SNARE-medieret Fusion af Single proteoliposomer med bundet understøttede dobbeltlag i en Mikrofluid Flow Cell Overvåget af Polariseret TIRF Microscopy

Membrane fusion er en universel biologisk proces kræves for intracellulær handel med lipider og proteiner, sekretion, gødskning, udvikling, og indhyllet virus indrejse i værtsorganismer ^1-3. For de fleste intracellulær fusion reaktioner, herunder frigivelse af hormoner og neurotransmittere via exocytose, er energien til at smelte to lipid-dobbeltlag, som dannelsen af en fire-helix bundt mellem beslægtet opløseligt N-ethylmaleimid-følsomme faktor vedhæftet protein receptor (SNARE) proteiner, forankret i vesiklen (v-SNARE) og målmembranen (t-SNARE) ^4. Synaptisk vesikel exocytose er den mest stramt reguleret fusionsreaktion og forekommer inden for et millisekund efter ankomsten af et aktionspotentiale ^1,4,5. Fusionen pore, den oprindelige forbindelse mellem de to fusing rum, kan flimre åbne og lukkede flere gange, før genlukning eller udvide irreversibelt ^5-7. De tidligere resultateri forbigående, "kys & run" fusion, mens sidstnævnte fører til fuld fusion. Faktorer for balancen mellem disse to former for fusion og mekanismer, der regulerer pore flimmer er ikke godt forstået ^5,8.

SNARE proteiner er nødvendige for exocytose; synaptisk vesikel fusion afskaffes ved spaltning af snarer ved nervegifte ^9. Bulk fusionseksperimenter med små unilamelblærer (SUV'er) viste, at Snares ikke kræves kun, men også tilstrækkelig til at drive membran fusion ^10. I denne bulk-assay SUV'er rekonstitueret med v-Snares (v-SUV) blev doteret med fluorescerende phospholipider (N – (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazo-4-yl) -phosphoethanolamine (NBD-PE) og ( N -. (lissamin rhodamin B sulfonyl) -phosphoethanolamine (LR-PE) og blandes med umærkede vesikler indeholdende t-snarer (t-SUV) Oprindelig fluorescensen af NBD-PE i V-SUV'er standses ved Forster-resonansenergioverførsel (FRET ) til LR-PE. Som labELED v-SUV'er fuse med umærkede t-SUV'er, er fluoroforen overflade tætheden i den nu kombineret membran reduceret, og den deraf følgende stigning i NBD-PE fluorescens rapporterer omfanget af lipid blanding ^10. Da hovedparten assay er nem at sætte op og analysere, har det været almindeligt anvendt til at undersøge mekanismerne for SNARE-medieret fusion ^10-14. Det har imidlertid adskillige begrænsninger, såsom lav følsomhed og dårlig tidsopløsning. Vigtigst er det, som et ensemble måling, det gennemsnit resultaterne for alle hændelser gør forskelsbehandling mellem docking og fusion, samt påvisning af hemifusion mellemprodukter vanskelig.

Gennem det seneste årti flere grupper, herunder vores, har udviklet nye analyser for at overvåge fusion begivenheder på enkelt vesikel niveauet ^15-27. Ha og kolleger brugte v-SUV'er tøjret på en overflade og overvåget deres fusion med gratis t-SUV'er ^18,19. Lipidblanding blev overvåget ved anvendelse FRET mellem et par lipid-bundne fluoroforer emsengs i v- og t-SUV'er henholdsvis hjælp total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi ^18. Senere Brunger laboratorium brugt en enkelt lipid-label arter sammen med en indhold markør til samtidig påvisning af lipid og indhold blande ^20,28. Både lipid og indholdet markører blev medtaget ved høje, selv-quenching koncentrationer; fusion med umærkede SUV'er resulterede i fluorescens-dequenching ^20,28.

