استخدام في المختبر خلية يعيش التصوير لاستكشاف تشريعات تسليمها بالقاعدة الدهنية جسيمات نانوية
Summary
تصوير خلية يعيش أداة قوية لتصور العمليات الحيوية. فحص الخلايا الثابتة يوفر الصور الثابتة فقط، الذي يمكن أن يؤدي إلى سوء الفهم والالتباس حول هذه العملية. ويعرض هذا العمل وسيلة لدراسة الامتصاص والإفراج عن المخدرات والتعريب داخل الخلايا من جسيمات نانوية الاسمافرون في الخلايا الحية.
Abstract
تقنيات التصوير التقليدية يمكن أن توفر معلومات مفصلة عن العمليات الخلوية. بيد أن هذه المعلومات تستند إلى صور ثابتة في نظام ديناميكي وإلا، والتغاضي عن مراحل متعاقبة أو يساء تفسيرها بسهولة. ولذلك تصوير خلية يعيش والوقت الفاصل بين الفحص المجهري، فيها الخلايا الحية يمكن اتباعها لساعات أو حتى أيام على نحو مستمر أكثر أو أقل، مفيدة للغاية. يسمح البروتوكول هو موضح هنا لتحقيق مصير جسيمات نانوية العلاج الكيميائي بعد تسليم ميتوتريكسات (دوكس) في الخلايا الحية. دوكس هو عامل إينتيركالاتينج الذي يجب أن يصدر من به nanocarrier لتصبح نشاطا بيولوجيا. وعلى الرغم من تسجيل السريرية لأكثر من عقدين، امتصاص وتوزيع المخدرات الإفراج عن هي لا تزال غير مفهومة تماما. ويستكشف هذا المقال فرضية أن جسيمات نانوية القاعدة الدهنية يتم تناولها بالخلايا السرطانية وهي تتحلل ببطء. دوكس المفرج عنهم هو ثم ذوبانها إلى النواة. لمنع تثبيت القطع الأثرية، تصوير خلية يعيش والوقت الفاصل بين الفحص المجهري، هو موضح في هذا الإجراء التجريبي، يمكن تطبيقها.
Introduction
القدرة على متابعة عملية بيولوجية، مثل التفاعلات خلية خلية، في جملة-والنقل داخل الخلايا والإقبال مجمع السامة للخلايا، والبروتين-بروتين تفاعل الجزيئات واحدة في الخلايا الحية والأنسجة، وقد اكتسب أهمية كبيرة على مر آخر العقد، كما أنه يوفر بعدا إضافيا من “الوقت الحقيقي”. في هذه المخطوطة، أسلوب لمتابعة مصير داخل الخلايا الحرة دوكس ودوكس إدراج في جسيمات نانوية (دوكس-NP) وصف.
جسيمات نانوية قد استخدمت على مدى عقود لعلاج أنواع معينة من السرطان. وقد وافق NP دوكس لعلاج الإيدز ساركوما كابوزي، المتقدمة المبيض والثدي السرطان، والورم النخاعي المتعدد1. أنها واحدة من جسيمات نانوية الاسمافرون الأولى واستحداث في الإعداد السريرية. يتم مسح النموذج الحر، دوكس، إلى حد كبير من الدورة الدموية، ويحد من قدرتها على الوصول إلى موقع الورم بكميات كافية. وعلاوة على ذلك، يرافقه العلاج آثار جانبية حادة والحد من الجرعات، مثل التهاب الفم وفشل القلب. عندما مغلفة في سي الاسمافرون جسيمات نانوية يزيد وقت الدورة الدموية من دقائق إلى أيام2. هذا النوع من المحتوية على الكوليسترول الحويصلية مستقر تماما، ويحدد هذا الاستقرار الدوائية للمخدرات مغلفة.
بيد أن هذا الجمود له جانب سلبي. السامة للخلايا قدرة مركب نحو الخلايا السرطانية الأولى المقيمة في المختبر، وقد ثبت أن دوكس أقوى من فحوصات دوكس-NP في السامة للخلايا3،4. كان الافتراض بأن استقرار الناقل يمنع الإفراج والخلوية الإقبال على المخدرات، وأنه من المفيد للتحقيق في هذه الظاهرة كذلك. خصائص الاسمافرون الجوهرية، بنيت لآخر العناصر العدوانية في مجرى الدم وتصل إلى موقع الورم سليمة، أسفرت عن التوافر الأحيائي البصر من المكونات السامة للخلايا (أي دوكس) في موقع الهدف (أي ورم نواة الخلية). على الرغم من تحسن NP دوكس هارديلي الاستجابة مقارنة بالنموذج الحر، كانت لا تزال ذات قيمة السريرية، كما تغليف إلى حد كبير الآثار كارديوتوكسيك5. في السنوات التالية، تم تغليف المركبات الأخرى في ناقلات نانو6. أيضا، تعديل الناقلين أسفرت عن الإفراج عن المخدرات المشغلة (أي، في موقع الورم) لكنها حافظت على استقرار في7،دوران الدم8. ورغم سنوات من التحقيق والاستخدام السريري، مصائر intratumoral نانوكاريرس مثل دوكس-NP لا تزال غير واضحة تماما. في منشور صدر مؤخرا، فقد ظهر اتخاذ نانوحبيبات ككل بينما دوكس تظل حبيسة lysosomes9.
