Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen
Summary
Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.
Abstract
Eine genaue Erfassung und Identifizierung von Niederfrequenzmutationen können problematisch sein, wenn Resterkrankung nach der Therapie die Beurteilung, Screening für neue Resistenzmutationen während der Therapie, oder wenn die Patienten haben wenige zirkulierende Tumorzellen. Wildtyp durch Sequenzanalyse gefolgt PCR Blockierung bietet eine hohe Empfindlichkeit, Flexibilität und Einfachheit als Methode, diese niedrigen Frequenz Mutationen zu detektieren. Durch das Hinzufügen eines benutzerdefinierten Nukleinsäure-Oligonukleotid an ein neuen oder zuvor etablierten konventionellen PCR basierten Sequenzierungsassay entworfen verriegelte, Empfindlichkeiten von etwa 1 mutanten Allels in einem Hintergrund von 1000 WT Allele (: 1000 1) erreicht werden. Sequenzierungsartefakten im Zusammenhang mit Ereignissen Desaminierung üblicherweise in Formalin fixierten Paraffin eingebetteten Geweben teilweise durch die Verwendung von Uracil-DNA-Glycosylase während Extraktionsschritte behoben werden kann. Das optimierte Protokoll hier ist spezifisch zum Nachweis MYD88 Mutation, sondern kann als Vorlage dient jeden entwerfenWTB-PCR-Assays. Die Vorteile des WTB-PCR-Test gegenüber anderen häufig verwendeten Tests zum Nachweis von niedrigen Frequenz Mutationen einschließlich Allel-spezifische PCR und quantitative Echtzeit-PCR weniger Vorkommen von Fehlalarmen sind, eine größere Flexibilität und eine einfache Implementierung und die Fähigkeit zu erkennen, sowohl bekannte als und unbekannte Mutationen.
Introduction
Sanger-Sequenzierung ist traditionell der Goldstandard in der Erkennung von bekannten und unbekannten somatischen Mutationen. Eine der Einschränkungen der Sanger – Sequenzierung ist die Nachweisgrenze (~ 10 – 20% mutanten Allels in einem Hintergrund von WT) 1. Dieses Maß an Empfindlichkeit ungeeignet ist für geringe somatische Mutationen erfassen, die in Proben von Geweben oder prämalignen Patienten mit wenigen zirkulierenden Tumorzellen vorhanden sein können, oder, wenn Knochenmark (BM) sind lückenhaft. Dies macht auch Resterkrankung nach der Therapie oder zum Nachweis von Schwellenresistenzmutationen während der Therapie schwierig durch konventionelle Sequenzierung allein 2 zu beurteilen. Durch Ersetzen der konventionelle PCR mit verschlossenen Nukleinsäure (LNA) -vermittelten Wildtyp – blockierende PCR (WTB-PCR) in Sanger – Sequenzierung, Empfindlichkeiten von bis zu 0,1% mutanten Allels in einem Hintergrund von WT 2, 3, 4 erreicht werden. ImWTB-PCR, Anreicherung für mutante Allele wird über die Zugabe eines kurzen erreicht (~ 10 bis 14 NT) Blocking (LNA) Oligonukleotid, das bevorzugt an WT DNA wodurch verhindert Amplifikation von WT DNA bindet. Die Mutante angereicherte WTB-PCR-Produkt kann dann sequenziert werden. WT DNA anstelle der Auswahl für spezifische Mutationen WTB-PCR ermöglicht die Anreicherung von bekannten und unbekannten Mutationen in winzigen Zellfraktionen durch die Blockierung.
Mehrere Verfahren sind zum Nachweis von Mutationen in kleinen Zellen Fraktionen derzeit verwendet. Dazu gehören allelspezifische PCR Amplifikation-Refractory Mutation System (ARMS), denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (DHPLC), Perlen, Emulsionen, Amplifikation und Magnetics (beaming), elektrisches Feld induzierte Freisetzung und Messung (Efirm), hochauflösende Schmelzpunkt und andere. Allerdings sind die meisten dieser Methoden begrenzt durch falsch-positive und die Fähigkeit, nur eine Mutation nachzuweisen , dass der Assay entwickelt wurde 4 </sup>. WTB-PCR, jedoch ermöglicht es dem Benutzer Sequenzierungsspuren sichtbar zu machen, die den Nachweis mehrerer Mutationstypen ermöglicht und in auszuschließen Fehlalarme aufgrund Artefakte oder Desaminierung Ereignisse helfen können. Next-Generation-Sequencing (NGS) eine geeignete Alternative zu herkömmlicher Sequenzierung bieten kann jedoch wesentlich höher Kosten, Komplexität und mehr Testzeit machen ihnen eine unnötige Option für viele Krankheitstypen mit wenige verschiedenen molekularen Marker oder zur Überwachung von Patienten auf Therapie für die Schwellen Resistenzmutationen. Weiterhin hohe falsch positive Raten bei der Erkennung Varianten mit mutanten Allel – Häufigkeiten von weniger als 5% können ein Problem für Amplicon-Basis darstellen NGS 5, 6.
