في الرحم النهج Electroporation لللدراسة استثارة الخلايا العصبية القطعان والربط وحيدة الخلية

تطوير الهياكل الشجرية ومحور عصبي هو أحد الجوانب الهامة من تنظيم الدائرة في الجهاز العصبي، بما في ذلك في القشرة الدماغية. انها تلعب دورا حاسما خلال الأسلاك انتقائيا من القطعان العصبية المختلفة. وأظهر عدد من التقارير الأخيرة أنه، بالإضافة إلى الاتصال، وينعكس التنوع الجزيئي للخلايا العصبية التي كتبها اقتناء وسائل محددة للغاية لإطلاق النار. ومع ذلك، فإن آليات تحديد استثارة والتواصل بين الأنواع الفرعية العصبية متميزة خلال التنمية، وكذلك درجة من التنسيق، لا تزال غير مفهومة ^{1 و 2.}

في الجسم الحي loss- وكسب من وظيفة يحلل تسمح لدراسة العلاقة بين مستوى التعبير عن جينات محددة وتأثيرها في تطوير الدائرة. electroporation في الرحم (IUE) هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع لدراسةوظيفة الجين من الفائدة في السكان العصبية محددة ودراسة الأنماط العامة للاتصال بهم. ومع ذلك، لتحديد الخصائص المورفولوجية من المحاور والتشعبات في الطبقات القشرية في الفئران الحية، فمن الضروري لتسمية الخلايا العصبية قليلة. نظام إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية جنبا إلى جنب مع IUE يمكن استخدامها لوضع علامة على عدد قليل من السكان من الخلايا العصبية في مناطق ذات كثافة منخفضة بما فيه الكفاية لحل توقعات المنبعثة من الخلايا الفردية من laminas القشرية التي تم تحديدها. هذه الطريقة التسميات وجود عدد كاف من الخلايا العصبية في القشرة للحصول على البيانات الكمية بعد تحليل أرقام معقولة من العقول electroporated (الشكل 1). تقدم هذه المخطوطة طريقة لمثل هذا التحليل الدقيق للاتصال. كما يعرض استراتيجية مماثلة لتحليل، في تجارب منفصلة، ​​والخصائص الكهربائية للخلايا العصبية عن طريق أداء التسجيلات المشبك الحالي على البروتين مضان أخضر (GFP) -electroporated الخلايا من شرائح القشرية الحادة. هذه المواليةtocols متعددة الاستعمالات ويمكن تطبيقها على دراسة استثارة والتواصل بين الخلايا العصبية من الحيوانات WT والمعدلة وراثيا، وأيضا من الخلايا العصبية التي يتم تقديمها الخسائر والمكاسب من وظيفة من البلازميدات إضافية خلال IUE.

على الرغم من أن هذا البروتوكول يصف Electroporation للمن الفئران في يوم الجنينية (E) 15.5، هذا الأسلوب لا يمكن أن يؤديها في أي سن بين E9.5 ³ ويوم ما بعد الولادة (P) 2 ^4. في حين Electroporation للفي المراحل المبكرة يستهدف الخلايا العصبية والسلائف من المهاد والطبقات العميقة من القشرة، علامات Electroporation للفي وقت لاحق في مرحلة طبقات أكثر سطحية (على سبيل المثال، الخلايا العصبية E15.5 IUE أهداف طبقة II-III). وباختصار، فإن الجمع بين IUE مع التحليل الصرفي وحيدة الخلية والكهربية هو أداة مفيدة لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء التنوع الهيكلي والوظيفي الهائل من الخلايا العصبية في الجهاز العصبي.

وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية في مجتمع مدريد رعاية الحيوان واستخدام اللجنة، وفقا للتشريعات الوطنية والأوروبية (PROEX 118/14، 331/15 PROEX). الحفاظ على ظروف معقمة أثناء العملية.

1. في الرحم Electroporation لل

ملاحظة: تعديل هذا البروتوكول لIUE من الآخرين التي تم نشرها سابقا ^{5، 6، 7.} توضح هذه المخطوطة بروتوكول لIUE من E15.5 الأجنة، مع تعديلات في الاستراتيجية المراسل أن تسمح لدراسة مورفولوجية الخلايا العصبية واحدة ⁸ و الخصائص الكهربية في تجربة منفصلة باستخدام معيار البلازميدات مراسل GFP.

