L'utilisation d'un TMEM184A GFP-tagged Construct pour Confirmation de Heparin Receptor Identity
Summary
Un TMEM184A codant pour la construction d'une étiquette de la GFP à l'extrémité carboxy-terminale conçu pour l'expression eucaryote, a été utilisé dans des essais visant à confirmer l'identification de TMEM184A comme récepteur d'héparine dans les cellules vasculaires.
Abstract
Lorsque de nouvelles protéines sont identifiées par l'isolement et l'analyse bioinformatique basée sur l'affinité, ils sont souvent en grande partie non caractérisés. Des anticorps dirigés contre des peptides spécifiques de la séquence prédite permettent des expériences de localisation. Cependant, d'autres interactions possibles avec les anticorps ne peuvent souvent pas être exclus. Cette situation a permis d'élaborer une série de tests qui dépendent de la séquence protéique. Plus précisément, une construction contenant la séquence de gène couplé à la séquence codant pour la GFP à l'extrémité C-terminale de la protéine a été obtenu et utilisé à ces fins. Des expériences pour caractériser la localisation, l' affinité du ligand, et le gain de la fonction ont été initialement conçues et réalisées pour confirmer l'identification des TMEM184A comme un récepteur d'héparine 1. En outre, la construction peut être utilisé pour des études portant sur la membrane des questions de topologie et des interactions protéine-ligand détaillés. Le présent rapport présente arange de protocoles expérimentaux basés sur la construction GFP-TMEM184A exprimé dans les cellules vasculaires qui pourraient facilement être adapté à d'autres nouvelles protéines.
Introduction
L'identification des protéines candidates pour de nouvelles fonctions dépend souvent des protocoles d'isolement basées sur l'affinité suivie par une détermination de séquence partielle. De récents exemples de protéines nouvellement identifiées comprennent la protéine transmembranaire 184A (TMEM184A), un récepteur d'héparine identifié après les interactions d'affinité d' héparine 1 et TgPH1, une protéine de domaine pleckstrine qui se lie phosphoinositide PI (3,5) P2 2. Autre nouvelle identification des protéines implique une analyse de séquence directe de peptides tel que , par Vit, et al. qui a utilisé des peptides transmembranaires pour identifier les produits de protéines à partir de gènes précédemment non caractérisés 3. De même, l' identification de nouvelles séquences de protéines peut être réalisée en utilisant la bioinformatique à la recherche de familles de protéines précédemment caractérisées telles que l' identification de nouvelles protéines 4TM 4. L'examen des séquences de gènes de la famille des aquaporines a alainsi cédé l'identification de nouveaux membres avec de nouvelles fonctions 5. Après l'identification, l'analyse de la fonction des protéines est typiquement une étape suivante qui peut parfois être examinée à l'aide d'un dosage spécifique de la fonction de la protéine comme dans le cas d'aquaporine.
Lorsque cela est possible, la fonction d'une protéine nouvellement identifiée peut être examinée avec enzymatique spécifique ou des tests de fonction similaires in vitro. Étant donné que de nombreuses fonctions nouvelles protéines dépendent des interactions complexes qui se produisent uniquement dans des cellules ou organismes intacts, dans des essais in vitro ne sont pas toujours efficaces. Cependant, les dosages in vivo doivent être conçus de telle sorte qu'ils dépendent de la séquence du gène. Dans la culture cellulaire, et / ou des organismes modèles simples, knockdown peut apporter la preuve pour l'identification de protéines / fonction 6. Avec de nouvelles protéines identifiées comme indiqué ci-dessus, il est souvent insuffisant pour simplement renverser une protéine pour confirmer la fonction, und la conception des tests fonctionnels in vivo qui dépendent de la séquence du gène devient important pour la caractérisation de nouvelles protéines.
L'identification récente de TMEM184A comme un récepteur d'héparine (qui module la prolifération dans le muscle lisse vasculaire et des réponses inflammatoires dans les cellules endothéliales) utilisant la chromatographie d'affinité et MALDI MS 1, 7 a été l'occasion de développer une collection d'essais après knockdown a abouti à des résultats cohérents avec l'identification . Une étude récente a confirmé que l' héparine interagit spécifiquement avec plusieurs facteurs de croissance, leurs récepteurs, les composants de la matrice extracellulaire, des récepteurs d'adhésion cellulaire et d' autres protéines 8. Dans le système vasculaire, l' héparine et l' héparane sulfate protéoglycanes (contenant du sulfate d' héparane des chaînes de structure similaire à l' héparine) interagissent avec plusieurs centaines de protéines 9. Pour confirmer fonctionnellement that TMEM184A a été impliqué dans l'absorption d'héparine et de liaison, les techniques qui employaient la construction de gène pour TMEM184A ont été développés. Le présent rapport comprend une collection de tests basés sur une GFP-TMEM184A construire pour une utilisation à confirmer l'identité du TMEM184A comme un récepteur de l'héparine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protocoles présentés ici ont été conçus pour fournir une preuve de confirmation pour l'identification de TMEM184A en tant que récepteur de l' héparine dans des cellules vasculaires 1. techniques Knockdown sont couramment utilisés comme un mécanisme permettant de confirmer l'identification de nouvelles protéines. Cependant, une certaine perte fonctionnelle après l'effet de choc est en général pas suffisamment de preuves qu'une protéine candidate est en fait le…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the Lowe-Krentz lab is supported by research grant HL54269 from the National Institutes of Health to LLK.
Materials
| GFP-TMEM184A construct | OriGene | RG213192 | |
| Rhodamine-Heparin | Creative PEGWorks | HP-204 | Light Sensitive |
| Fluorescein-Heparin | Creative PEGWorks | HP-201 | Light Sensitive |
| Mowiol | EMD Millipore | 475904-100GM | |
| Paraformaldehyde (methanol free) | Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific | PI28908 at Fisher | Use in Fume Hood |
| Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes) | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | PI15510 at Fisher | Pay attention to shelf-life |
| Black 96 well plates | Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific | 064432 at Fisher | |
| A7r5 vascular smooth muscle cell line | ATCC | CRL 1444 | Can be exchanged into MEM medium1 |
| BAOEC bovine aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | B304-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7 |
| BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells | Cell Applications, Inc. | B354-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1 |
| RAOEC rat aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | R304-05a | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7 |
| Biotinylated anti-GFP | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | MA5-15256-BTIN | |
| Streptavidin-coated beads | Sigma | S1638 | |
| HeBS | Available from Bio-Rad | Can be prepared in the lab. The pH is 6.8 | |
| TMEM184A antibody to the N-terminus | Santa Cruz Biotechnology | sc292006 | Only known TMEM184A antibody to N-terminal region. |
| TMEM184A antibody to the C-terminus | Obtained from ProSci Inc, Poway, CA | Pro Sci 5681 | ProSci used in figure 1 |
| GFP antibodies | Santa Cruz Biotechnology | sc9996 | Used in figures 5 |
| Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA | 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3) |
Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining. |
| CHAPS | Purchased from Sigma | C5849 | Note that this specific catalog number has been discontinued. Supplier will provide information regarding replacement. |
| Live imaging 35 mm dishes | MatTek (Ashland MA) | P35G-1.0 – 20 mm – C | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens | Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3 |
| Confocal Microscope | Nikon | C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens | Used for images in Figure 5 |
| Confocal Microscope | Zeiss | Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens | Used for images in Figure 2C |
| Electroporation equipment | Bio-Rad | Gene Pulser X-Cell System | |
| Electroporation cuvettes | Available from MidSci | EC2L | Can also be obtained from equipment supplier |
| Plate reader | TECAN | TECAN Infinite® m200 Pro plate reader | Readings in the middle of the wells rather than at the surface. |
| Computer program for measuring staining intensity | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line |
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail |
| Cell Culture trypsin solution | Sigma | T4174 | purchased as a 10X solution |
Referenzen
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