在子宫内电途径研究神经元亚群的兴奋性和单细胞连接

树突和轴突结构的发展是电路调节在神经系统中的一个重要方面，包括在大脑皮层。它起着多样化神经元亚群的选择性布线过程中起关键作用。若干最近的报告表明，除了连接性，神经元的分子多样性由获取烧成的高度特异性的方式体现出来。然而，机制确定发育过程中不同的神经元亚型的兴奋性和连接性，以及它们的协调程度，仍然知之甚少^1,2。

体内损失-和增益的功能分析允许对特定基因的表达水平和其在电路的发展的影响之间的关系的研究。 在子宫内电（IUE）是广泛用于研究的技术在特定神经元群体的兴趣的基因的功能，并研究它们的连接的总体图案。然而，为了确定在活的小鼠轴突和树突皮质层的形态特征，是必不可少的疏标记神经元。一个的Cre重组系统用IUE组合可用于在足够低的密度来标记的神经元的稀疏人口来解析所识别的皮质椎板的各个细胞发出的突起。此方法标记足够数目的每皮质神经元的电脑（ 图1）的合理数量的分析之后，得到定量数据。这份手稿提出了连通性等精细分析的方法。它也提供了一个类似的策略来分析，在单独的实验中，通过在绿色荧光蛋白（GFP）进行电流钳记录神经元的电性能-electroporated从急性皮层切片的细胞。这些亲母育酚是通用的，可以适用于WT和转基因动物的神经元的兴奋性和连通性的研究中，以及在其损失和功能增益由附加质粒IUE期间引入神经元。

虽然该协议描述了在胚胎天（E）15.5小鼠的电穿孔，该技术可以在任何年龄E9.5 ³和日龄（P）的2 ⁴之间执行。虽然电在早期阶段目标的神经元和丘脑的前体和皮质的深层，后期电痕更多的表层（如 E15.5 IUE目标层II-III神经元）。总之，IUE的具有单细胞形态学分析和电的组合是阐明在神经系统的基本神经元的巨大结构和功能的多样性的分子机制的有用工具。

所有动物的程序是由马德里动物护理和使用委员会，共同体符合国家和欧洲法规认可（PROEX一十四分之一百十八; PROEX15分之331）。保持在手术过程中在无菌条件。

1. 在子宫内的电

注意：此协议为Iue时从先前已公布的^5，6，7更为适合。该原稿描述了一种协议，用于E15.5的IUE的胚胎，在记者策略，其允许使用标准的GFP报告质粒单个神经元⁸和在一个单独的实验中其电生理学特性的形态的研究修改。

1. 准备DNA
   1. 准备使用不含内毒素的分离试剂盒的DNA质粒按照制造商的说明和稀他们在1×phosphate缓冲盐水（PBS）中。
      1. 对于单细胞标记，准备每个手术DNA混合液10μL使用下面的构造和最终浓度（每胎1μL）：质粒编码荧光蛋白报告（ 例如，CAG-的DsRed2 ^9），1微克/μL作为控制对于电效率;实验的质粒进行测试，通常在1微克/微升; LoxP位一站式loxP的荧光蛋白的质粒（CALNL-GFP ^10），1微克/μL;构建编码Cre重组酶^10，1 - 4纳克/μL。添加0.1％的快速绿色1μL水（重量/体积），以可视化的注射DNA。
         注：将GFP构建体的Cre重组只在少数神经元，其允许可视化和个人轴突突起（ 图1A）的重建发生。
      2. 对于标准的膜片钳研究，准备手术每DNA混合物10μL（每1 EMBRμL哟）编码荧光蛋白（如 CAG-GFP ^11），1微克/μL作为记者对照以下质粒;实验的质粒，通常为1微克/微升;和0.1％坚牢绿的1μL的水（重量/体积）。
         注意：这些是分析含有所需薄层内的大量标记的兴奋性神经元的急性切片的标准电穿孔条件。在单细胞进行膜片钳研究，如在步骤1.1.1.1中所述制备的DNA。

