡음 비율에에서는, 및 또한 중요 한 문제 형광 현미경 검사 법, 그리고 이미지의 품질과 이미지 수집 사이 타협을 설정 해야 합니다. 그러나, 현미경 설치 최적입니다, 경우에 이미지 품질은 또한 크게 전지와 추가 화합물의 품질에 의해 결정 됩니다. DXR 강한 신호를 제공 하 고, 적절 한 주의와 표백 하지 관찰 되었다, (최대 72 h) 오랜 후에. 그러나, 형광 신호 감소 경과의 결과 수 있습니다. 경과 약물 저항15 중요 한 현상 이며 셀 펌프 액션의 세포내 사이트에서 마약을 하는 경우에 발생 합니다. 시간이 지남에 형광 신호 감소 하실 수 있습니다 따라서 dox 경과9의 결과. 표백 시연할 예정 이다 시간 경과 시리즈에서 마지막 이미지와 실험의 끝에 비 스캔 위치의 형광 신호를 비교 (즉, 신호 높은 것 비 스캔 위치에서) 또는 (즉, 두 경과 신호 것입니다 동일)입니다. (예를 들어, 배경, 드리프트, 표백, 등) 여러 교정 옵션 ImageJ16같은 프로그램에서 사용할 수 있습니다. 또한, 형광 강도 시간이 지남에 따라 증가, 구성 설정 시간 경과 (단계 3.21)의 끝에 과도 최소화 하기 위해 파일럿 실험에서 미리 계산 된 수 있습니다. 또는, 이미 원하는 기간에 대 한 약물에 노출 된 세포 이미징 챔버 설정을 초기화를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 이러한 유형의 분석, 독성 약물 농도 (단계 3.22) 피해 야 한다 하 고 미리 기존의 바이오-분석 실험을 사용 하 여 설정.
세포는 지속적으로 교양 하 고 페 놀 레드 없이 매체에 유지. 페 놀 레드는 스펙트럼의 빨간 부분에 fluoresces 고 휴대 organelles, 가장 가능성이 리소좀, 거짓 양성 정보 (1.2 단계)에서 관찰 될 수 있다. 개별 셀의 모니터링에 대 한 수 있도록, 셀 합류 70% (3.1 단계.) 넘지 말아야 한다. CO2 흐름-속도 (3.5 단계) 또는 유지 보수 후 유효성 검사 실험 장비를 구입 하는 경우에 통제 될 필요가 있다. 속도가 너무 높은, 중간 증발 됩니다. 속도 너무 낮은 경우에, 세포 성장에 영향을 미칠 수 있는 매체의 pH 증가 합니다. 매체 없이 pH에 페 놀 레드 산도 표시기 변경 관찰 될 수 없다 고 따라서 쉽게 간과 된다. CO2 흐름의 유효성을 검사 하는 일단 이러한 설정은 모든 미래 실험에 사용할 수 있습니다.
여기 설명 하는 방법을 사용 하 여, 나노 입자의 운명 수 있다 쉽게 조사 라이브 셀 이미징 및 시간 경과 현미경을 사용 하 여. 이 절차에서는 상업적으로 이용 가능한 나노 입자 사용 되었다. 그러나, 열에 민감한17, 양이온 리10;의 운명 짧은 체인 shingolipids18; 농축 리 그리고 나노 캡슐화 다른 약물8,19 도 이러한 방법으로 종양과 정상 세포에 조사 되었다.
The authors have nothing to disclose.
사용 하는 현미경 시설 에라스무스 광학 이미징 센터의 일부 이며, 우리는 그들의 서비스에 대 한 OIC의 직원을 감사 하 고 싶습니다.
DMEM (no phenol-red) | Sigma | D1145 | Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | |
Fetal calf serum | Sigma | F7524 | Heat inactivate for 30 min at 55 ºC |
L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | Make a 0,1% solution in PBS, sterile |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
Stericup 0,22 µm filter – 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
Trypan-blue | Sigma | T8154 | |
Cells: Lewis lung carcimoma | ATCC | CRL-1642 | |
Cells: B16BL6 | Dr. P. Brouckaert, Ghent University | donated | Ref.10 |
Cells: BLM and 1F6 | Dr. van Muijen, University of Nijmegen | donated | Ref.11 |
Petri dish | Greiner | 664160 | |
Doxorubicin | Actavis | mentioned as dox in the manuscript | |
Doxil/Caelyx | Janssen-Cilag | mentioned as Dox-NP in the manuscript | |
Syringe filter 0.2 µm | VWR international | 10462200 | |
Lysotracker-green DND-26 | Invitrogen | L7526 | mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript |
Lysotracker-red DND-99 | Invitrogen | L7528 | mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript |
Attofluor cell ring | Invitrogen | A7816 | |
Cover glass 25 mm #1 | Thermo scientific | CB00250RA1 | |
Stage holder + sealing lid | Custom made | ||
ZEISS LSM 510 microscope | Zeiss | ||
Software LSM 510 version 3.2 SP2 | Zeiss | ||
Image J | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |