Summary

Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos

Published: June 26, 2017
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Summary

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Abstract

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos.

Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Introduction

In-vivo- systemische Komponentenanalyse ermöglicht es Wissenschaftlern, zelluläres Verhalten auf die zuverlässigste Weise zu untersuchen. Dies trifft besonders dann zu, wenn die zu prüfende Aktivität stark durch Zell-Zell-Wechselwirkungen (sowohl kontakt- als auch berührungsabhängig) beeinflusst wird, wie im Nervensystem, wo Membranspannungsänderungen die Kommunikation zwischen erregbaren Zellen antreiben. Das Verständnis der Informationen, die von diesen elektrischen Signalen codiert werden, ist der Schlüssel zum Verständnis der Art und Weise, wie das Nervensystem sowohl in physiologischen als auch in Krankheitszuständen arbeitet.

Um zelle elektrische Eigenschaften in den meisten nicht-invasiven physiologischen Bedingungen zu untersuchen, wurden vor kurzem mehrere genetisch codierte Spannungsindikatoren entwickelt 1 . Im Gegensatz zu den bisherigen Generationen von optischen Spannungssensoren (hauptsächlich spannungsempfindlichen Farbstoffen) 2 erlauben GEVIs in vivo Analysen des intakten neuronalen Systems undIhre Expression kann auf bestimmte Zelltypen oder Populationen beschränkt sein.

Der Zebrafisch-Embryo ist der in vivo "Substrat" ​​der Wahl, um das große Potenzial zu nutzen, das GEVIs zugeschrieben wird. Tatsächlich ermöglicht das Zebrafisch-Modell dank seiner optischen Klarheit und seines vereinfachten, aber dennoch evolutionär konservierten Nervensystems die einfache Identifikation und Manipulation jeder zellularen Komponente in einem Netzwerk. In der Tat führte die Beschäftigung der FRET-basierten GEVI Mermaid 3 zur Identifizierung von prä-symptomatischen Veränderungen im Wirbelsäulenmotor-Neuron-Verhalten in einem Zebrafisch-Modell der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) 4 .

Das folgende in vivo- Protokoll beschreibt, wie die elektrischen Eigenschaften von Wirbelsäulenmotor-Neuronen in intakten Zebrafisch-Embryonen, die Meerjungfrau in einer neuronalspezifischen Weise exprimieren, überwacht werden. Darüber hinaus zeigt es, wie pharmakologisch induzierte chanGes in solchen elektrischen Eigenschaften können mit Veränderungen in der Häufigkeit der embryonalen Spontanspulen verbunden sein, die stereotypische motorische Aktivität, die das Bewegungsverhalten des Zebrafischs in sehr frühen Entwicklungsstadien charakterisiert.

Protocol

1. pHuC_Mermaid-Plasmid-Erzeugung HINWEIS: Meerjungfrau ist ein Biosensor, der durch die Paarung der spannungsempfindlichen Domäne (VSD) der Ciona intestinalis (jetzt) ​​entwickelt wurde Ciona robusta ) 5 Spannungssensor mit Phosphatase (Ci-VSP) mit dem FRET-Partner Fluorophoren Umi-Kinoko Green (mUKG: Donor) und einer monomeren Version des orange emittierenden fluoreszierenden Proteins Kusabira Orange (mKOk: Akzeptor). Für diesen Bios…

Representative Results

Ein Expressionsvektor, der die FRET-basierte Mermaid-Biosensor-codierende Sequenz unter der Kontrolle des pHuC-pan-neuronalen Promotors trägt, der die Synthese des Proteins ausschließlich im Nervensystem antreibt, wurde mittels einer Mikroinjektion in Einzelzell-befruchtete Eier zugeführt Um transiente transgene Embryos zu erhalten ( Abbildung 1 , Linke Tafel). Nach der Beherrschung der Mikroinjektionstechnik lag der Prozentsatz der Meerjungfrau-pos…

Discussion

Das hier vorgestellte Protokoll erlaubte es uns, die Assoziation zwischen den elektrischen Eigenschaften von Zebrafisch-Embryo-Wirbelsäulenmotor-Neuronen und dem spontanen Wickelverhalten zu erforschen, die früheste stereotypische motorische Aktivität, die um 17 hpf der embryonalen Entwicklung auftritt und bis 24 hpf 10 dauert.

Unser Ansatz bietet Forschern ein Werkzeug, um das neuronale System der intakten Embryonen zu studieren, wobei die Komplexität der Wechsel…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Simona Rodighiero for her priceless support with the FRET imaging analysis.

Materials

Low Melting Point Agarose  Sigma-Aldrich A9414
DMSO  Sigma-Aldrich W387520
Riluzole Sigma-Aldrich R116
Pfu Ultra HQ DNA polymerase  Agilent Technologies – Stratagene Products Division 600389
T3 Universal primer  Sigma-Aldrich
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system Promega A9280
Universal SmaI primer  Eurofins
StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC blunt vector  Agilent Technologies – Stratagene Products Division  240228
SmaI  New England Biolabs R0141S
T4 DNA ligase Promega M1801
SalI New England Biolabs R0138S
EcoRV New England Biolabs R0195S
35 mm, glass-bottomed imaging dish  Ibidi 81151
forceps Sigma-Aldrich F6521
Stereomicroscope Leica Microsystems M10 F
Digital camera Leica Microsystems DFC 310 FX
Leica Application Suite 4.7.1 software  Leica Microsystems
QuickTime Player, v10.4 Apple
Confocal microscope (inverted) Leica Microsystems TCS SP5
Microinjector  Eppendorf  Femtojet
ImageJ macro Biosensor_FRET 
GraphPad Prism 6.0c  GraphPad Software, Inc

Referenzen

  1. Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
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Diesen Artikel zitieren
Benedetti, L., Ghilardi, A., Prosperi, L., Francolini, M., Del Giacco, L. Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (124), e55297, doi:10.3791/55297 (2017).

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