Summary

低周波体細胞変異の検出のための高感度な方法として直接配列決定と組み合わせるPCRをブロックする野生型

Published: March 29, 2017
doi:

Summary

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Abstract

治療、治療中に耐性変異を出現するためのスクリーニング、または場合患者が少数の循環腫瘍細胞を有していた後に残存病変を評価する場合、低周波変異の正確な検出と識別が問題となり得ます。配列決定分析に続くPCRブロッキング野生型は、これらの低周波数の変異を検出するための方法として、高感度、柔軟性、および単純さを提供しています。新しいまたは以前に確立された従来のPCRに基づく配列決定アッセイにカスタム設計されたロックされた核酸、オリゴヌクレオチドを添加することにより、1000個のWT対立遺伝子のバックグラウンドで約1変異対立遺伝子の感度は、(1,000 1)を達成することができます。一般的に、ホルマリン固定パラフィン包埋組織で見出さ脱アミノ化イベントに関連付けられたシーケンシングアーチファクトが部分的に抽出工程中のウラシルDNAグリコシラーゼを使用することによって改善することができます。ここで最適化されたプロトコルは、MYD88の変異を検出するための具体的であるが、任意のを設計するためのテンプレートとして機能することができWTB-PCRアッセイ。対立遺伝子特異的PCR及びリアルタイム定量PCRを含む低頻度変異の検出のための他の一般的に利用されるアッセイオーバーWTB-PCRアッセイ法の利点は、偽陽性の少ない発生、柔軟性と実装の容易さ、および検出する能力を含む既知の両方および未知の変異。

Introduction

サンガー配列決定は、伝統的に、既知および未知の体細胞変異の検査でゴールドスタンダードとなっています。 ( – WTのバックグラウンド中の20%の変異対立〜10)1サンガー配列決定の制限の1つは、検出の限界です。感度のこのレベルは、いくつかの循環腫瘍細胞、又は骨髄(BM)は、斑状のときと前悪性組織または患者からの試料中に存在し得る低レベルの体細胞変異を検出するためには不適切です。これはまた、治療後の残存疾患を評価する単独2従来の配列決定により困難な治療中に新たな耐性変異を検出することができます。ロックされた核酸(LNA)と、従来のPCRを置き換えることによって、サンガー配列決定にPCR(WTB-PCR)をブロックする野生型の媒介、WTの背景で最大0.1%突然変異対立遺伝子の感度は、2、3、4達成することができます。にこれにより、WT DNAの増幅を防止WT DNAに優先的に結合する(LNA)、オリゴヌクレオチドをブロック – (14 NT〜10)WTB-PCRは、変異体対立遺伝子について富化は短いの添加を介して達成されます。変異体富化WTB-PCR産物は、次いで、配列決定することができます。 WT DNAを遮断ではなく、特定の変異について選択することによってWTB-PCRは、微小細胞画分中に存在する既知および未知の変異の濃縮を可能にします。

複数の方法は、現在、小細胞画分における変異を検出するために使用されます。これは、高速液体クロマトグラフィー(DHPLC)、ビーズ、エマルジョン、増幅、および磁気(のBEAMing)、電界誘起放出および測定(EFIRM)、高分解能変性、対立遺伝子特異的PCR、増幅不応性変異システム(ARMS)を含みます融点など。しかし、これらの方法のほとんどは偽陽性とのみアッセイは4のために設計された一つの変異を検出する能力によって制限されています</SUP>。 WTB-PCRは、しかし、ユーザが複数の変異型の検出を可能にし、成果物または脱アミノ化の事象による偽陽性を除外するのを助けることができるシーケンシングトレースを視覚化することができます。次世代シーケンシング(NGS)が、実質的に大きなコスト、複雑さ、及びより長いアッセイ時間はそれをいくつかの異なる分子マーカーを有する多くの疾患の種類または新興のための治療を受けている患者を監視するための不要なオプションをレンダリング、従来の配列決定に適切な代替を提供することができます耐性変異。さらに、高い偽陽性率が5%未満の変異対立遺伝子頻度を有する変異体を検出した場合は、アンプリコンベースのNGS 5、6のための問題を提起することができます。