Hier zeigen wir die Steigerung der Empfindlichkeit erreicht durch WTB-PCR in Screening auf Mutationen in dem myeloischen Differenzierungsfaktor 88 – Gen , wie durch Albitar et al. 3 MYD88 mutations sind wichtige diagnostische und prognostische Faktoren in Morbus Waldenström (WM), IgM monoklonaler Gammopathie unklarer Signifikanz (IgM-MGUS), Milz- Randzone Lymphom (SMZL) und diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom (DLBCL). MYD88 Mutationen sind in fast allen Fällen von WM und etwa 50% der Patienten mit Immunoglobulin M (IgM) -sezernierenden MGUS gefunden. Im Gegensatz dazu sind MYD88 Mutationen in nur 0-6% der Patienten mit SMZL und fehlt bei multiplem Myelom 7, 8 gefunden. Da überlappende morphologischen, immunphänotypische, zytogenetischen und klinische Charakteristika zwischen WM und SMZL oder IgM-multiplem Myelom häufig Differentialdiagnosen können, das Vorhandensein einer Mutation MYD88 komplizieren kann als nützlich identifiziert Faktor 9 dienen. MYD88 Mutationen auch mit einem größeren Krankheitsbelastung bei Patienten mit DLBCL und schlechter Gesamtüberlebenszeit nach der Therapie 7, in Verbindung gebracht worden </sup> 10. Darüber hinaus, da MYD88 Mutationen sind häufiger in aktivierten B-Zell-like (ABC) DLBCL als Keimzentrum-B-Zell-like (GCB) DLBCL oder primärer mediastinalen B-Zell-Lymphom (PMBL), MYD88 Mutationsstatus als dienen kann gefunden Surrogatmarker für das ABC – Subtyp 11, 12.
Das detaillierte Protokoll hier zur Verfügung gestellten dient als Vorlage, aus denen neue Tests entwickelt werden können, oder die meisten bestehenden Sequenzierung Assays können leicht genau angepasst werden, um Niederfrequenz Mutationen in verschiedenen Probentypen zu erkennen. Der Ansatz kann auch zur Überwachung und Erfassung resistente Mutationen verwendet werden, die in Tumoren oder sogar Bakterien entwickeln können, die sie entwickeln kann, während Patienten mit gezielter Therapie oder Antibiotika behandelt werden. Darüber hinaus richtet sie und Abhilfen viele der Probleme mit der Mutation Anreicherung verbunden sind, insbesondere in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebe in Formalin fixiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die WTB-PCR – Assay beschrieben hier verwendet einen generischen Satz von Primern mit einem blockierenden Oligo während des Ausfahrens (Figur 1) zu blockieren Amplifikation von WT DNA konstruiert. Das WTB-PCR-Produkt wird dann für Mutationsanalyse sequenziert. Die Nützlichkeit der WTB-PCR / Sanger liegt in seiner Einfachheit, hohe Empfindlichkeit und hohen Durchsatz. Mit den hier beschriebenen Richtlinien, die meisten bestehenden Sanger basierte Assays können einfach über die Zugabe eines blockiere…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| 1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% alcohol | VWR | 89370-084 | Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol |
| 3730XL sequencer | ABI | or equivalent | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | For magnetic bead PCR purification |
| Aluminum sealing foils | GeneMate | T-2451-1 | For PCR and cold storage |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit | Life Technologies | 4337455 | For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer |
| Centrifuge 5804 Series | Eppendorf | A-2-DWP rotor (for PCR plate) | |
| Cold plate for 96 well plates | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, ultra-pure water | |||
| dNTPs (100mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Side-Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | For use in PCR Purification. |
| Ethanol Absolute | Sigma | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| Exiqon website Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul) | Roche | 12032937001 | With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 |
| Gel electrophoresis apparatus | 2% agarose gel | ||
| GeneRead DNA FFPE extraction Kit | Qiagen | 180134 | Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | For sequencing. |
| LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases) |
| M13-F Sequencing Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes) | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR forward primer | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR reverse primer | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettors | 20, 200, 1000 µl | ||
| Plate septa, 96 well | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | For BM aspirate and peripheral blood |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | For sequencing analysis |
| Slide basket | |||
| Sodium Acetate (3M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
| Sterile filtered pipette tips | 20, 200, 1000 µl | ||
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash reservoir | ~1000 ml | ||
| Xylene | VWR | 89370-088 | Histology grade |
Referenzen
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