امتصاص الخلوية لبيان نانوحبيبات والمخدرات هي العمليات الدينامية التي يمكن رصد أفضل استخدام التصوير خلية يعيش. وعلاوة على ذلك، علم الأنسجة الكلاسيكية، في الخلايا التي هي المحتضنة وإصلاحها بعد ذلك، يمكن أن يعطي نتائج خاطئة إذا كان التثبيت يدمر الناقل الاسمافرون ويدخل القطع الأثرية. هو الشرط الرئيسي لتصوير خلية يعيش التصور، ويفضل أن يكون ذلك قبل الأسفار، للعملية المطلوبة. مركبات معينة، مثل دوكس، يكون الأسفار حمراء مضمنة. أيضا، يمكن إدخال علامات مضيئة إلى الناقل، ويمكن تصور العضيات الخلية باستخدام علامات خلية يعيش. وبهذه الطريقة، يمكن تصويرها صفيف المعلمات، مثل الإقبال على الناقل، والإفراج عن المخدرات، والتعريب الخلوية للناقل، والمخدرات، وتحليلها. هنا، يتم وصف أسلوب الذي يتبع مصير بين الخلايا دوكس وأرستها دوكس في العديد من الخلايا السرطانية في الوقت الحقيقي. أيضا، هذا الأسلوب يمكن تكييفها بسهولة لخلق الظروف المثالية المستهدفة (مثلاً، اتهم جسيمات نانوية10) وآثار الإفراج عن المخدرات (مثلاً، hyperthermia7).
Protocol
Representative Results
Discussion
كما لوحظ في الماضي، التثبيت يمكن أن تدمر نانوكاريرس الاسمافرون على الفور تقريبا ودكسر صدر النموذج هذه الدهنية المدمرة لا يزال لديه الوقت لإدخال النواة، مما يجعل تفسير البيانات صعبة للغاية وحتى مضللة. مع بعض التعديلات المجهرية، يمكن التحقيق مصير العلاج الكيميائي في الخلايا الحية والأنسجة بشكل روتيني لتأكيد أو الإطاحة بالملاحظات النسيجي. وأظهرت ورقة صدرت مؤخرا الإقبال، الإصدار، وتوطين دكسر الخلايا تعامل مع دوكس مجاناً ومغلفة باستخدام خلية يعيش الوقت الفاصل بين التصوير9. ويصف هذا العمل الإعداد التجريبية بمزيد من التفصيل. باستخدام هذا النموذج، فإنه من الممكن تصور النقل الفوري دوكس للنواة، حيث أنها تتراكم باستمرار حتى الخلية يموت في نهاية المطاف. على النقيض من ذلك، عندما يتم استخدام NP دوكس، تم العثور على كميات صغيرة فقط من دوكس المفرج عنهم في النواة. على الرغم من أن التعرض المستمر يؤدي إلى تراكم دكسر المستمر، إشارة الفلورسنت أقل بكثير في دوكس-NP-مقابل دوكس تعامل الخلايا، مما يشير إلى اختلاف في تركيز الخلايا وسيتوتوكسيسيتي لاحقاً. وعلاوة على ذلك، باستخدام علامات خلية يعيش، اتضح أنه عند تعريض الخلايا التي أرستها دوكس، دكسر وفي nanocarrier تقع في يحلول. يشير هذا إلى أن الحويصلية كاملة بالخلية ويوضح تورط طريقا اندوسيتيك أثناء امتصاص هذه الجسيمات النانوية. من الواضح أن دكسر في النواة من دوكس المفرج عنهم. باستخدام هذا الأسلوب، كما دكسر والناقل المشترك تعريب ويبدو أن يكون الشرك في lysosomes، غير لا تزال غير حاسمة عما إذا كان هذا يتم تغليف أو صدر دوكس. فمن الممكن أن يمنع استقرار جوهري نانوحبيبات دوكس الإصدار عند المترجمة في يحلول.