1. إعداد الحمض النووي
   1. إعداد البلازميدات الحمض النووي باستخدام عدة العزلة خالية من الذيفان الداخلي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وتمييع لهم في 1X صمخزنة المالحة hosphate (PBS).
      1. لوضع العلامات وحيدة الخلية، وإعداد 10 ميكرولتر من خليط الحمض النووي في الجراحة (1 ميكرولتر في الجنين) باستخدام بنيات التالية وتركيزات النهائي: ترميز البلازميد مراسل بروتين فلوري (على سبيل المثال، CAG-DsRed2 ^9)، 1 ميكروغرام / ميكرولتر كعنصر تحكم لكفاءة Electroporation لل. البلازميد التجريبي لفحصها، وعادة في 1 ميكروغرام / ميكرولتر. LoxP وقفة وLoxP الفلورسنت البروتين البلازميد (CALNL-GFP ^10)، 1 ميكروغرام / ميكرولتر. وبناء ترميز لجنة المساواة العرقية ^10، 1-4 نانوغرام / ميكرولتر. إضافة 1 ميكرولتر من 0.1٪ سريع الخضراء في الماء (الوزن / الحجم) لتصور الحمض النووي حقن.
         ملاحظة: لجنة المساواة العرقية إعادة التركيب للبناء GFP يحدث فقط في عدد قليل من الخلايا العصبية، والذي يسمح التصور وإعادة بناء التوقعات محور عصبي الفردية (الشكل 1A).
      2. للدراسات التصحيح، المشبك القياسية، وإعداد 10 ميكرولتر من خليط الحمض النووي في الجراحة (1 ميكرولتر في EMBRيو) من البلازميد التالية ترميز البروتين الفلوري (على سبيل المثال، CAG-GFP ^11)، 1 ميكروغرام / ميكرولتر كعنصر تحكم مراسل. البلازميد التجريبية، عموما 1 ميكروغرام / ميكرولتر. و1 ميكرولتر من 0.1٪ سريع الخضراء في الماء (الوزن / الحجم).
         ملاحظة: هذه هي شروط Electroporation للالقياسية التي تحلل شرائح الحادة التي تحتوي على عدد كبير من الخلايا العصبية مثير المسمى داخل الصفيحة المطلوب. إجراء دراسات التصحيح، المشبك في زنازين انفرادية، وإعداد الحمض النووي كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.1.

2. إعداد لجراحة

1. إجراء عملية جراحية البقاء على قيد الحياة عن طريق استخدام إجراءات العقيم. ضمان ظروف معقمة، بما في ذلك الأقنعة والقفازات، والصكوك، والجراحي الميداني. تعقيم الأدوات الجراحية (مشرط، ملقط أدسون، وحصنت مقص غرامة، مقص منحني، ملقط دومون، وحامل إبرة).
2. الشعيرات الدموية حدد الزجاج البورسليكات من 1 / 0.58 ملم القطر الخارجي / الداخلي. غطاء السحبillaries ^3. استهداف لطول الحافة الأمثل من 1 سم بعد سحب. قطع رأس إبرة في حوالي بزاوية 30 درجة باستخدام ملقط غرامة (الشكل 1B).
3. إعداد 500 مل من محلول متساوي التوتر معقم (برنامج تلفزيوني 1X أو Hank's المتوازن محلول الملح (HBSS)). إضافة البنسلين ستربتومايسين 1: 100 ودافئة هذا الحل إلى 37 درجة مئوية. ويمكن تخزينها في 4 درجة مئوية بعد الجراحة.
4. تحت الجلد حقن جرعة ما قبل التنفيذ من المسكنات (على سبيل المثال، كاربروفين، 5 ملغم / كغم من وزن الجسم).
5. الحفاظ على الحيوانات الدافئة لعملية جراحية عن طريق وضعها على وسادة التدفئة. تدفئة قفص نظيف إلى 37 درجة مئوية لمدة التعافي بعد العملية الجراحية.

3. جراحة

1. تخدير C57BL / 6 E15.5 ماوس حاملا مع isoflurane. أولا، ولبث في غرفة مغلقة مع 3٪ الأيزوفلورين في 0.8 لتر / دقيقة الأكسجين وترك الماوس داخل حتى أنه نائم. نقل الماوس إلى وسادة التدفئة ووضع الأنف والفم داخل قناع لتقديمذ الأيزوفلورين. تدريجيا يقلل من التخدير على مدار الجراحة إلى 1.5٪ الأيزوفلورين عبر قناع. تأكيد التخدير المناسبة من خلال مراقبة فقدان المنعكس دواسة (قرصة أخمص قدميه). الإجراء الأمثل يستغرق حوالي 20 دقيقة وليس أكثر من 45 دقيقة.
2. تطبيق مرهم العين لمنع العينين من الجفاف أثناء العملية.
3. إزالة الشعر من منطقة ~ 3 سم من البطن (باستخدام الحلاقة الكهربائية أو كريم مزيل الشعر). غسل المنطقة الجراحية مع مسحات القطن التي غرست مع الايثانول 70٪، تليها مسحة القطن التي غرست اليود. كرر ثلاث مرات.
4. تغطية المنطقة الجراحية مع شاش معقم لمنع العدوى.
5. استخدام مشرط لجعل فتحة عمودية من خلال الجلد 2 سم وبالتوازي مع خط الوسط. فصل الجلد والعضلات من البطن باستخدام مقص منحني حادة. عقد العضلات مع ملقط وقطع عليه من خلال الخط ألبا لفضح تجويف البطن.
6. تحديد الأجنة بمساعدة سو ملقط. بلل اثنين من قطعة قطن مبللة بمحلول ملحي معقم أعدت في الخطوة 2.3 واستخدامها للتلاعب الجنين يمكن الوصول إليها من الافتتاح. ضع قطعة قطن حول الجنين واستخراج بلطف على حد سواء قرون الرحم من تجويف البطن. الحفاظ على الأجنة وتجويف البطن فتح رطب مع محلول ملحي دافئ في جميع أنحاء الداخلي لمنعهم من الجفاف.