2.准备手术

1. 通过使用无菌程序执行的生存术。确保无菌条件下，包括面罩，手套，仪器和外科领域。消毒手术器械（手术刀，镊子斜角肌挤压，硬化精剪刀，剪子弯，杜蒙钳和持针器）。
2. 1 / 0.58毫米外/内径选择硼硅玻璃毛细管。拉帽illaries ^3。指定用于拉动后1厘米最佳尖端长度。切针尖在使用罚款钳（ 图1B）约30°角。
3. 制备500mL的无菌等渗溶液（1×PBS或Hank's平衡盐溶液（HBSS））。加青霉素 - 链霉素1：100和温热此溶液至37℃。它可以在手术后保存在4℃。
4. 皮下注入镇痛药的术前剂量（ 例如，卡洛芬，5毫克/公斤体重）。
5. 通过将它们放置在一个加热垫保持温暖手术的动物。温暖干净的笼子至37℃，术后恢复。

3.手术

1. 一个麻醉C57BL / 6 E15.5孕鼠异氟醚。首先，在0.8升/分钟氧气注入用3％异氟烷的密闭室和离开鼠标内部，直到它是睡着了。鼠标转移到一个加热垫，并放置在鼻子和嘴的掩模内用于递送异氟醚年。逐渐减小麻醉过经由掩模手术至1.5％的异氟醚的过程。通过观察踏板反射（趾捏）损失确认合适的麻醉。最佳过程需要大约20分钟，不超过45分钟。
2. 适用眼膏，以防止眼睛从过程中干燥。
3. 从腹部（使用电动剃须刀或脱毛霜）的〜3厘米的区域除去毛。洗用70％的乙醇注入棉签，后跟一个碘注入棉签手术区。重复三次。
4. 覆盖消毒纱布，防止感染手术区。
5. 使用手术刀，使透过皮肤长2cm至中线垂直开口和平行。分开使用钝剪子弯腹部的皮肤和肌肉。保持与镊子肌肉和削减它通过白线，以暴露腹腔。
6. 找到的帮助澳胚胎F中的镊子。滋润2湿棉签与在步骤2.3中制备的无菌生理盐水溶液，并用它们来操作可访问的胚胎出开口。周围放置胚胎的棉签轻轻提取从腹腔两个子宫角。保持用温生理盐水溶液水合的胚胎和打开腹腔整个过程中，以防止它们干燥。

4.注射DNA和电的

1. 用手指来定位端脑轻轻操纵胚胎（可以由眼睛作为脑的两个前囊泡被清晰显示）。发生在口腔吸管准备硼硅毛细管。通过针尖通过子宫，避免血管，直到它到达一个横向心室。直到大蓝点观察缓缓注入大约1快速绿色的DNA溶液微升。
2. 放置7毫米铂电极横向地在th胚胎（ 图1C）电子负责人。
   注：DNA被带负电荷;因此，当铂电极之间施加电压移向正极。通过改变电极的位置，大脑的不同区域可以有针对性。
3. （：这些条件取决于发育阶段5个脉冲，38伏，50毫秒时间间隔周期的长度，950毫秒的时间间隔的暂停为E15.5胚胎^。）12经由铂电极施加电压。
   注：请参阅表1的电压条件和电极，用于不同的胚胎阶段。
4. 每个胚胎4.3 - 重复步骤4.1。

5.结束了手术，术后

1. 用棉签操纵子宫回母亲。填用温热生理盐水溶液腹腔（加入约2毫升）中。
2. 缝合单纯间断缝合或连续缝合肌肉。使用＃6-0缝线秒。
3. 使用订书钉关闭外部伤口。小心装订之前从肌皮分离。取下鼻罩。
4. 让鼠标放置在动物设施室之前在加热的，洁净笼30分钟恢复。无人看管，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧不要让动物。不要将已动过手术公司中的其他动物，直到完全康复的动物。
5. 监督在手术后的几天动物。皮下应用镇痛药（卡洛芬，5毫克/千克体重）为2天或根据动物立法每12小时。没有额外的术后护理是必需的幼崽。