Andre har smeltet v-SUV'er til plane dobbeltlag rekonstitueret med t-Snares ^{15-17,21-27,29.} Den plane geometri af målet (t-SNARE holdige) dobbeltlaget bedre efterligner den fysiologiske fusionsprocessen af ​​små, meget krumme vesikler med en flad plasmamembranen. Den Steinem beskæftigede koncernen pore-spænder membraner rekonstitueret med t-Snares, suspenderet over en porøs silicium nitrid substrat og opdaget fusion med individuelle v-SUVs bruger konfokal laser scanning mikroskopi ^23. Andre fbrugte v-SUV'er til plane dobbeltlag rekonstitueret med t-Snares, støttet på et glas substrat ^{15-17,21,22,24-27,29.} Den store fordel ved at anvende understøttede dobbeltlag (SBLs) er den TIRF mikroskopi kan anvendes til at detektere docking og fusionsbegivenheder med fremragende signal-til-støj-forhold og uden interferens fra fri V-SUV'er, selv om anvendelse af mikrofluidik også tilvejebringer single-event opløsning ved brug standard fjernfelts epifluorescens mikroskopi ^24.

En stor bekymring er, om og hvordan substrat-dobbeltlag-interaktioner påvirker understøttet dobbeltlag kvalitet og fusionsprocessen. Tidlig arbejde gjort brug af plane SBLs, der blev støttet direkte på et glas eller kvarts substrat ^15-17. Disse SBLs blev foretaget ved adsorption, fyldt, spredning og fusion af t-SUV membraner på substratet. Det blev snart indså dog, at udelade en vigtig t-SNARE komponent, SNAP25, fra SBLs fremstillet på denne måde resulterede i v-SUV docking og fusion kinetik indistinguisHable fra dem, der opnås ved hjælp af den fuldstændige t-snarer ^17. Fordi SNAP25 er absolut nødvendig for fusion in vivo ^30,31, blev den fysiologiske relevans af disse tidlige forsøg sat spørgsmålstegn. Tamm gruppe overvandt denne udfordring ved at bruge bedre kontrolleret understøttet dobbeltlag dannelse ^21. Det bruges Langmuir-Blodgett deposition for proteinfrit første blad af SBL, efterfulgt af fusion af denne monolag med t-SUV'er ^21. Dette resulterede i SNAP25-afhængig fusion.

At undgå potentielle artefakter forbundet med et dobbeltlag direkte understøttet på et glassubstrat uden behov for anvendelse af Langmuir-Blodgett metoder, Karatekin et al. Introducerede en blød, hydratiseret poly (ethylenglycol) (PEG) stødpude mellem dobbeltlaget og substratet ^24. Denne ændring resulterede også i SNAP25-afhængig fusion ^24. Dobbeltlag polstret på en blød polymerlag havde været kendt til bedre bevare transmembraneprotein mobilitet og funktion ^32, og var blevet brugt i fusion studier med virus ^33. Desuden PEGylerede dobbeltlag synes at bevare en vis evne til selv at helbrede og er meget robust ^34,35. Først en brøkdel af kommercielt tilgængelige, lipid-bundne PEG-kæder med i t-SUV membran. Når disse t-SUV'er briste og danne et plant dobbeltlag på et glassubstrat, en PEG børste dækker både foldere af den plane dobbeltlaget. Fordi plane dobbeltlagsformation drives af adhæsion af PEG-kæderne omgivende t-SUV'er på hydrofile glasoverflade, liposom sprængning og plane dobbeltlagsformation er relativt ufølsomme for lipidsammensætningen anvendt. Men når store mængder af kolesterol er inkluderet, hvilket øger de kohæsive egenskaber af SUV'er, SUV'er kan ikke briste spontant. Hvis dette er tilfældet, kan osmotisk chok eller divalente ioner at medvirke til at plane dobbeltlagsformation ^25.

Som nævnt ovenfor i denne approach en PEG børste dækker begge sider af plane, støttet dobbeltlaget. Børsten overfor mikrofluid strømningskanal med til at forhindre ikke-specifik adhæsion af indkommende v-SUV'er, som også normalt dækket med en PEG lag. Dannelse af V- og t-SNARE komplekser starter fra membranen-distale N-terminaler og fortsætter i etaper mod den membran-proksimale domæner ^36. For v-SUV'er til at interagere med T-SBL, den v- og t-SNARE N-terminaler behov for at rage op over PEG børster, hvilket synes at være tilfældet under betingelserne for assayet. Børste højde kan tilpasses til at studere andre end snarer proteiner ved at variere tætheden af PEGylerede lipider og PEG kædelængde ^37,38. En anden fordel ved PEG børster dækker de proksimale overflader af fusing dobbeltlag er, at de efterligner de overfyldte miljø i biologiske membraner, som er pakket med 30.000-40.000 integrale membranproteiner per kvadrat mikron ^39. Ligesom PEG-kæderne i dette assay repulsive protein lag, der dækker biologiske membraner skal skubbes til side for at give mulighed for kontakt mellem de to phospholipiddobbeltlag til fusion at forekomme.

