פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה, לשחזור ופשוטה של בידוד והתרבות של ובתאים myoblast מן שרירי השלד של מבוגרים וישישים. השרירים המשמשים כאן כוללים שרירי כף הרגל והרגל. גישה זו מאפשרת הבידוד של אוכלוסייה מועשרת של myoblasts העיקרי ללימודים תפקודיים.
הומאוסטזיס שרירי שלד תלוי צמיחת שרירים (היפרטרופיה), ניוון והתחדשות. במהלך הזדקנות וכן בכמה מחלות, מבזבז שריר מתרחש. אובדן מסה ותפקוד שרירים קשור ניוון סוג הסיב שריר, מיתוג סוג הסיבים, התחדשות שריר פגומה הקשורות בתפקוד של תאי לווין, תאי גזע שריר, ותהליכי pathophysiological אחרים. שינויים אלו קשורים עם שינויים תאיים כמו גם נישות מקומיות ומערכתיות. בנוסף במודלים של מכרסמים הנפוצים ביותר של הזדקנות שרירה, יש צורך ללמוד הומאוסטזיס שרירים מבזבז באמצעות מודלים אנושיים, אשר בשל השלכות אתיות, מורכבים בעיקר של תרבויות במבחנה. למרות השימוש הנרחב של ובתאים myogenic אדם (MPCs) ו myoblasts העיקרי myogenesis, יש מידע מוגבל על שימוש תרבויות myoblast העיקרי אדם myotube ללמוד מנגנונים מולקולריים הסדרת היבטים שונים של mus הקשורים לגיללבזבז CLE ו מסייע תיקוף מנגנוני הזדקנות מוצע בשריר מכרסם. שימוש MPCs אדם, העיקרי myoblasts ו myotubes מבודד מאנשים מבוגרים בגילאי, מספק מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של מנגנונים מולקולריים של תהליכים הקשורים צמיחת שרירים, ניוון והתחדשות. כאן אנו מתארים בפרוטרוט פרוטוקול חזק, לא יקר, לשחזור ויעיל עבור הבידוד והתחזוקה של MPCs אדם וצאצאיהם – myoblasts ו myotubes ממדגמים אדם שריר באמצעות עיכול אנזימטי. יתר על כן, קבענו את מספר הקטע שבו myoblasts העיקרי ממבוגר ואנשים בגילאים לעבור הזדקנות ב תרבות חוץ גופייה. לבסוף, אנו מראים את היכולת transfect myoblasts אלה ויכלו לאפיין יכולת השגשוג והתמיינות שלהם ולהציע התאמת לביצוע מחקרים תפקודיים של מנגנונים מולקולריים של myogenesis ושרירים מבזבזים במבחנה. </p>
Disease- ו הקשורות לגיל אובדן הדרגתי של תוצאות הפונקציה ומסת שריר שלד בשברירי, ירידה בחוזק וירידה באיכות החיים של אנשים בגילים. שרירי שלד מהווים כ 40% מסת גוף 1. במהלך ההזדקנות ומחלות, ניוון הדרגתי של myofibers הפרט וצמצום איכות שרירים עקב חדירת שומן סיסטיק מתרחשת 1, 2, 3, 4, 5, 6. לאחרונה, הוצע כי הבדלים ספציפיים מינים בהזדקנות של שרירי השלד להתרחש, במיוחד כי אובדן סיבי השריר המתרחשים מכרסמים, לא יכול להתרחש אצל בני אדם 7. אף על פי כן, סיבי השריר הנותרים של יונקים בגיל מאופיינים רגישות מוגברת נזק והתחדשות לקוי <supclass = "Xref"> 8. תיקון ותחזוקה שריר למבוגרים מתווך על ידי תאי לווין 9, 10. עם פציעה בשריר רמזים רלוונטיים אחרים, תאי לוויין להיות מופעל מתרבים. תת-קבוצה קטנה של התאים חוזרת למצב השקט והשאר מתקדם אל myoblasts (ובתאים myogenic – MPCs). אלה תורמים לתקן של myofiber קיימים 11. הפונקציונליות של תאי לווין קובעת את ההצלחה של התחדשות שריר ושינויים זמינים תא בלווין עם הזדקנות הודגם 12, 13, 14, 15. יתר על כן, תאי לווין מן השריר של בני אדם ומכרסמים ישנים להראות מתג פרופיל תעתיק והקטינו משובי פוטנציאל 16, 17, </sup> 18, 19. תאי לווין של שרירים מעכברים ישנים ובני האדם גם הוכחו לעבור הזדקנות וכתוצאה מכך הפונקציונלית המופחת שלהם 20.
שורת התא הוקמה ביותר המאפשרת המחקר של הומאוסטזיס שריר היא שורת תאים בעכברי C2C12 21. כמות משמעותית של מחקרים השתמשה גם myoblasts העיקרי בעכברים 22. תרבויות אלו הובילו להבנה משמעותית של murine ו myogenesis חוליות וכן התחדשות שריר, ניוון myotube / myofiber, ותהליכים היפרטרופיה המתרחשים במהלך מחלת שריר והזדקנות 23, 24, 25, 26. מאוחר יותר נאלצו כמה קבוצות תיארו באמצעות myoblasts העיקרי האדם ללמוד myogenesis והזדקנות שריר. עם זאת, יש חוסר הסכמה עם regards להבדלים בין myoblasts העיקרי שבודד השריר של מבוגרים ובני אדם בגילים 27, 28, 29, 30, 31. למרות ההבדלים מאופיינים בסביבה המערכתית ומקומית המתרחשת במהלך התפתחות, הזדקנות ומחלות 6, 32, 33, 34, במבחנת תרבויות myoblast ו myotube להישאר הכלים הנגישים ביותר ללימוד מנגנונים מולקולריים הקשורים בהתפתחות שרירים, צמיחה וניוון. בנוסף, מחקרים אלה מספקים לא רק חזקים, אבל גם מהירה יחסית, זולים תפוקה גבוהה בכלי במבחנה. יתר על כן, השלכות אתיות הקשורות מחקרים של שרירי אדם אומרות לניסויים פונקציונליים המעורבים מניפולציות של ביטוי גנים <em>, במבחנת myoblast ו myotube אדם תרבויות נשארות החלופה היחידה העומדת בפני אורגניזמים מודל חוליות.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ניסוי פשוט לבידוד חזק, לא יקר, לשחזור של myoblasts העיקרי, או MPCs, מן השריר של מבוגרים ואנשים בגילאים ולתאר תנאים סטנדרטיים של במבחנת תרבות (איור 1). כפי תרבויות עיקריות מן השריר בדרך כלל מכילות פיברובלסטים בנוסף myoblasts, אנו ממליצים צעד preplating ופתח טוהר משופר ואיכות myoblasts העיקרי. לסיכום, הקמנו פרוטוקול המאפשר בידוד יעיל לשחזור, תרבות מחקרים תפקודיים של MPCs המועשר ופונקציונלי / myoblasts העיקרי מן שרירי שלד של מבוגרים וישישים.
כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה, חזקה, לא יקרה, לשחזור ויעילה של בידוד ובתאי שריר / myoblasts העיקרי מבני אדם בוגר בגילי brevis digitorium פושטים, שוקה קדמית או halluces חוטף שרירים. פרוטוקול זה נועד לאפשר מחקרים באמצעות myoblasts העיקרי אדם מבני אדם מבוגר ומיושן, במיוחד כאשר שיטות מתוחכמות יותר, כגון FACS- או MACS-מיון, אינם אפשריים או לא מעשי.
שיטת הבידוד הציגה בכתב היד הזה לוקחת כ 2 שעות. במהלך בידוד שריר, שריר נשטף ב 70% אתנול כדי למנוע זיהום. לפני האנזימטית דיסוציאציה של השריר, חשוב לחתוך את השריר לחתיכות קטנות אך גלוי, ולהימנע נזק לתאים מ מתייפייף יותר מדי. תוצאות העיכול של דיסוציאציה של myofibers ואת שחרורו של תאי לווין ותאיים מבשר myogenic. במקרה שלנו עבור ~ 20 מ"ג של שרירי השלד, אחד 60 מ"מ(20 ס"מ 2) צלחת פטרי היה שטח הפנים המתאים ביותר בשביל לאסוף את התאים. תאים מצופים על משטח גדול הראו התפשטות מופחתת, ואילו תאים צופה על משטח קטן והראה גדילת מוות של תאי התלכדות.
עם בידוד, התאים היו בתרבית והרחיב על צלחות מכוסי laminin. שימוש משטחים שאינם מצופים נטו להקטין את ההצלחה של הבידוד. מסיבה זו, תאים ניתן לקצור רצוי על משטח מראש צופה ישירות לאחר בידוד. תרבויות פיברובלסטים מועשרים תהיינה דומיננטיות ולא הנגזרות תאי myoblasts אם התאים נקצרים על משטח שאינו מצופה ישירות לאחר בידוד. מלבד laminin, השימוש פתרונות מצורף תאים אחרים כגון Matrigel ריאגנטים מבוססי קולגן יכול לשמש. פתרונות ציפוי עשויים לכלול גורמי גדילה ותרכובות אחרות אשר יקדמו צמיחת תאים, אבל אלה יכולים לשנות את התנהגות תא ולכן את תוצאות הניסוי. במניסיוננו, 10 מיקרוגרם / מיליליטר laminin הוא הריכוז האופטימלי מגיב ציפוי מתאים תאים בלווין מצורף myoblast ושגשוגם כפי שהוא חסר כל גורם גדילה או משלים אחר. יתר על כן, laminin קיים באופן טבעי את lamina הבסיס, מקושר ישירות אל sarcolemma, אשר ממלא תפקיד מפתח מצורף תא לווין וההגירה דרך סיב שרירי השלד.
התוספים של התקשורת והתרבות יכולים להיות גם השפעה מזיקה על ההתנהגות של myoblast העיקרי. לקבוצות גורם כדוגמת צמיחה, כגון FGFs או IGFs, יש תופעות pleiotropic על תרבויות myoblast העיקרי, עם FGF-2 שליטה הוא מוות של תאי mitogenic ומתוכנת תגובה 31. לכן, יש לשלוט תנאי התרבות בקפדנות, במיוחד בגלל ההבדלים בהתנהגות של myoblasts העיקרי שבודד שריר של אנשים מבוגרים בגילאי מאוד צפויים להיות בשל הטוהר of התרבויות ואת הסבירות של פיברובלסטים להתפשט על myoblasts בתרבות במהלך תרבויות לטווח ארוך 35. השתמשנו ציפוי מראש 1 שעות של התאים במהלך הפיצול הראשון על משטח שאינו מצופה כדי להקטין את הזיהום של התרבויות עם פיברובלסטים.
השיטה אנו מתארים מתאימה לבודדים ובתאי myogenic מהשרירים של שני מבוגרים ובני אדם בגילים. התא המבודד מורכב אוכלוסיית myogenic נציג של תאים כפי שצוין על ידי אחוז גבוה של תאי myogenic (ביטוי Myod ומאפייני myogenic דמיינו ידי immunostaining MF20 איורי 1 ו -2) ויכול לשמש מודל במבחנה ללימודים תפקודיים של תהליכים הקשורים הומאוסטזיס שריר.