6.样品的制备和分析

1. 可选：在P2，检查荧光用荧光显微镜电穿孔幼崽的表达;当IUE是成功的，荧光可以清楚地看出我n中的头^13。标记或分开正在积极对在下面的步骤利用电穿孔的小鼠。请标准动物设施条件水坝和幼仔。
2. 在研究的期望阶段，灌注小鼠transcardially。通常情况下，树突和轴突生长的最活跃的相位对应于前三产后周^{2，14，15。}
   1. 在1X PBS准备30毫升4％多聚甲醛（PFA）的每鼠标和寒意在冰上。
      注意：PFA是一种已知的过敏原和致癌物质。它是有毒的。穿戴合适的个人防护装备。
      注意：需要的PFA的量取决于鼠标（ 例如 ，P16，20毫升用于灌注和10ml的postfixation需要）的年龄。
   2. 制备氯胺酮 - 赛拉嗪混合物用1至麻醉的动物：1：100微克/毫升氯胺酮8体积比：100微克/毫升×ylazine：PBS（准备每只小鼠约0.2毫升）。
   3. 腹腔注射0.2毫升步骤6.2.2准备的混合麻醉鼠标。
   4. 将在它的后面麻醉鼠标。使用手术刀胸部之上的水平切口。切开肌肉和隔膜用细剪刀直到心脏可以观察到。
      1. 制作与精细剪刀右心房切口。缓缓注入20毫升的PBS在用25号针头在左心室以除去血液。注射20毫升PFA（步骤6.2.1），直到鼠标是刚性的器官变成白色。
      2. 立刻移开磁头，使正中切口，从颈部到颅骨皮肤。用弯钳轻轻剥离颅骨，并提取大脑。请特别小心不要刺破或切除颅骨时损坏大脑。把脑在10mL的4％的PFA的在4℃下过夜与postfix它。
3. Cryoprotec吨于4℃固定脑在10毫升PBS中30％蔗糖的1 - 2天，直到它们下沉。制备1厘米³铝箔立方体。填充立方体与华侨城的方式2/3。把大脑内，通过将立方体上的干冰冷冻。储存在-80℃的冷冻大脑。
4. 样品盘的表面上的OCT的地方下降，剥离从组织学立方体的铝箔，并在所需方向上的液体OCT的顶部试样磁盘立方体定位。直到它被固定应用公司的压力。将样品光盘放入低温恒温器的样品头。定向标本（它移动到相对刀/刀片有利的位置）。
   1. 部分在低温恒温器的大脑。选择50 - 100微米厚的冰冻切片上浮¹⁶用细刷，并放置在PBS。
5. 如果需要的污点。
   注：对于轴突形态的研究，染色用绿色荧光蛋白抗体强烈推荐
6. 方框1小时在室温下用5％胎牛血清的PBS中含有0.5％的Triton-X 100（封闭溶液）的部分。在4℃下用1孵育过夜：500的第一抗体（ 例如，兔抗GFP）的封闭溶液稀释。
7. 洗部分三次于PBS中。添加1：500的二级抗体（ 例如，山羊抗兔的Alexa Fluor 488）在阻断溶液并孵育在室温下1小时稀释。洗部分三次于PBS中。
8. 在含有0.5％的Triton-X 100 10分钟的PBS：用DAPI（10,000 1）染剂。用PBS冲洗切片。安装在水性安装介质¹⁶的部分。

7.成像和分析

1. 荧光或共聚焦显微镜
   1. 为了重建完整的神经元，以高倍率（至少40X）和高分辨率（最小1024x1024个）获取图像。选择“瓷砖扫描“，或在采集软件等效选项以覆盖感兴趣的区域，跨越所有树突和轴突的过程。获取足够数量的Z轴堆叠的，以避免信息丢失。
      注意：通常情况下，在显微镜的软件有一个“优化栈”选项，但如果不是这种情况下，测试手动确定多少步骤是必要的图像，以便正确地确定各个凸起重叠。两个重要参数是针孔和物镜;考虑到“更高的放大倍率，更高的分辨率，更需要的z的步骤。”
2. 分析
   注意：尽管几个参数可以被分析，步骤7.2.1集中于两个：树突形态和轴突分枝。下载斐济（ http://fiji.sc/ ）。
   1. 打开图像，从菜单中选择了“分段线”选项。画一条线（沿次上下移动Ëz轴通过滚动鼠标）的神经元的结构如下。进入“分析，工具，投资回报率经理，添加”（或者按“T”）来保存就行了。重复这个过程中所分析的神经元²的轴突每树突或。
   2. 在ROI管理器菜单按“办法”按钮，得到的长度（或其他参数）。导出测量到一个文本文件或电子表格来分析它们。