4. حقن الحمض النووي و Electroporation

1. معالجة الأجنة بلطف مع الأصابع لتحديد الدماغ الانتهائي (يمكن تصور بوضوح بالعين عن اثنين من أكثر الحويصلات الأمامي من الدماغ). ضع الشعرية البورسليكات مستعد في ماصة الفم. تمرير غيض من الإبرة من خلال الرحم، وتجنب الأوعية الدموية، حتى يصل إلى البطين الجانبي واحد. ببطء ضخ ما يقرب من 1 ميكرولتر من محلول الحمض النووي سريع الأخضر اللون حتى لوحظ بقعة زرقاء كبيرة.
2. وضع أقطاب البلاتين 7 ملم أفقيا على الرئيس (ه) من جنين (الشكل 1C).
   ملاحظة: يتم احتساب الحمض النووي سلبا. وبالتالي، فإنه يتحرك باتجاه القطب الموجب عند تطبيق الجهد بين الأقطاب البلاتين. من خلال تغيير موقع الأقطاب، ومناطق مختلفة من الدماغ يمكن أن تكون مستهدفة.
3. تطبيق الجهد عبر الأقطاب البلاتين (لE15.5 الأجنة: 5 البقول، 38 V، 50 مللي الفاصل طول دورة، وقفة 950 مللي الفاصل تختلف هذه الظروف باختلاف مرحلة النمو) ^12.
   ملاحظة: انظر الجدول رقم 1 لظروف الضغط والأقطاب لمراحل الجنين المختلفة.
4. كرر الخطوات من 4،1-4،3 لكل جنين.

5. نهاية الجراحة وPostoperation

1. استخدام قطعة قطن لمعالجة الرحم مرة أخرى إلى الأم. ملء تجويف البطن بمحلول ملحي حرارة (إضافة حوالي 2 مل).
2. خياطة العضلات مع غرز انقطاع بسيطة أو غرزة المستمر. استخدام # 6-0 خياطةالصورة.
3. استخدام الدبابيس لإغلاق الجرح الخارجي. كن حذرا لفصل الجلد من العضلات قبل تدبيس. إزالة قناع الأنف.
4. السماح الماوس لاستعادة لمدة 30 دقيقة في ساخنة، قفص نظيف قبل وضعه في غرفة منشأة الحيوان. لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. لا تضع الحيوان الذي خضع لعملية جراحية في الشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما.
5. الإشراف على الحيوان خلال أيام بعد الجراحة. تطبيق المسكنات تحت الجلد (كاربروفين، 5 ملغ / كغ من وزن الجسم) كل 12 ساعة لمدة 2 أيام أو وفقا للتشريعات الحيوان. لا يلزم رعاية ما بعد الجراحة إضافية لالجراء.

