Biosensing Potentiel de membrane de neurones moteurs dans les embryons vivants de zébrés
Summary
Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.
Abstract
The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos.
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).
Introduction
L'analyse in vivo des composants systémiques permet aux scientifiques d'étudier le comportement cellulaire de la manière la plus fiable. Cela est particulièrement vrai lorsque l'activité sous contrôle est fortement influencée par les interactions cellule-cellule (dépendantes en contact et sans contact), comme dans le système nerveux, où les changements de tension membranaire entraînent la communication entre les cellules excitables. La compréhension de l'information codée par ces signaux électriques est la clé pour comprendre comment fonctionne le système nerveux dans les états physiologiques et pathologiques.
Afin d'étudier les propriétés électriques cellulaires dans les conditions physiologiques les plus non invasives, plusieurs indicateurs de tension génétiquement codés ont récemment été développés 1 . Par opposition aux générations précédentes de capteurs de tension optique (principalement des colorants sensibles à la tension) 2 , les GEVI permettent des analyses in vivo du système nerveux intact, etLeur expression peut être limitée à des types ou populations de cellules spécifiques.
L'embryon de poisson zèbre est le «substrat» in vivo de choix pour tirer parti du grand potentiel attribué aux GEVI. En fait, grâce à sa clarté optique et à son système nerveux simplifié mais progressivement conservé, le modèle du poisson zèbre permet une identification et une manipulation simples de chaque composant cellulaire dans un réseau. En effet, l'emploi du GEVI Mermaid 3 à base de FRET a permis d'identifier des altérations pré-symptomatiques du comportement des neurones moteurs de la moelle épinière dans un modèle de sclérose latérale amyotrophique (ALS) 4 .
Le protocole in vivo suivant décrit comment surveiller les propriétés électriques des neurones moteurs vertébraux dans des embryons de poissons zèbres intacts exprimant la sirène d'une manière spécifique aux neurones. En outre, il démontre comment Chan pharmacologiquement induitCes propriétés électriques peuvent être associées à des altérations de la fréquence des bobines spontanées embryonnaires, l'activité motrice stéréotypée qui caractérise le comportement de mouvement du poisson zèbre à des stades de développement très précoces.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici nous a permis d'explorer l'association entre les propriétés électriques des neurones moteurs de la colonne vertébrale du embryon de poisson zèbre et le comportement d'enroulement spontané, l'activité motrice stéréotypée la plus ancienne, qui apparaît autour de 17 hpf de développement embryonnaire et dure jusqu'à 24 hpf 10 .
Notre approche fournit aux chercheurs un outil pour étudier le système nerveux des …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Simona Rodighiero for her priceless support with the FRET imaging analysis.
Materials
| Low Melting Point Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 |
| Riluzole | Sigma-Aldrich | R116 |
| Pfu Ultra HQ DNA polymerase | Agilent Technologies – Stratagene Products Division | 600389 |
| T3 Universal primer | Sigma-Aldrich | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system | Promega | A9280 |
| Universal SmaI primer | Eurofins | |
| StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC blunt vector | Agilent Technologies – Stratagene Products Division | 240228 |
| SmaI | New England Biolabs | R0141S |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 |
| SalI | New England Biolabs | R0138S |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S |
| 35 mm, glass-bottomed imaging dish | Ibidi | 81151 |
| forceps | Sigma-Aldrich | F6521 |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | M10 F |
| Digital camera | Leica Microsystems | DFC 310 FX |
| Leica Application Suite 4.7.1 software | Leica Microsystems | |
| QuickTime Player, v10.4 | Apple | |
| Confocal microscope (inverted) | Leica Microsystems | TCS SP5 |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet |
| ImageJ macro Biosensor_FRET | ||
| GraphPad Prism 6.0c | GraphPad Software, Inc |
Referenzen
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