מחקרים קודמים שאפיינה את הבידוד ההבדלים במאפייני, או היעדרה, של myoblasts העיקרי האדם מןמבוגרים ואנשים בגילאי 6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 3 6, 37, 38. קיומו של MPCs אדם גריאטרי ו / או שאינו פונקציונלי הודגם 6, 20, 22. עם זאת, לא נמצא הבדל בהתנהגות של MPCs אדם מבודדים טרי כן הוכח 27. פרוטוקול שלנו מאפשר בידוד של myoblasts העיקרי שלפחות לשמור פנוטיפ שלהם חלקית, כגון הזדקנות או פוטנציאל שגשוג מופחת של myoblasts העיקרי שבודד שריר של אנשים בגילאי ומתיר שימוש אלהתאים ללימודים תפקודיים של מנגנונים מולקולריים של הומאוסטזיס שריר במהלך 22 הזדקנות.
Myoblasts העיקרי מבודד באמצעות השיטה המתוארת כאן יכול לשמש לא רק עבור מחקרים בידול myogenic אלא גם לחקור שינויים תאיים, כגון שינויים בביטוי הגנים המתרחשים בתאים מבשר אדם myogenic במהלך ההזדקנות. עם זאת, השינויים המתרחשים בתאים במהלך התרבות ממושכת vivo לשעבר צריכים להילקח בחשבון בעת ניתוח שינויים פנוטיפי ו גנוטיפ המתרחשים במהלך ההזדקנות. אנו ממליצים להשתמש תאים טריים מבודדים למטרה זו.
יתר על כן, שיטת תרבות myoblast העיקרי מתוארת כאן מאפשרת רחבה יחסית לתרבות לטווח הארוכה של myoblasts העיקרי אנושי, ובכך תאפשר מחקרים פונקציונליים במבחנה חזקה. הראינו בעבר כי ובתאי myogenic מבודדים באמצעות השיטה שלנו יכולים לשמש הוא פרופיל ביטוי פומחקרי nctional של תהליכים קשורים שריר הזדקנות 22. שיטה זו היא גם החלימה על השרירים של מבוגרים וילדים כאחד מכרסמים ישנים ומאפשרת בידוד של תרבות מועשרת של myoblasts שיכול לשמש פרופיל שינויים גנטיים אפיגנטיים במהלך הזדקנות ומחקרים תפקודיים 22. המגבלות של שיטה זו כוללות את השימוש, במידה זו או אחרת, אוכלוסייה מעורבת של תאים ולא אוכלוסייה טהורה של תאי לווין, אשר ניתן להשיג באמצעות שיטות שפורסמו מתוחכמות יותר 6, 28, 29, 39, 40, 41, 42, 43.
אנו מציגים פרוטוקול פשוט, זולים, לשחזור עבור הבידוד של תאי myoblasts העיקריים ממבוגר ומיושןבני אנוש. מניסיוננו, הזמין, שיטות מתוחכמות יותר של בידוד והתרבות של myoblasts העיקרי האדם (כגון MACS- או FACS-מסודרים תאי הלוויין) הם אידיאליים עבור סוגים מסוימים של מחקרים, כגון אפיון השינויים transcriptomic או proteomic בתאים. עם זאת, שיטות אלה הן יקרות, דורשות לפחות רמה מסוימת של מומחיות, וייתכן להוכיח קשה בשל שיעור השגשוג הנמוך של תרבויות myoblast העיקרי טהורות פיברובלסטים overgrowing myoblasts.
אנו מציגים פרוטוקול לשחזור המאפשר בידוד והתרבות פשוט של myoblasts העיקרי פרט לשימוש מחקרים תפקודיים. בנוסף, אנו מציעים את השימוש של laminin 42 והשימוש המוגבל של bFGF מהווה גורם משמעותי לתרבות מוצלחת 44. כמו כן, אנו מציעים הימנעות הלחץ שנוצר על ידי צנטריפוגה בזמן חלוקת התאים צעד מראש ציפוי אחד במעבר הראשון 45. לסיכום, יש לנומותאם פרוטוקול יעיל עבור בידוד וההתרבות של myoblasts / MPCs העיקרי מהשרירים של מבוגרים ובני אדם בגילאי כי הוא גם החלים על שהרירים מכרסמים ומאפשרים ביטוי ומחקרים תפקודיים של הומאוסטזיס שריר.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/L021668/1), the MRC and Arthritis Research UK as part of the MRC – Arthritis Research UK Centre for Integrated Research into Musculoskeletal Ageing (CIMA) and the Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (097826/Z/11/A). The authors would like to thank Dr Dada Pisconti (University of Liverpool) for her expertise and advice in the isolation of muscle progenitor cells.