6. إعداد وتحليل عينات

1. اختياري: في P2، تحقق للتعبير عن مضان في الجراء electroporated باستخدام المجهر الفلورسنت. عندما IUE ناجحا، مضان يمكن بوضوح أن ينظر طن رئيس ^13. علامة أو فصل الفئران التي يتم electroporated إيجابيا للاستخدام في الخطوات التالية. الحفاظ على السدود والجراء في ظروف منشأة الحيوان القياسية.
2. في المرحلة المطلوبة للدراسة، يروي الفئران transcardially. عادة، المرحلة الأكثر نشاطا من نمو شجيري والمحاور يتوافق مع أول ثلاثة أسابيع بعد الولادة ^{2 و 14 و 15.}
   1. إعداد 30 مل من 4٪ لامتصاص العرق (PFA) في برنامج تلفزيوني 1X في الماوس والبرد على الجليد.
      تنبيه: PFA هو حساسية المعروفة ومسرطنة. انها سامة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
      ملاحظة: مقدار PFA حاجة تعتمد على عمر الماوس (على سبيل المثال، لP16، هناك حاجة إلى 20 مل لنضح و 10 مل لpostfixation).
   2. إعداد مزيج الكيتامين زيلازين لتخدير الحيوان مع نسبة 1: الحجمي 8 من 100 ميكروغرام / مل الكيتامين: 1 100 ميكروغرام / مل سylazine: برنامج تلفزيوني (إعداد حوالي 0.2 مل في الماوس).
   3. تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق 0.2 مل من مزيج أعدت في الخطوة 6.2.2.
   4. ضع الماوس تخدير على ظهرها. جعل شق أفقي فوق القفص الصدري باستخدام مشرط. قطع العضلات والحجاب الحاجز مع مقص غرامة حتى يمكن ملاحظة القلب.
      1. إجراء شق في الأذين الأيمن مع مقص غرامة. ببطء ضخ 20 مل من برنامج تلفزيوني في البطين الأيسر مع إبرة عيار 25 من أجل إزالة الدم. ضخ 20 مل PFA (الخطوة 6.2.1) حتى الماوس هو جامد والأجهزة تصبح بيضاء.
      2. على الفور إزالة الرأس وجعل شق خط الوسط في الجلد من الرقبة إلى الجمجمة. قشر بلطف بعيدا الجمجمة باستخدام ملقط المنحنية واستخراج الدماغ. عناية خاصة على عدم ثقب أو تلف في الدماغ أثناء إزالة الجمجمة. وضع الدماغ في 10 مل من 4٪ PFA في 4 درجات مئوية خلال الليل لبوستفيكس ذلك.
3. Cryoprotecر الثابتة العقول في 10 مل من السكروز 30٪ في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أيام، حتى أنها تغرق. إعداد 1 سم ³ الألومنيوم مكعبات احباط. ملء مكعبات 2/3 من الطريق مع أكتوبر وضع العقول في الداخل وتجميدها عن طريق وضع مكعبات الثلج الجاف. تخزين العقول المجمدة في -80 درجة مئوية.
4. انخفاض مكان أكتوبر على سطح القرص العينة، قشر رقائق الألومنيوم من المكعب الأنسجة، وموقف مكعب في الاتجاه المطلوب إلى القرص عينة على رأس أكتوبر السائل. تطبيق الضغط على الشركة حتى يتم إصلاحه. أدخل القرص العينة في الرأس عينة من ناظم البرد. توجيه العينة (تحريكه في موقف مواتية بالنسبة للسكين / شفرة).
   1. قسم العقول على ناظم البرد. اختر 50-100 cryosections العائمة ميكرون سميكة ¹⁶ باستخدام فرشاة دقيقة ووضعها في برنامج تلفزيوني.
5. وصمة عار إذا رغبت في ذلك.
   ملاحظة: للحصول على دراسة مورفولوجية محور عصبي، وتلطيخ مع الأجسام المضادة GFP ينصح بشدة
6. منع المقاطع لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع 5٪ مصل بقري جنيني في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5٪ تريتون X-100 (عرقلة الحل). احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع 1: 500 الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال، أرنب مكافحة GFP) المخفف في عرقلة الحل.
7. غسل أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني. إضافة 1: 500 الضد الثانوية (على سبيل المثال، الماعز المضادة للأرنب اليكسا فلور 488) المخفف في عرقلة الحل واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني.
8. مباين مع دابي (1: 10000) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة. شطف المقاطع مع برنامج تلفزيوني. تركيب المقاطع في وسط مائي ¹⁶ المتصاعدة.

7. التصوير والتحليل

1. مضان أو المجهري متحد البؤر
   1. لإعادة بناء الخلايا العصبية كاملة، والحصول على الصور مع التكبير عالية (40X على الأقل) وعالية الدقة (الحد الأدنى 1024 س 1024). حدد "مسح البلاط "أو خيار مماثل في البرنامج الحصول على لتغطية مساحة من الاهتمام، والتي تمتد كل التشعبات وعمليات محور عصبي. الحصول على عدد كاف من مداخن على المحور Z لتجنب فقدان المعلومات.
      ملاحظة: عموما، والبرمجيات المجهر لديه خيار "كومة محسن"، ولكن إذا كان هذا هو الحال لا، اختبار يدويا لتحديد عدد الخطوات اللازمة لصور لتداخل من أجل تحديد التوقعات الفردية بشكل صحيح. معلمتين الحاسمة هي ذات الثقب والهدف؛ تأخذ في الاعتبار "أعلى التكبير، والمزيد من القرار، وأكثر اللازمة ض الخطوات."
2. تحليل
   ملاحظة: على الرغم من أن العديد من المعلمات ويمكن تحليلها، وتركز خطوة 7.2.1 على اثنين: مورفولوجيا التغصنات ومحور عصبي المتفرعة. تحميل فيجي ( http://fiji.sc/ ).
   1. فتح الصورة، حدد الخيار "خط مجزأة" من القائمة. رسم خط (تتحرك صعودا ونزولا على طول اله ض محور طريق التمرير الماوس) التالية بنية الخلايا العصبية. انتقل إلى "تحليل، أدوات، مدير العائد على الاستثمار، اضافة" (بدلا من ذلك، اضغط على "ر") لحفظ خط. كرر هذه العملية كل محور عصبي أو التغصنات من الخلايا العصبية تحليل ^2.
   2. في الصحافة القائمة مدير دوروا على زر "القياس" للحصول على طول (أو معلمات إضافية). تصدير القياسات إلى ملف نصي أو جدول البيانات لتحليلها.