8.电

注：此协议的目标是从层获得全细胞电流钳记录中的GFP电穿孔小鼠大脑（或先前电穿孔的任何其它荧光蛋白）通过GFP表达视觉上识别的II / III锥体细胞的神经元。这是先前公布的方法^17，18改编。使用此协议是可能的研究遗传改性的效果ication由IUE对神经元的电特性引入的。具体的发射模式的收购是分化的一个渐进的过程，涉及的离子通道的广泛的曲目的动态表达，导致瞬态射击模式的表达已故前产后阶段。例如，成熟的电反应不是在层的躯体感觉皮质鼠标的II / III P16 ^2，19之前观察到的。

1. 先决条件急性片
   1. 准备无菌手术工具从小鼠取出大脑：断头台，去除头部;小剪刀，通过头骨削减;镊子，分离从组织头骨;锅铲，以微妙从包装中取出脑组织;金属切片机，解剖皮质成相等的两半;和巴斯德吸管，从vibratome（将它们放置到含有人工脑脊液中的溶液移至片（交流SF）进行检查，然后从ACSF转移切片孵育保持区域）。
   2. 制备1升使用含有119 mM氯化钠，26毫的NaHCO ₃的高纯度的（双蒸水）水ACSF的，11毫米的葡萄糖，2.5mM的氯化钾，1.2mM的MgCl ₂的，2.5mM的_氯化钙和1mM的NaH ₂ PO _4。滴定pH值至7.3 - 7.4用HCl或NaOH。调节渗透压至290毫渗量。
   3. 气泡ACSF与卡波金（95％O _{2/5％CO 2）15} - 7.4 -用特氟隆管（〜1毫米），以稳定pH至7.3 20分钟。
   4. 冻结在-80℃，10与卡波金饱和ACSF溶液200毫升 - 15分钟，以产生泥泞解剖溶液。广场上冰100-×20毫米组织培养皿切断用大脑。
   5. 只是在实验开始前制备100毫升的1％的低熔点琼脂糖溶液。冷却该溶液，切出一块方形琼脂糖（尺寸：1×1×0.5mm）的，并且它强力胶的回来的平台，后面那里的大脑切片（琼脂糖凝胶切片过程中提供支持，为大脑）。使前尽可能平坦。
2. 获取急性片
   1. 固定鼠标和用异氟烷2％麻醉它。将头部到断头台开放，迅速杀头的。与使用骨护林员或细镊子的尽可能快地取出它的头骨。把大脑进入冷冻学联。
      注意：要快速执行此步骤是非常重要的。
   2. 放置在大脑冷冻培养皿。切断与小剪刀小脑。
   3. 拿起大脑用抹刀和吸干水分在纸巾上。
   4. 胶上的vibratome支架大脑的ventrocaudal平面。放置保持器上装有冰冷ACSF一个vibratome。
   5. 通过削减300微米冠状切片（确保持续carbogenation整个过程中， 例如，将一个起泡器（1毫米获取急性片使用以下vibratome设置聚四氟乙烯管）在vibratome室）：0.06毫米的振幅和0.08 - 0.10毫米/秒的速度。将推进到最慢的速度（每个通第22号）。修改这些最佳设置，并获得对每一台机器经验，如果有必要的最佳条件。
