制备及文化活动从成年和老年人类骨骼肌成肌前体细胞/成肌细胞主要的

所有涉及本文所述人体组织的实验是由英国利物浦大学，大学医院安特里医院和西南威尔士研究伦理委员会的事先批准（批准号：13 / WA / 0374）和实验是按照良好做法指导意见执行。利物浦大学担任道德赞助这项研究。所有捐助者给知情同意这项研究的招生。肌肉是从孤立的人（BMI <25）：成人：30±2.8岁，年龄：69±5岁。 1.准备文化 文化的涂层表面层粘连蛋白 制备10微克/毫升的层粘连蛋白的在1×DPBS（Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水）的工作溶液。 吸取的层粘连蛋白溶液的最小量以完全覆盖在其上的细胞将要被镀（ 表1）的表面上。孵育ŧ电镀细胞之前他培养皿至少30分钟，在加湿37℃，5％CO 2培养箱。小心处理层粘连蛋白，避免使用旋涡。在DPBS稀释10微克/毫升的层粘连蛋白的工作溶液可以储存在4℃和再使用数次。 使用60毫米（20 cm 2）的培养皿或2个孔在6孔板（2×10 cm 2）的每〜18 – 19毫克骨骼肌到板的细胞（5.50×10 4个细胞的数量）。在任何时候都镀细胞功能研究执行时，细胞计数。 最初从女性患者（30±2.8岁，年龄：69±5岁，BMI <25人）的脚手术（趾短伸肌，胫骨前肌或外展肌halluces）中获得的样品：注意。 酶溶液的制备 准备250毫米氯化钙2有效的解决方案：在10毫升1X DPBS 277毫克的股票氯化钙 。过滤等等lution用0.2微米滤膜和储存在4℃。 制备1.5 U / ml的胶原酶的D，2.4 U / ml的分散酶II的和2.5mM 氯化钙在无血清的DMEM（Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基）（ 表2）的工作溶液。 拌匀并过滤通过0.2微米滤膜进行灭菌的酶溶液。制备酶溶液提前，并冷冻向下（-20℃）中的等分试样以供将来使用。 2.组织消化：机械和酶解在DPBS在样本采集后，肌肉保持在4°C，直到消化。制备2毫升胶原酶分散酶- 氯化钙每18溶液的最小体积- 19毫克的肌肉组织和组织分解之前温热至37℃。 浸入肌肉活检简要地在70％乙醇，用新鲜的DPBS洗涤并放置在新的培养皿的组织用1mL的酶的解。 丢弃尽可能多的纤维化和脂肪组织尽可能快速地而是轻轻撕开肌肉成小，但区分片（约> 0.5， 平方毫米）用无菌剪刀或手术刀（刀片第10号）。 将样品转移到50 mL管中与剩余的1毫升胶原酶分散酶- 的 CaCl 2。 孵育在37℃下将组织高达30 – 40分钟。 10分钟 – 轻轻搅拌筒，每5移动肌肉组织。 外套与媒体的吸移管，以避免释放的细胞到移液器的塑料壁的粘附性。添加2倍体积的无菌生长培养基， 例如，4毫升的DMEM 20％FBS（胎牛血清），1％L-谷氨酰胺和1％P / S（青霉素-链霉素）的，以停止消化。 吸管上下数次用5毫升吸管，以帮助从肌纤维细胞的释放。 注：样品通常被完全由于其体积小分离。 HH但是，如果肌肉的片段仍然存在，使用第二孵育肌肉的剩余部分，用新鲜的酶溶液。 过滤通过70微米的细胞过滤过的50mL锥形管肌肉溶液。通过过滤洗涤与多个媒体和过滤剩余的细胞。 离心在443×g离心5分钟，在室温以沉淀细胞。小心弃上清。 溶解沉淀到F-12介质（咸的F-12营养混合），20％FBS，10％HS（马血清），1％P / S，1％α谷氨酰胺和2.5纳克/ FGF-B中的溶液（重组人碱性成纤维细胞生长因子）。这里，用4毫升媒体为60毫米的培养皿。 3.细胞接种收集预先涂覆有从培养箱（第1.1节）10微克/毫升的层粘连蛋白的培养容器中。 小心地从培养皿去除多余的层粘连蛋白，并避免接触到表面（或它会干扰蛋白质结构）。洗培养皿用DPBS（可选）。 直接镀在层粘连蛋白涂覆的容器中的细胞，并在湿润的37℃，5％CO 2培养箱培养24小时。 可视化明场显微镜（100X总放大倍率）第二天下的细胞。轮小细胞附着在表面，而其余的碎片可以在培养基中可以看出。 媒体改变到有20％FBS，10％HS，1％P / S，1％α谷氨酰胺和2.5纳克/ FGF-B中的溶液补充新鲜的F-12培养基。 4.培养和细胞传代改变介质每2 – 3天，以避免自发尽快分裂细胞作为细胞群是可见的，在显微镜下（100X总放大倍数，例如，在图2中 ，从老年人细胞，通道0，后7天）分化。 