8. الكهربية

ملاحظة: إن الهدف من هذا البروتوكول هو الحصول على كامل الخلية التسجيلات المشبك الحالي من الطبقة الثانية / الثالثة الخلايا العصبية الخلايا الهرمية عيانا من التعبير GFP في أدمغة فئران-electroporated GFP (أو أي ببروتين آخر electroporated سابقا). وهو تكييف أساليب نشرت سابقا ^{17 و 18.} باستخدام هذا البروتوكول أنه من الممكن لدراسة تأثير modif الجينيication التي أدخلها IUE على الخصائص الكهربائية من الخلايا العصبية. اقتناء وسائط اطلاق محددة هو عملية تدريجية من التمايز الذي ينطوي على التعبير الديناميكي للذخيرة واسعة من القنوات الأيونية والذي ينتج في التعبير عن وسائط اطلاق عابرة قبل مراحل ما بعد الولادة المتأخرة. على سبيل المثال، لم يلحظ الاستجابات الكهربائية ناضجة في طبقة II / III من القشرة الحسية الجسدية الماوس قبل P16 ^{2، 19.}

1. المتطلبات الأساسية لشرائح الحادة
   1. إعداد أدوات جراحية معقمة لإزالة العقول من الفئران: المقصلة، لإزالة الرأس. مقص صغير، لقطع طريق الجمجمة. ملقط، لفصل الجمجمة من الأنسجة. ملعقة، لإزالة بدقة أنسجة المخ من غلاف. تقطيع اللحم لامع، لتشريح القشرة إلى نصفين متساويين. وماصة باستور، للتحرك شرائح من vibratome (وضعها في محلول يحتوي على السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) للتفتيش، ومن ثم نقل شرائح من ACSF إلى منطقة عقد الحضانة).
   2. إعداد 1 لتر من ACSF باستخدام مياه عالية النقاء (الماء المقطر المزدوج) التي تحتوي على 119 ملي مول كلوريد الصوديوم، 26 مم NaHCO ₃ و 11 ملي الجلوكوز، 2.5 ملي بوكل، 1.2 ملي MgCl _2، 2.5 ملي CaCl _2، و 1 ملي ناه ₂ ص _4. عاير درجة الحموضة إلى 7،3-7،4 مع حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم. ضبط الأسمولية إلى 290 ملي أوزمول.
   3. فقاعة ACSF مع كربوجين (95٪ O _2/5٪ CO ₂₎ ل15-20 دقيقة باستخدام أنابيب تفلون (~ 1 مم)، لتحقيق الاستقرار في درجة الحموضة إلى 7،3-7،4.
   4. تجميد 200 مل من محلول ACSF المشبعة مع كربوجين في -80 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة لتوليد حل تشريح ذائب. وضع صحن زراعة الأنسجة 100- × 20 ملم على الجليد تشريح الدماغ ل.
   5. إعداد 100 مل من 1٪ منخفضة ذوبان نقطة الحل الاغاروز فقط قبل بدء التجربة. تبريد حل، قطع قطعة مربعة من الاغاروز (أبعاد: 1 × 1 × 0.5 مم)، وsuperglue ذلك لخلف المنصة، وراء الحق حيث شرائح الدماغ (يوفر هلام الاغاروز الدعم للدماغ تشريح خلال). جعل الجبهة شقة ممكن.
2. الحصول على شرائح الحادة
   1. لشل حركة الماوس وتخدير مع الأيزوفلورين 2٪. وضع رئيس في افتتاح المقصلة وقطع رأس ذلك بسرعة. إزالة جمجمتها في أسرع وقت ممكن مع استخدام حراس العظام أو ملقط غرامة. وضع الدماغ في ACSF المبردة.
      ملاحظة: من المهم لتنفيذ هذه الخطوة بسرعة.
   2. وضع الدماغ في طبق ثقافة المبردة. قطع المخيخ مع مقص صغير.
   3. التقاط الدماغ مع ملعقة وصمة عار لتجف على منشفة ورقية.
   4. الغراء الطائرة ventrocaudal من الدماغ على حامل vibratome. ضع حامل على vibratome مليئة ACSF الجليد الباردة.
   5. الحصول على شرائح الحادة عن طريق قطع 300 ميكرون أقسام الاكليلية (ضمان استمرار carbogenation في جميع أنحاء الداخلي، على سبيل المثال، وضع عوامات (1 ملمأنبوب تترافلوروإيثيلين) في غرفة vibratome) باستخدام الإعدادات vibratome التالية: 0.06 ملم السعة و0،08-0،10 ملم / ثانية سرعة. تعيين مسبقا إلى أبطأ سرعة ممكنة (~ 22 ثانية لكل تمريرة). تعديل هذه الإعدادات المثلى والحصول على الظروف المثلى لكل جهاز تجريبيا إذا لزم الأمر.