   6. 孵育急性切片ACSF中至少60分钟补充有3毫肌醇 ，0.4毫抗坏血酸，和2mM丙酮酸钠，同时用95％ _的 O _{2/5％CO 2}的气体鼓泡。保持在25℃的温度。
   7. 在不到15分钟进行切片过程。被转移到记录室，用于在使用前7小时 - 如果需要，该切片可被存储为1。
3. 先决条件全细胞记录
   1. 确保该电站配备的记录室中，灌注系统，显微镜，电极（记录，刺激，和地面），宏观和MICRomanipulators，刚性抗振台式和法拉第笼，刺激器，放大器和模拟 - 数字（A / D）转换器，以采集软件的计算机，以及一GFP（或任何其他荧光染料）过滤器，用于分析遗传修饰的神经元^18（ 图2A）。
   2. 制备细胞内溶液，含有115毫葡糖酸钾，2mM的MgCl ₂的，10毫米的HEPES，20mM的氯化钾，4毫_的 Na ₂ ATP和0.3mM的钠₃ GTP，由KOH和至290毫渗透摩尔浓度氯化钾调节至pH 7.2。
   3. 通过拉硼硅玻璃毛细管使补丁吸管。准备使用微量拉马块电极。使用硼硅酸盐毛细管（1.5毫米外径，0.86毫米内径，10厘米长）。使电极贴片显示在充满细胞内液3-10MΩ的电阻。
   4. 以2毫升/分钟的速率灌注与ACSF记录室中。保持腔室的温度保持在approximately 33℃。
4. 全细胞记录
   1. 转移片放入使用巴氏吸管（切断长尖）或小刷子录音室。按住与竖琴的切片。灌注不断地与ACSF切片以2毫升/分钟的速率。
   2. 修补GFP阳性神经元。
      1. 把片到记录室，并通过在低放大倍数（10×）的显微镜找到感兴趣的区域。然后，找到一个GFP阳性细胞使用60倍的目标修补。
      2. 填与细胞内溶液的记录电极。使用链接到所述过滤器（4毫米过滤器）的注射器和微装载机尖填补与细胞内溶液的记录电极。
      3. 放置在移液管固定器的玻璃吸管。将枪头在洗澡和重点提示。一旦吸管是在浴，通过回压控制系统施加正压。
      4. 修补神经元是荧光（ 图URE 2B）。
         1. 接近所关注的细胞的视觉指导下，同时保持背在吸管压力。在细胞表面上的小凹坑的外观，释放压力。在这一点上，可以形成一个紧密的密封（电阻大于1GΩ大）。否则，应用光负压（吸气），以促进它。
         2. 而正在形成的密封，使保持电压钳位至-60 mV的。一旦GΩ密封形成，施加吸力的脉冲破裂细胞膜吸管下方并进入全细胞模式。见参考文献²⁰的更多细节。
      5. 记录使用电流钳的条件²¹的活性。一旦在全细胞模式，从电压钳切换到电流钳模式，并开始记录。例如，为了记录细胞的兴奋性，适用于500毫秒之久的去极化电流注入（100 - 400帕）。
         1. 计算燃烧率bŸ绘制动作电位数一起列车增加输入电流。
            注：静息膜电位，输入电阻和膜电容，也可以从记录²¹计算。