Mikrofluid strømningskanaler anvendes i dette assay, da de tilbyder unikke fordele. Først mikrofluid flow muliggør mere ensartet afsætning af T-SUV'er til at sprede og sikringen til dannelse af t-SBL. For det andet, den lille kanal volumen (<1 ul) minimerer forbruget prøve. Tredje de små rumfang, der kræves tillade hele forsøget kan udføres under konstant flow. Flow fjerner svagt, formentlig ikke-specifikt, klæbes v-SUV'er fra SBL ^16. Det opretholder også en konstant tæthed af v-SUV'er over t-SBL, forenkling kinetisk analyse ^17. Endelig er forankret vesikler let skelnes fra frie dem båret af strømmen ^25. Fjerde, flere mikrofluidkanaler kan bruges på samme dækglas, hvert sondering en anden tilstand. Dette tillader sammenligning af vilkår during samme eksperimentelle løb. En lignende fremgangsmåde er blevet anvendt af van Oijen gruppe til at studere fusion mellem influenzavirus og polstrede SBLs ^33.

I TIRF mikroskopi, den eksponentielle henfald af flygtige felt (med en faldekonstant ~ 100 nm) begrænser fluorescens excitation til de molekyler, der er i meget tæt nærhed af glasset-buffer interface. Dette minimerer bidrag af fluorescerende molekyler, som er længere væk, øger signal-til-støj-forhold, og tillader enkelt molekyle følsomhed med eksponering ramme tider med 10-40 msek. Den kortvarigt felt fører også til et signal stigning på fusion: som den mærkede overførsel lipider fra SUV til SBL, de befinder sig i gennemsnit i en stærkere excitation felt. Denne stigning i fluorescens er stærkere for større liposomer.

Hvis der anvendes polariseret lys til at generere den flygtige felt, yderligere effekter bidrage til ændringer i fluorescens ved T-ransfer etiketter fra SUV til SBL. Nogle lipid farvestoffer har en overgang dipol orienteret med en foretrukken gennemsnitlig vinkel i forhold til dobbeltlaget, hvori de er indlejret. Dette skaber en forskel i mængden af fluorescens, der udsendes af de fluoroforer, når de er i SUV versus SBL, eftersom det polariserede stråle vil excitere farvestoffer i de to membraner forskelligt. For førstnævnte vil excitation stråle interagere med overgangseffekter dipoler orienteret omkring den sfæriske SUV, mens der for sidstnævnte, vil dipol orienteringer begrænses af den flade SBL geometri. For eksempel, når s-polariseret indfaldende lys (polariseret vinkelret på planet af forekomst) anvendes, magnetisering er mere effektiv, når farvestoffet er i SBL end i SUV til et lipid farvestof overgang dipol orienteret parallelt med membranen ^29,40 (som den i Dii eller har ^41-43). En SUV doteret med sådan en fluorofor vises dim når den kører onto SBL (figur 7, Representat ive Resultater). Som en fusion pore åbner og forbinder SUV og SBL membraner, fluorescerende prober diffundere ind i SBL og bliver mere tilbøjelige til at blive exciteret af s-polariseret kortvarigt felt ^25,27,29. Følgelig fluorescenssignalet integreret omkring fusionsstedet øges kraftigt under overførsel farvestof fra SUV ind SBL ²⁷ (figur 3 og figur 7). En yderligere faktor, der bidrager til at signalere ændringer, som ledsager fusion dequenching af fluorescerende mærker, som de er fortyndet, når de overføres til SBL. Bidraget fra dequenching er sædvanligvis mindre sammenlignet med flygtige felt henfald og polarisationseffekter i assayet beskrevet her, fordi kun en lille brøkdel ( ) Af lipiderne er mærket.