   6. احتضان شرائح الحادة لمدة 60 دقيقة على الأقل في ACSF تستكمل مع 3 مم ميو -inositol، 0.4 ملي حمض الأسكوربيك، و2 مم البيروفات الصوديوم في حين ظهرت على السطح مع 95٪ O _2/5٪ CO ₂ الغاز. الحفاظ على درجة الحرارة عند 25 درجة مئوية.
   7. تنفيذ الإجراء تشريح في أقل من 15 دقيقة. إذا رغبت في ذلك، وشرائح يمكن تخزينها لمدة 1-7 ساعات قبل نقله إلى غرفة تسجيل للاستخدام.
3. المتطلبات الأساسية لتسجيل خلية كاملة
   1. تأكد من أن يتم تجهيز محطة الكهربية مع غرفة التسجيل، نظام نضح، المجهر، الأقطاب الكهربائية (تسجيل، وتحفيز، والأرض)، الاقتصاد الكلي والاقتصاد ميكرomanipulators، جامدة مقاومة للاهتزاز فوق المنضدة وقفص فاراداي، مشجعا، مكبر للصوت والتناظرية إلى الرقمية (A / D) تحويل، جهاز كمبيوتر مع برنامج الاستحواذ، وGFP (أو أي تألقي آخر) تصفية لتحليل معدلة وراثيا الخلايا العصبية ¹⁸ (الشكل 2A).
   2. إعداد الحل داخل الخلايا، التي تحتوي على 115 ملي غلوكونات البوتاسيوم، 2 مم MgCl ₂ و 10 ملي HEPES 20 ملي بوكل، 4 مم نا ₂ ATP، و 0.3 ملي نا ₃ GTP، بعد تعديلها لدرجة الحموضة 7.2 من KOH وإلى 290 ملي أوزمول التي كتبها بوكل.
   3. جعل ماصات التصحيح عن طريق سحب البورسليكات الشعيرات الدموية الزجاج. إعداد أقطاب التصحيح باستخدام مجتذب micropipette. الشعيرات الدموية استخدام البورسليكات (القطر الخارجي 1.5 ملم، 0.86 ملم القطر الداخلي، طول 10 سم). جعل أقطاب التصحيح تظهر المقاومة من 3-10 MΩ عندما تمتلئ حل داخل الخلايا.
   4. يروي غرفة تسجيل مع ACSF بمعدل 2 مل / دقيقة. الحفاظ على درجة حرارة الغرفة في approxim¢ الأمر 33 درجة مئوية.
4. تسجيل خلية كاملة
   1. نقل الشرائح في غرفة تسجيل باستخدام ماصة باستير (قطع رأس طويل) أو فرشاة صغيرة. اضغط باستمرار على شريحة مع القيثارة. يروي شرائح باستمرار مع ACSF بمعدل 2 مل / دقيقة.
   2. التصحيح الخلايا العصبية GFP إيجابية.
      1. وضع شريحة في غرفة تسجيل والبحث عن مجالات الاهتمام من خلال المجهر في التكبير المنخفض (10X). ثم، والعثور على خلية GFP إيجابية لرأب الصدع باستخدام الهدف 60X.
      2. ملء القطب تسجيل مع حل داخل الخلايا. استخدام حقنة مرتبطة مرشح (فلتر 4 ملم) ومحمل صغيرة تلميح إلى ملء القطب تسجيل مع حل داخل الخلايا.
      3. وضع ماصة الزجاج في حامل ماصة. مكان غيض ماصة في الحمام والتركيز على الحافة. مرة واحدة ماصة هي في الحمام، وتطبيق الضغط الايجابي من خلال نظام التحكم في الضغط الخلفي.
      4. التصحيح الخلايا العصبية التي هي فلوري (الشكل2B لدى عودتهم).
         1. نقترب من خلية من الفائدة في ظل التوجيه البصري مع الحفاظ على الضغط الى الوراء في ماصة. على ظهور الدمل صغير على سطح الخلية، والإفراج عن الضغط. عند هذه النقطة، ختم ضيق (المقاومة أكبر من 1 GΩ) يمكن تشكيلها. خلاف ذلك، وتطبيق الضغط السلبي الضوء (شفط) لتسهيل ذلك.
         2. في حين يتم تشكيل ختم، وجلب المشبك عقد الجهد ل-60 بالسيارات. مرة واحدة يتم تشكيل ختم GΩ، وتطبيق نبض الشفط لتمزق غشاء الخلية تحت ماصة والانتقال إلى وضع خلية كاملة. أنظر المرجع ⁽²⁰⁾ لمزيد من التفاصيل.
      5. تسجيل النشاط باستخدام الظروف المشبك الحالي ^21. مرة واحدة في وضع خلية كاملة، والتحول من الجهد المشبك إلى وضع المشبك الحالي وبدء التسجيل. على سبيل المثال، لتسجيل استثارة الخلايا، وتطبيق 500 مللي طويلة depolarizing الحقن الحالية (100-400 السلطة الفلسطينية).
         1. حساب معدلات اطلاق بذ المتهم بالتآمر في عدد من إمكانات العمل جنبا إلى جنب القطار لزيادة التيارات الإدخال.
            ويمكن أيضا أن تحسب يستريح غشاء المحتملة، ومقاومة المدخلات، والسعة غشاء من التسجيلات ^21: ملاحظة.