ここでは、Albitar によって記載されているように骨髄分化因子88遺伝子の突然変異のスクリーニングにWTB-PCRによって達成感度の増加を示します。 3 MYD88のmutatioNSは、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症(WM)未知の重要性(IgMでMGUS)の、IgMモノクローナル免疫グロブリン血症、脾臓辺縁帯リンパ腫(SMZL)における重要な診断および予後因子であり、大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)を拡散します。 MYD88の変異は、WMとMGUSを分泌する免疫グロブリンM(IgM抗体)の患者の約50%のほぼすべてのケースで発見されました。対照的に、MYD88突然変異はSMZL患者の唯一の0から6パーセントに見られ、多発性骨髄腫7,8に存在しないされています。重複形態学、免疫表現型、細胞遺伝学的、およびWM及びSMZL又はIgM、多発性骨髄腫との間の臨床的特徴は、多くの場合、鑑別診断を複雑にすることができるので、MYD88変異の存在は、有用な同定因子9として機能することができます。 MYD88の変異はまた治療7次DLBCLと貧しい全体的な生存患者においてより大きな疾病負担と関連しています</SUP> 10。また、MYD88突然変異はより頻繁に活性化B細胞様(ABC)DLBCLで発見されているのでBが細胞様(GCB)DLBCLまたは原発性縦隔B細胞リンパ腫(PMBL)、MYD88の変異状態として働くことができる胚中心ABCサブタイプ11、12の代理マーカー。

ここで提供される詳細なプロトコルは、新しいアッセイを開発することができるか、またはほとんどの既存の配列決定アッセイを容易に正確に様々な試料タイプにおける低頻度変異を検出するように構成することが可能なテンプレートとして役立ちます。アプローチはまた、モニタリング及び腫瘍または患者は標的療法または抗生物質で治療されている間に発生することがあっても、細菌で発症し得る耐性変異を検出するために使用することができます。さらに、それは特にホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織では、変異濃縮に関連する問題の多くに対処し、救済。

Protocol

倫理文:ヒトサンプルのすべてのテストは、治験審査委員会(IRB)の承認を得た後に行われました。 1. FFPE組織からのDNA抽出、末梢血、及び骨髄吸引 DNA FFPE抽出キットと骨髄FFPE組織のための ( – 5時10節 – 10μmの厚さ5)未染色スライドからのFFPE組織で始まります。 注:組織の削りくずとの始まりは、3つを使用する場合 – 5で6セクションを – 10ミクロン…

Representative Results

拡張時WTB-PCRの概念の概要は、 図1に示されています。ブロッカー-DNAハイブリッド中の一塩基ミスマッチが大きく、その融解温度低下するため(ΔTM = 20から30°C)の変異鋳型DNAは、拡張17を完成するのに自由であるが、WT対立遺伝子の増幅が阻止されます。 WT DNAが直線的に増幅されている間、このように、変異体DNAを指数関数的に?…

Discussion

WTB-PCRアッセイは、ここで説明する拡張( 図1)の間にWT DNAの増幅をブロックするように設計されたブロッキングオリゴプライマーの一般的なセットを使用します。 WTB-PCR産物は、次いで、変異解析のために配列決定されます。 WTB-PCR /サンガーの有用性は、その単純性、高感度、高スループットです。ここで説明するガイドラインを使用して、ほとんどの既存のサンガーベースの?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors have no acknowledgements.

Materials

1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes Eppendorf 05-402-25
100% alcohol VWR 89370-084 Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencer ABI or equivalent
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foils GeneMate T-2451-1 For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit Life Technologies 4337455 For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 Series Eppendorf A-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well plates Eppendorf Z606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100mM) Invitrogen 10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted Magnet Thermo Fisher Scientific 12027 For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute  Sigma E7023 200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Tools www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul) Roche 12032937001 With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 
Gel electrophoresis apparatus 2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit  Qiagen 180134 Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di Formamide ABI 4311320 For sequencing.
LNA oligonucleotide Exiqon 500100 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing Primer ABI 5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing Primer ABI 5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler Eppendorf E950030020
Microcentrifuge Model 5430 Eppendorf FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
PCR forward primer IDT 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primer IDT 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR plates GeneMate T-3107-1
Pipettors 20, 200, 1000 µl
Plate septa, 96 well ABI 4315933
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen 51304 For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0 ABI 4474978 For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3M, pH 5.2)  Sigma S7899
Sterile filtered pipette tips  20, 200, 1000 µl
Thermomixer C  Eppendorf 5382000023
Vortex genie Scientific Industries SI-0236
Wash reservoir ~1000 ml
Xylene VWR 89370-088 Histology grade

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Diesen Artikel zitieren
Albitar, A. Z., Ma, W., Albitar, M. Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations. J. Vis. Exp. (121), e55130, doi:10.3791/55130 (2017).

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