在第一通道（P1），介质改变到有20％FBS，10％HS，1％补充高糖DMEMP / S，1％α-谷氨酰胺。避免使用FGF-B从这一点，作为FGF是一种有效的有丝分裂原和重要的因素在培养开始，但是，如果在培养使用较长它可以促进成纤维细胞的过度生长。 对于细胞传代： 删除媒体并用DPBS洗涤细胞两次。 添加0.25％的EDTA胰蛋白酶的最小体积以覆盖细胞的表面上。轻轻摇动，以确保所有的细胞被分离液覆盖，孵育在室温下10秒钟，然后将其删除。 孵育将细胞在增湿的37℃，5％CO 2培养箱3 – 5分钟。轻轻点击和明亮的光学显微镜（100X总放大倍率），这些细胞是圆的，但是从表面没有完全脱落下检查。如果没有变化在细胞中观察到，孵育5更多分钟。 加5生长毫升培养基（高糖DMEM补充有20％FBS，10％HS，1％P / S，1％α-谷氨酰胺）以收集细胞，混合好，转移与新媒体的细胞成T75烧瓶中。洗剩余的细胞重复这一步骤与生长培养基的另外5毫升（10毫升总一个T75烧瓶）中。 到preplate（在第一通道优选），孵育所述细胞在加湿37℃，5％CO 2培养箱40分钟。收集与没有在新的T75烧瓶连接，并培育它们的细胞上清液。这应该充实成肌细胞的文化，因为大部分的成纤维细胞，应在第一瓶已连接。 改变介质每2 – 3天，并尽快分裂细胞1至4，因为它们达到的最大收率70％汇合。 对于分化，一旦细胞达到70％ – 80％汇合，改变培养基分化培养基（DM）：用2％HS，1％P / S，1％的α-谷氨酰胺补充高糖DMEM。 7天取决于成肌细胞C的质量和纯度 – 细胞应5内有所区别ulture。 5.转染协议种子50,000个细胞/孔在MF 20，衰老和存活测定一个12孔板。培养细胞在盖玻片上或涂上层粘连蛋白一盘。对于Ki67的染色，种子25,000个细胞/孔在12孔板中。 对于转染，按照使用5微升转染试剂，100nM的控制微小RNA模仿或抑制剂，为100nM微RNA模拟物或每孔为100nM微RNA抑制剂的制造商的程序，用1毫升的总体积。 切换到分化培养基6 h后（高糖DMEM补充了2％HS，1％P / S，1％的α-谷氨酰胺）。对于增殖实验，将细胞染色2天转染后;对于衰老，转染后7天;和MF20染色，染后七天。 6.免疫染色的细胞 Ki67的，MyoD的和MF 20染色准备块1（10％HS和在PBS中的0.1％的Triton-X）和块2（10％HS和0.05％的Triton-X的PBS中）的解决方案。使用每孔试剂500μL，对于12孔板中。 注：执行使用用于孵育步骤摇动以下步骤。 从细胞中取出介质。 用PBS冲洗细胞。 固定用冷甲醇将细胞上的摇杆10分钟。 从细胞中除去甲醇，并用PBS漂洗3次，每次5分钟。 在RT上的摇杆添加块1溶液孵育细胞1小时。 新增主要抗体溶液：用于Ki67的染色，用兔单克隆抗体来Ki67的（1：1000稀释块2）;为的MyoD，使用MYOD1（D8G3）XP的兔单克隆抗体（1：100稀释在方框2）;对于MF 20染色，使用MYH1E（MF 20）初级抗体（DSHB，1：1000稀释块2）。 孵育细胞1小时（RT）到O / N（4℃）上的摇杆的第一抗体。 收集主AB（它可以如STO重复使用几次红色在4°C）。 冲洗细胞，用PBS，每次5分钟的3倍。 添加适当的二级抗体：对于Ki67表达或MyoD的染色，山羊抗兔IgG（H + L）次级抗体，的Alexa Fluor 488缀合物（1：1,000稀释在PBS中）;为MF 20染色，山羊抗小鼠IgG（H + L）次级抗体，的Alexa Fluor 488缀合物（1：1,000稀释在PBS中）。 包裹含有细胞的板孵育二级抗体在黑暗中2小时就在RT摇杆。 冲洗细胞，用PBS 3倍，每次5分钟。 加的DAPI溶液（1：1,000稀释在PBS中）到细胞上，并培育上在RT摇杆5 – 10分钟。 冲洗细胞，用PBS 3倍，每次5分钟。 加入1毫升新鲜的PBS。 安装在盖玻片细胞在安装解决方案或密封含有细胞的PBS用封口膜，以避免蒸发板。 保存在4℃。 可视化与细胞荧光显微镜尽快（不迟于2周）。 生存试验 从细胞中取出介质。 冲洗在PBS中的细胞。 添加1：1,000溴化乙锭和1：在PBS中稀释1000吖啶橙。 注意：注意，健康和安全法规中工作 – 溴化乙锭是一种致癌物质。 包含在染色溶液中的细胞的板，并在室温孵育在摇臂5分钟。 采取与荧光显微镜下细胞的图像：绿色通道，吖啶橙;红色通道为溴化乙锭。