60mm Petri dishes | Greiner Bio One | 628160 | Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS. |
Cell culture plates (6 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3516 | Corning Costar cell culture plates. 6 well, flat bottom (Individually wrapped) . |
Cell culture plates (12 wells) | Greiner bio-one | 657 160 | Cellstar Cell culture Multiwell Plates. |
Culture flasks | Greiner Bio One | 690175 (25cm2); 658175 (75cm2). | Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks. |
Standard Disposable Scalpel | Granton | 91310 | Sterile stainless steel blade, pattern: 10. |
Pipettes | Greiner bio-one | 606 180 (5 ml); 607 180 (10 ml); 760 180 (25 ml) | Cellstar Serological Pipettes. |
Pasteur plastic pipettes | Starlab | E1414-0311 | 3.0ml Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped. |
Syringe | BD | 300613 | 20 mL BD eccentric tip syringe. |
0.2 µm filters | Gilson | ALG422A | Sterile Syringe Filters CA 0.2um 33mm Pk50. |
Cell strainers | Fisher Scientific | 11597522 | Cell culture strainer sterile individually packed 70µm polypropylene. |
Collagenase D | Roche | 11088882001 | Collagenase D; ctivity: >0.15 U/mg |
Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: ≥0.5 units/mg solid. |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | Calcium chloride, anhydrous, beads, −10 mesh, ≥99.9% trace metals basis |
Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1mg/mL. |
DMEM-high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose. With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate. |
F-12 media | Gibco | 21765029 | Ham's F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine. |
FGF-b | PetroTech | 100-18B | Recombinant Human Fibroblast Growth Factor-basic. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Fetal Bovine Serum. |
Horse serum (HS) | Sigma-Aldrich | H1270 | Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered. |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered. |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered. |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered. |
TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red. |
DPBS (cell culture) | Sigma-Aldrich | D8537 | Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride. |
PBS (immunostaining) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Phosphate buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4). |
Methanol | Fisher | M/4000/PC17 | Methanol Analytical Reagent Grade |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 for molecular biology. |
anti-MF 20 antibody | DSHB | MF20-c 2ea 211 µg/ml. | MYH1E (MF 20) Mouse mAb. |
anti-MyoD antibody | Cell Signaling Technology | 13812P | MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb. |
anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | Rabbit mAb to Ki67 [SP6]. |
Anti-mouse 488 secondary antibody | Invitrogen | A-11029 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
Anti-rabbit 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
DAPI | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) |
Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | Senescence β-Galactosidase Staining kit. |
DMSO | Sigma-Aldrich | 41639 | Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC). |
Acridine Orange | Sigma-Aldrich | A8097 | Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H2O. |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H2O. |
Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Lipofectamine 2000 Transfection Reagent |
Scramble control for transfections | Qiagen | 1027271 | miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol) |
Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay | Qiagen | 218300 | Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor | Qiagen | 219300 | Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
Megafuge 2.0 R Centrifuge | Heraeus | 75003085 | n/a |
Centrifuge rotor | Heraeus | 3360 | Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm. |
Eclipse Ti-E Inverted Microscope System | Nikon | n/a | Eyepieces: CFI 10x/22; Total magnification: 100x (MF20, Live/dead and Ki67). |
Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10x/25; Total magnification: 100x (Senescence β-Galactosidase Staining). |
Axiovert 25 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: E-PL 10x/20. Total magnification: 100x (bright field). |
Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope | Nikon | n/a | Eyepiece: CFWN 10x/20. Total magnification: 100x (bright field). |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | Hydromount |