في هذا البروتوكول، يتجلى تصوير الخلية تعيش باستخدام إعداد مجهرية معينة، مع حامل مرحلة مصنوعة خصيصا (المواصفات يمكن أن تعطي عند الطلب). ومع ذلك، معظم المصنوعات مجهر [كنفوكل] نقدم مجموعة من الحاضنات التي تقوم بتصوير خلية يعيش. المحافظة على شروط ثقافة الخلية (أي درجة الحرارة، CO2، درجة الحموضة، والرطوبة، والعقم) هو المعيار الرئيسي لهذه الحاضنات ويتطلب إجراء بعض التجارب الأولية لتحديد الشروط المناسبة، التي يرد مزيد من الشرح. يمكن أيضا تسليم البيانات الآلي اقتناء البرامج التي تصنع نفس. خيار “موقع متعدد” يجعل من الممكن الصورة عدة مناصب في الدائرة نفسها، صقل التحليل الإحصائي. ومع ذلك، يتطلب هذا الخيار في الماكرو المذكورة في هذه المخطوطة مواقع XYZ ثابتة، الذي يضيع إمكانية لتصحيح Z-الانجراف. مسح Z-البعد يمكن إدراجها في هذا الماكرو واستخدامات الطائرة تركيز للتحليل. ومع ذلك، وهذا يتطلب فحص إضافي، وزيادة إمكانية الضيائية وتبيض.
كما هو الحال مع جميع القياسات الفلورسنت، التعرض المفرط مشكلة، خاصة عند مقارنة مجمعين مع امتصاص خلوية مختلفة. كثافة الفلورسنت لا يتوقف عند إشارة المتأصلة في المجمع، ولكن أيضا على معدل الامتصاص والتركيز ووقت التعرض للمخدرات فقط. محتوى الخلايا تعامل دوكس دكسر النووية كما هو موضح في الشكل 3، بالفعل مرئياً، بينما يعتبر أي إشارة في دوكس-NP-تعامل الخلايا. إلا بزيادة الربح يمكن دكسر في الخلايا دوكس NP-المعالجة بتصور، مما يؤدي إلى التعرض المفرط في الخلايا تعامل دوكس. وعلاوة على ذلك، حتى إينتراسيلولارلي، التي أرستها دوكس بين توزع، الذي يمكن أن ينتج أمرا لا مفر منه في ظل-أو التعرض المفرط. خاصة عند التحقيق في فخ دكسر الخلوية، الكسب خفضت إلى حد كبير إلى التمييز بين العضيات الفردية (5B الأرقام و 5 ج). وهكذا، يجب أن تقترن القياسات ممثلة بكثافة بكسل بالصور التمثيلية للتفسير الصحيح للنتائج.
الضيائية، وتبيض، ونسبة الإشارة إلى الضجيج منخفض أيضا قضايا هامة في الفحص المجهري نيون، ويجب وضع حل وسط بين جودة الصورة والحصول على الصورة. ومع ذلك، حتى عند إعداد المجهر الأمثل، جودة الصورة أيضا تحددها إلى حد كبير نوعية الخلايا والمجمع وأضاف. دكسر يعطي إشارة قوية، ومع الاحتياطات المناسبة، تبيض لم يلاحظ، حتى بعد فترات أطول (ما يصل إلى 72 ساعة). ومع ذلك، يمكن الحد إشارة الفلورسنت أيضا نتيجة افلوكس. افلوكس ظاهرة هامة في مقاومة المخدرات15 ويحدث عندما الخلايا لضخ الدواء من موقع العمل داخل الخلايا. ولذلك يمكن أيضا أن انخفاض إشارة مضيئة على مر الزمن نتيجة دوكس افلوكس9. مقارنة إشارة الفلورسنت من موقع غير الممسوحة ضوئياً في نهاية التجربة مع الصورة الأخيرة من سلسلة الوقت الفاصل بين سوف تثبت تبيض (أي الإشارة سوف يكون أعلى في الموقع غير الممسوحة ضوئياً) أو افلوكس (أي، على حد سواء إشارات ستكون متطابقة). وتتوفر العديد من الخيارات الإصلاحية (مثلاً، الخلفية، والانجراف، وتبيض، إلخ) في برامج مثل إيماجيج16. أيضا، كما يزيد من شدة الفلورسنت مع مرور الوقت، يمكن أن إعدادات التكوين قبل تقييم تجربة رائدة للتقليل من التعرض المفرط في نهاية الوقت الفاصل بين (الخطوة 3.21). بدلاً من ذلك، يمكن استخدام دائرة لتصوير مع الخلايا تتعرض فعلا للمخدرات للفترة الزمنية المطلوبة لتهيئة الإعدادات. أخيرا، لهذا النوع من التحليل، ينبغي تجنب تركيزات المخدرات السامة (الخطوة 3.22) وأنشئت قبل استخدام الاختبارات الحيوية التقليدية.