Signalet stigning ved fusion kan udnyttes til at udlede fusion poreegenskaberne ved at sammenligne den tid,1 "src =" / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>, der kræves for et lipid at undslippe gennem en pore, der er frit gennemtrængelig for lipider til den aktuelle udgivelse tid, . Hvis de to tidsskalaer er sammenlignelige, ville det konkluderes, at pore præsenterer lidt modstand til lipid flow. Men hvis den faktiske frigivelse tid er betydeligt længere end den tid, for diffusion begrænset udgivelse, ville dette betyde en proces, såsom pore flimrende, forsinker lipid frigivelse. Udbredelsen-begrænset release tid, , Afhænger af størrelsen af ​​fusing liposom og lipid-diffusivitet; sin vurdering kræver disse to parametre, der skal kvantificeres. Den enkelt molekyle sensitivitet tillader lipid diffusivitet skal måles ved at spore flere enkelt lipid fluoroforer efter deres løsladelse i SBL for hver fusion begivenhed ^26. Størrelsen af ​​hver fusing vesikelkan estimeres ²⁷ ved at kombinere (i) intensiteten af en enkelt lipid farvestof, (ii) ændringen i den totale fluorescens omkring en docking websted efter alle fluoroforer overføres til SBL ved fusion, (iii) den kendte mærkning tæthed af SUV lipider, og (iv) det areal pr lipid. For mange fusionshændelser blev de faktiske lipid release gange fundet at være meget langsommere end forventet ved diffusion-controlled release ^27, som blev bemærket tidligere antagelse ensartet SUV størrelse ^44. Antages retardering af lipid frigivelse skyldes pore flimrende, en kvantitativ model tillader estimering af "pore åbenhed", den del af tiden pore forbliver åben under fusion ^27.

Når praktisk, er det vigtigt at teste fusion mekanismer ved hjælp af både lipid og opløselige indhold etiketter. For eksempel kunne lipid frigivelse forsinkes af andre end pore flimrende processer, såsom begrænsning af lipid diffusion af SNARE proteiner, surround than pore. Hvis dette var tilfældet, så slip af indhold vil gå forud frigivelse af lipid etiketter, forudsat pore er stor nok til at tillade passage af opløselige sonder. En mere grundlæggende fejl i tilgangen kunne være i den antagelse, at overførslen af ​​mærkede lipider til SBL sker gennem en smal fusion pore forbinder SBL til en vesikel, der har stort set bevaret sin pre-fusion form. Lipid overførsel til SBL kan også skyldes en hurtig udvidelse af den fusion pore med en samtidig, ekstremt hurtige sammenbrud af SUV i SBL membran, som tidligere foreslået baseret på lipid release data alene ^29. Overvågning både lipid og indholdet frigiver samtidigt, blev det konstateret, at mange porer lukkes igen efter udløsning alle deres lipid etiketter, men bevaret nogle af deres opløselige last ^27. Dette indikerer, at i det mindste har nogle liposomer ikke skjule i SBL efter fusion, og at lipid farveoverføringsinhiberende ind SBL sker gennem en fusion pore. Derudover lipid og indhold udgivelse forekom samtidigt ^27, hvilket gør det usandsynligt, at forsinkelse af lipid frigivelse skyldtes hindring for, lipid diffusion af SNARE proteiner omgiver pore ^45.

En SUV-SBL fusion protokol, der ikke overvåger opløselige indhold udgivelse er tidligere blevet udgivet af Karatekin og Rothman ^25. Her er mere den seneste udvikling inkluderet, nemlig samtidig overvågning af lipid og indhold frigivelse og estimering af SUV, lipid, og fusion pore egenskaber ^27. Protokollen begynder med instruktioner til at forberede mikrofluide celler, lavet af limning en poly (dimethylsiloxan) (PDMS) elastomer blok indeholder riller med et dækglas ^25. Dernæst udarbejdelse af v-SUV'er med både lipid og indhold markører forklaret. Afdeling 4 og 5 give anvisninger til at samle de mikrofluide celler, der danner SBLs in situ og kontrol for fejl og flydende, indførelse af vSUVS ind flowcellerne og detektion af fusionsbegivenheder. Afsnit 6 indeholder instruktioner til dataanalyse.