لوصف التغيرات المورفولوجية من الخلايا العصبية في التفاصيل وطوال التنمية، لا بد من تسمية الخلايا العصبية قليلة. يسمح هذا النظام لجنة المساواة العرقية recombinase المخفف للتعبير عن الجينات في المصالح في عدد سكانها قليل من الخلايا العصبية، بحيث فقط تلك الخلايا العصبية التي تتضمن هذا الانزيم تعبر عن GFP (الشكل 1A). باستخدام هذه الاستراتيجية، والتي تستهدف الطبقة II-III وصفت من قبل IUE في E15.5. CAG-DsRed2 في 1 ميكروغرام / ميكرولتر، ويبعد شارك electroporated كوسيلة لمراقبة وتحديد العقول إيجابية electroporated في الحيوانات الحية. الأهم من ذلك، بعد تلطيخ مع الأجسام المضادة لمكافحة GFP، إشارة قوية بما فيه الكفاية للسماح لتصور واضح للالأشكال التضاريسية والمحاور (1D الشكل وE) شجيري الخاصة بهم.

بعد IUE والكهربية، يتم استخدام تحليل المعلمات التي تم الحصول عليها من تسجيلات خلية كاملة للمشاركةmpare الردود اطلاق النار واستثارة الخلايا electroporated في ظل ظروف مختلفة. ويمكن الحصول على العديد من المعلمات. وينبغي تكييف المعلمات لدراسة معينة باستخدام برامج معينة تحليل التصحيح، المشبك. يوفر الشكل 2C مثال على مؤامرة من إمكانات العمل ضد المدخلات الحالية التي تم الحصول عليها من تسجيلات لطبقة WT الخلايا العصبية II-III التي تم electroporated في E15.5.

الشكل 1. لجنة المساواة العرقية recombinase المخففة استراتيجية تمكن صفها متناثر من العصبونات القشرية. ألف ملخص تخطيطي للاستراتيجية. في الخلايا العصبية التي تحمل كلا CALNL-GFP ولجنة المساواة العرقية، يتم استئصاله الكاسيت LoxP-إيقاف-LoxP من CALNL-GFP، ويتم التعبير عن GFP من قبل المروج CAG قوي. B. تخطيطي رسم الشعرية البورسليكات سحب باستخدام مجتذب micropipette. وقطع رأس كتبها FOrceps، وخلق زاوية 30 درجة. قياس 1 سم من الحافة إلى بداية الجزء الضيق من الشعيرات الدموية. C. موقف أقطاب لاستهداف القشرة الحسية الجسدية. يتم وضع أقطاب البلاتين تقريبا على مسمع من الجنين. بسبب تهمة السلبي، الحمض النووي يذهب في اتجاه القطب الموجب عند تطبيق الجهد. الاختلاف في الموقف من الأقطاب يسمح استهداف مناطق الدماغ المختلفة. تم تسليم D. الصور التي تم الحصول عليها بعد نواقل إلى طبقة الخلايا العصبية II-III بواسطة electroporation في الرحم في اليوم الجنينية 15.5. وقدمت أقسام الاكليلية في يوم ما بعد الولادة 16. وقد شارك في transfected متجه CAG-DsRed2 كعنصر تحكم (يسار). وأعرب عن GFP (وسط) فقط في تلك الخلايا العصبية التي أدرجت أيضا لجنة المساواة العرقية، والسماح للإعادة التركيب من المواقع LoxP في ناقلات CALNL-GFP. وضع العلامات متفرق يسمح الخلايا العصبية الفردية لتمييزها (السهام). E. عالية التكبير صورة مبائر رانه شجيري العرش من آخر الخلايا العصبية GFP المسمى قليلة. الحانات النطاق = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. إعدادات الكهربية ومثال على الاستجابة إطلاق النار. ويوضح ألف الصورة الإعداد الكهربية المستخدمة للتجارب المشبك التصحيح في شرائح حادة. يتم تضمين برنامج الإعداد في قفص فاراداي للقضاء على الضوضاء، والمعدات على رأس جدول مضادة للاهتزاز. ويلاحظ تحكم من micromanipulators الآلية لالأقطاب على اليسار. B. هرمية الخلايا العصبية على فأرة الحاسوب electroporated مع GFP، لاحظ تحت مشرق الميدان والشروط مضان الخضراء. ماصة تسجيل تعلق على خلية GFP + هو ملحوظ. شريط النطاق = 10 & #181؛ م. جيم إطلاق أنماط من CAG-GFP electroporated الخلايا العصبية طبقة التحكم II-III تظهر استجابة ارتفاعه العادية التقليدية. توزيع إمكانات العمل يقترب من توزيع منتظم على طول مدة المدخلات الحالية (المحور السيني). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: الجهد الشروط وكهربائي لElectroporation للمن الأجنة.

يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية تسمية الخلايا العصبية في القشرة الحسية الجسدية من C75BL / 6 الفئران من أجل تحليل الارتباط واستثارة بهم. وفيما يتعلق بأساليب القائمة، فإنه يتصور جوانب تميز من الاتصال، مثل عدد من فروع محور عصبي في الخلايا العصبية، والطوبوغرافيا على وجه الدقة، وموقعها التشريحي. عن طريق تغيير موقف الأقطاب، فمن الممكن لاستهداف السكان الخلايا العصبية الأخرى، مثل القشرة الحزامية (الحفاظ على نفس الزاوية بين الأقطاب والدماغ، ولكن تغيير اتجاه القطبين) أو قرن آمون ^5، وأداء مماثل تجارب وصفها الخلايا العصبية الفردية أو السكان على نطاق أوسع، وهذا يتوقف على الاستراتيجية المنشودة. ومع ذلك، هناك قيود على هذا، وليس كل السكان يمكن الوصول إليها على قدم المساواة أو بنفس القدر صفت بشكل انتقائي. على سبيل المثال، في قرن آمون، فمن الممكن لاستهداف انتقائي الخلايا العصبية ولدوا في وقت متأخر من المنطقة CA1، ولكن عصاميصادف Electroporation للRLY السكان غير متجانسة من الخلايا الهرمية الداخلية والخارجية. في قشرة الدماغ، يولد الخلايا العصبية بشكل متتابع، وذلك في اليوم الحمل خلال IUE يحدد أي طبقة القشرية يتأثر. أداء أهداف IUE السابقة الخلايا العصبية العميقة (على سبيل المثال، IUE في E14 التسميات الخلايا العصبية طبقة الرابع) ^22.

لIUE ناجحة، فمن المستحسن أن تأخذ في الحسبان اعتبارات معينة. أولا، من المهم أن تفعل عملية جراحية في أقل من 30 دقيقة من أجل تقليل الضغط على الأم وزيادة فرص البقاء على قيد الحياة من الجراء. ثانيا، الجزء الأكثر صعوبة في إجراء هو حقن الحمض النووي أداء حقن عن طريق الشعيرات الدموية البورسليكات كما بلطف قدر الإمكان. إذا لم يتم الضغط على الأجنة من الصعب جدا، فإنها يمكن أن يتعرضوا للأذى. من حيث استكشاف الأخطاء وإصلاحها وفاة الأجنة خلال الحقن الحمض النووي، الميلا طرف بزاوية 30 درجة يمكن أن تزيد من فعالية هذا المواليةسيس. إذا كان beveller غير متوفرة والشعيرات الدموية وقطع فقط مع ملقط، ويمكن التأكد من الزاوية الصحيحة في المجهر تشريح. تجاهل الشعيرات الدموية غير كافية. وأخيرا، والتكيف مع الظروف Electroporation لللمرحلة الجنين المهم من أجل زيادة معدل البقاء على قيد الحياة (انظر الجدول 1).

ضرورية بعض الاعتبارات فيما يتعلق الإعمار من المحاور والتشعبات. لتسمية الخلايا العصبية الفردية، والتركيز السليم للالبلازميد لجنة المساواة العرقية ضرورية للحصول على جيد، والتعبير متفرق وتجنب التداخل المربك من التوقعات العصبية التي تنتمي إلى الخلايا العصبية المختلفة. على الرغم من أن هذا البروتوكول يقترح استخدام 4 نانوغرام / ميكرولتر، قد يكون من الضروري لضبط تركيز البلازميد لكل تجربة، اعتمادا على المروج المستخدمة، ونوعية إعداد الحمض النووي، وطريقة القياس الكمي الحمض النووي (على سبيل المثال، والحد من ل 2 نانوغرام / ميكرولتر إذا وسم الكثير من الخلايا العصبية). في additiعلى، لتتبع محور عصبي، فمن المهم لقطع في زاوية مناسبة من أجل الحصول على الخلايا العصبية كلها في نفس الطائرة.

خطوات حاسمة لنجاح تسجيلات التصحيح المشبك هي صحة أنسجة شرائح الحادة والموقع وفرة من الخلايا العصبية GFP إيجابية electroporated. إذا فشلت الخطوات الترقيع أو وجدت ردود الشاذة خلال التسجيلات، والحد من الوقت اللازم لتجهيز شرائح حادة. إذا الخلايا العصبية GFP يصعب تحديد هوية ومكان نظرا لانخفاض أعدادهم في شريحة الحادة، وضمان أن يتم تضمين كافية البلازميد CAG-GFP في مزيج Electroporation لل. وفيما يتعلق بالقيود الرئيسية للنهج الموصوفة هنا، وتقنية التصحيح، المشبك تسمح للتسجيل العديد من العوامل المختلفة التي تصف استثارة الخلايا العصبية، ولكن لا تقييم الجوانب التي تعتمد على الدائرة كلها. أيضا، وعلى النحو المشار إليه أعلاه، ليس كل المجموعات السكانية الفرعية الخلايا العصبية يمكن الوصول إليها من خلال IUE. وخلاصة القول، في عشرالمستقبل الإلكترونية، ويمكن لهذه التقنيات تساهم في مزيد من التحليل للاتصال الهيكلي والوظيفي للالقطعان العصبية المختلفة في المخ.