为了表征在细节和整个开发神经元的形态变化，有必要稀疏标记神经元。一个Cre重组稀释系统允许感兴趣的基因在神经元的人口稀少的表达，因此，只有那些掺入这种酶的神经元表达GFP（ 图1A）。使用这种策略，层II-III是针对在E15.5通过IUE标记。 CAG-的DsRed2在1微克/μL，是共电为控制和动物活体识别正面电大脑。重要的是，抗GFP抗体染色后，信号足够强，让他们的树突形态和轴突（ 图1D和E）的清晰的可视化。

IUE和电后，从全细胞记录获得的参数的分析被用于共mpare不同条件下烧成反应和电穿孔的细胞的兴奋性。几个参数可以得到。参数应适应使用特定的膜片钳分析软件的特定的研究。 图2C提供了防止输入电流的动作电位从在E15.5电一个WT层Ⅱ-Ⅲ神经元的记录得到的曲线的一个例子。

摊薄战略图1. Cre重组使皮层神经元稀疏标签。该战略的A原理图汇总。在同时携带CALNL-GFP和CRE的神经元，在loxP的STOP-LoxP位卡带被切除了CALNL-GFP，而GFP是由强大的CAG启动子表达。硼硅酸盐毛细管B.示意图使用微量拉马拉。尖端通过FO切rceps，创造了30°角。测量从尖端1cm至毛细管的较窄部分的开头。 C.电极的位置为目标的躯体感觉皮层。铂电极置于大约在胚胎的耳朵。由于其负电荷，DNA被施加电压时变为朝向正极。变异电极的位置允许针对不同的大脑区域。载体后获得的图像D.通过在 15.5天的胚胎子宫穿孔传递到层II-III的神经元;冠状切片在16日龄的CAG-的DsRed2载体共转染作为对照（左）制成。 GFP（中）表示仅在于还掺入酶Cre这些神经元，允许在CALNL-GFP载体的LoxP位点的重组。稀疏标签允许单个神经元来加以区分（箭头）。 E.高倍率的T共聚焦图像他树突另一个人口稀少GFP标记神经元乔木。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2.电设置，例如一个射击响应。 A.图为用于急性片膜片钳实验电设置。设置包括在一个法拉第笼，以消除噪声，和设备上的防振台的顶部。用于电极的机动显微的控制器在左侧观察。与GFP电鼠标B.锥体神经元，在明亮的领域和绿色荧光观察条件。附着到的GFP +细胞记录吸管是引人注目。比例尺= 10＆＃181，M。一个CAG-GFP的C.射击模式电控层II-III神经元呈现典型的常规扣球响应。动作电位的分布近似于沿着输入电流（X轴）的持续时间的规则分布。 请点击此处查看该图的放大版本。

表1：电压条件和电极，用于胚胎的电穿孔。

这个协议在详细描述了如何标记C75BL / 6小鼠的躯体感觉皮层的神经元，以分析它们的连接和它们的兴奋性。相对于现有的方法，它可视连通的识别方面，如每神经元轴突的分支数，它们的精确地形，和它们的解剖位置。通过改变电极的位置，有可能指定其他神经元群体，如扣带皮层（保持电极和大脑之间的角度相同，但改变磁极的取向）或海马^5，并且执行类似实验标记单个神经元或更广泛的人群中，取决于期望的策略。不过，也有这种限制，因为不是所有的人口都同样可访问的或同等选择性标记。例如，在海马，能够选择性地靶向CA1区的晚出生的神经元，但EARLY电痕内和外锥体细胞的异质群体。在大脑皮质神经元出生以顺序的方式，所以IUE在妊娠天确定哪个皮质层受到影响。早先执行的目标IUE更深的神经元（ 如，在IUE标签E14 IV层神经元^）22。

对于一个成功的IUE，建议考虑某些因素。首先，做了手术，在不到30分钟，以减少对母亲的应力和增加的幼仔的生存机会是很重要的。第二，该过程中最困难的部分是在注射通过硼硅酸盐毛细管尽量轻柔的DNA进行注射。如果胚胎被压太硬，它们可以受到伤害。在故障排除过程中DNA注射胚胎的死亡，坡口以30°角尖可以增加这个职业的疗效方面塞斯。如果一个倒角机不可用并且毛细管用镊子单独切割，正确的角度可以在解剖显微镜来确认。丢弃毛细血管不足。最后，适应电穿孔条件对胚胎的阶段是为了提高生存率重要（ 见表1）。

一些考虑是必要而与轴突和树突的重建。为了标记单个神经元，所述酶Cre的质粒的适当浓度是必不可少的，以获得一个良好的，稀疏表达并避免属于不同的神经元的神经元突起的混杂重叠。虽然该协议提出使用4纳克/微升，可能有必要调整质粒浓度为每个实验中，根据所用的启动子，所述DNA制剂的质量，和DNA定量的方法（ 例如，将其降低到2纳克/μL，如果标签太多的神经元）。在additi上，对于轴突跟踪，将其在适当的角度，以在同一平面上的整个神经元削减是重要的。

对于成功的膜片钳记录的关键步骤是急性切片的组织的健康和位置，并电GFP阳性神经元的丰度。如果修补步骤失败或异常响应录音过程中发现，减少时间来处理急性切片。如果GFP神经元由于在急性切片其减少数字很难识别和定位，确保有足够的CAG-GFP质粒是包含在电组合。关于本文所描述的方法的主要限制，膜片钳技术允许的描述神经元的兴奋性的许多不同的参数记录，但它不评估依赖整个电路上的方面。另外，和上面提到，并不是所有的神经元亚群是通过IUE访问。综上所述，在第ê将来，这些技术可以向在脑中不同的神经元亚群的结构和功能连接的进一步的分析。