الخلايا بشكل مستمر مثقف وصيانتها في المتوسط دون الأحمر الفينول. فلوريسسيس في الجزء الأحمر من الطيف الأحمر الفينول ويمكن ملاحظتها في العضيات الخلوية، ليسوسوميس على الأرجح، تقديم معلومات إيجابية كاذبة (الخطوة 1، 2). للسماح لرصد خلايا فردية، وينبغي أن لا تتجاوز التقاء الخلية 70% (الخطوة 3.1.). أول أكسيد الكربون2 -سرعة التدفق (الخطوة 3، 5) يحتاج إلى أن ينظم في تجربة التحقق من صحة عندما يتم شراء المعدات أو بعد الصيانة. عندما تكون السرعة عالية جداً، وسوف تتبخر المتوسطة. عند السرعة منخفضة جداً، سيتم زيادة الرقم الهيدروجيني للوسط، التي يمكن أن تؤثر على نمو الخلايا. كما المتوسط دون التغييرات مؤشر الرقم الهيدروجيني الفينول الحمراء في درجة الحموضة لا يمكن ملاحظة وذلك التغاضي عنها بسهولة. حالما يتم التحقق من تدفق2 أول أكسيد الكربون، يمكن أن يتم استخدام هذه الإعدادات في كل التجارب المستقبلية.
باستخدام الطريقة الموضحة هنا، مصير جسيمات نانوية يمكن بسهولة التحقيق باستخدام التصوير خلية يعيش والوقت الفاصل بين الفحص المجهري. في هذا الإجراء، تستخدم جسيمات نانوية المتاحة تجارياً. ولكن مصير ثيرموسينسيتيفي17،10من الدهنية الأيوني؛ الدهنية المخصب مع سلسلة قصيرة شينجوليبيدس18؛ وجسيمات نانوية تغليف المخدرات الأخرى8،19 تم أيضا التحقيق بهذه الطريقة في الورم والخلايا الطبيعية.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
مرافق الفحص المجهري المستخدمة جزء من مركز التصوير الضوئي إيراسموس، ونود أن نشكر موظفي منظمة المؤتمر الإسلامي لخدماتها.
Materials
| DMEM (no phenol-red) | Sigma | D1145 | Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS |
| Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | |
| Fetal calf serum | Sigma | F7524 | Heat inactivate for 30 min at 55 ºC |
| L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | Make a 0,1% solution in PBS, sterile |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Stericup 0,22 µm filter – 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| Trypan-blue | Sigma | T8154 | |
| Cells: Lewis lung carcimoma | ATCC | CRL-1642 | |
| Cells: B16BL6 | Dr. P. Brouckaert, Ghent University | donated | Ref.10 |
| Cells: BLM and 1F6 | Dr. van Muijen, University of Nijmegen | donated | Ref.11 |
| Petri dish | Greiner | 664160 | |
| Doxorubicin | Actavis | mentioned as dox in the manuscript | |
| Doxil/Caelyx | Janssen-Cilag | mentioned as Dox-NP in the manuscript | |
| Syringe filter 0.2 µm | VWR international | 10462200 | |
| Lysotracker-green DND-26 | Invitrogen | L7526 | mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript |
| Lysotracker-red DND-99 | Invitrogen | L7528 | mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript |
| Attofluor cell ring | Invitrogen | A7816 | |
| Cover glass 25 mm #1 | Thermo scientific | CB00250RA1 | |
| Stage holder + sealing lid | Custom made | ||
| ZEISS LSM 510 microscope | Zeiss | ||
| Software LSM 510 version 3.2 SP2 | Zeiss | ||
| Image J | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |
Referenzen
- Duggan, S. T., Keating, G. M. Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi’s sarcoma. Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).
- Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).
- Ten Hagen, T. L., et al. Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats. Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).
- Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16 (6), 667-674 (2005).
- Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies. Cancer Invest. 22 (5), 663-669 (2004).
- Muggia, F. M. Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons. Curr Oncol Rep. 3 (2), 156-162 (2001).
- Li, L., et al. Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia. J Control Release. 143 (2), 274-279 (2010).
- Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response. J Control Release. 220, 425-437 (2015).
- Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging. J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).
- Dicheva, B. M., et al. Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells. Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).
- Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma. Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).
- Van Muijen, G. N., et al. Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice. Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).
- Das, A. M., et al. Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration. Angiogenesis. 17 (1), 163-177 (2013).
- Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).
- Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance. Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
- Li, L., et al. Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy. J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids. Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells. Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).
