Summary

SNARE-опосредованного Слияние единого Протеолипосомы с ПРИВЯЗНЫХ Поддержанные Бислои в ячейке Микрожидкостных Flow, отслеживаемых поляризованной TIRF микроскопией

Published: August 24, 2016
doi:

Summary

Здесь мы приводим протокол для обнаружения одиночных, SNARE-опосредованного слияния событий между липосомами и поддерживаемых бислоями в микроканалов с помощью поляризованных TIRFM, с одной молекулой чувствительностью и ~ 15 мс временным разрешением. Липидный и растворимым высвобождением груза могут быть обнаружены одновременно. Размер липосом, липидный температуропроводности, слитый пор свойства измеряются.

Abstract

В повсеместного процессе слияния мембран открытие поры слияния устанавливает первое соединение между двумя ранее отдельными отсеками. Во время нейромедиатора или выделения гормона через экзоцитоза, слитый пор может скоротечно открываются и закрываются неоднократно, регулирующие кинетика высвобождения груза. Динамика Поры также определить режим рециркуляции везикул; необратимые результаты распечатывания в переходном, "целуют и беги" фьюжн, в то время как дилатация приводит к полному слиянию. Чтобы лучше понять , какие факторы определяют динамику пор, мы разработали анализ для контроля за слияние мембран с использованием поляризованного полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопия с одной молекулой чувствительностью и ~ 15 мс разрешение времени в биохимически хорошо определены в пробирке системы. Слияние флуоресцентно меченных небольшие однослойные везикулы, содержащие V-SNARE белки (V-SUV) с плоской двуслойной подшипник Т-силков, нанесенный на мягкую полимерную подушке (трет-SBL, т при поддержке бислой), Находится под контролем. Анализ использует микроканалов потоков, которые обеспечивают минимальное потребление пробы при подаче постоянной плотности внедорожников. Эксплуатируя быстрое усиление сигнала при передаче липидных меток от SUV к SBL в процессе слияния, кинетика переноса липидного красителя контролируется. Чувствительность TIRF микроскопии позволяет отслеживать одиночные флуоресцентные липидные метки, из которых липидный коэффициент диффузии и размер SUV может быть выведенные для каждого события слияния. Жировые время высвобождения красителя может быть намного больше, чем ожидалось, для беспрепятственного прохождения через постоянно открытые поры. Используя модель, которая предполагает замедление высвобождения липидов из-за поры мерцает, пористую "открытости", доля времени пор остается открытым во время сварки, может быть оценена. Растворимый маркер может быть воплощен в SUVs для одновременного мониторинга липидного и растворимого высвобождения груза. Такие измерения показывают некоторые поры могут запечатать после потери доли растворимого груза.

Introduction

Мембранные слияние является универсальным биологическим процессом , необходимый для внутриклеточного транспорта липидов и белков, секреции, оплодотворение, развитие и окутал запись вируса в организме – хозяине 1-3. Для большинства реакций внутриклеточного синтеза , включая высвобождение гормонов и нейротрансмиттеров через экзоцитоза, энергия для сплавления двух бислоев обеспечивается образованием четырех-винтового пучка между родственными растворимы N-этилмалеимид-чувствительных рецепторов прикрепление белок фактора (SNARE) белки, закрепленные в везикулы (V-SNARE) и целевой мембрана (трет-SNARE) 4, соответственно. Synaptic пузырек экзоцитоза является наиболее жестко регулируется термоядерная реакция и происходит в течение миллисекунды после прихода к потенциала действия 1,4,5. Слияние пор, начальное соединение между двумя дублирующих отсеков, могут мерцать открытые и закрытые несколько раз , прежде чем опечатывания или расширения необратимо 5-7. Прежние результатыв переходном процессе, "поцелуй и запустить" слияние, в то время последних приводит к полному слиянию. Факторы , определяющие баланс между этими двумя режимами слияния и механизмов , регулирующих пор мелькать недостаточно хорошо изучены 5,8.

SNARE белки необходимы для экзоцитоза; синаптической слияние везикул упразднены при расщеплении SNAREs нейротоксинами 9. Массовые эксперименты с использованием слитых небольшие однослойные везикулы (SUV) показал , что SNAREs не только необходимо, но и достаточно , чтобы диск слияние мембран 10. В этом объемном анализе внедорожников восстанавливали с треугольным SNAREs (V-SUV) легировались флуоресцентных фосфолипидов (N – (7-нитро-2-1,3-benzoxadiazol-4-ил) -phosphoethanolamine (НБД-РЕ) и ( N -. (лиссамин родамина B сульфонил) -phosphoethanolamine (LR-PE) и смешивают с немеченых везикул , содержащих трет-SNAREs (T-SUV) Первоначально флуоресценции NBD-PE в V-внедорожников гасят Форстера резонансного переноса энергии (FRET ) для LR-PE. в лабораторииeled V-внедорожников сливаться с немеченых т-внедорожников, плотность флуорофор поверхности в объединяемых теперь мембраны уменьшается , и в результате увеличения НБД-PE флуоресценции сообщает степень липидного смешивания 10. По мере того как основная часть анализа легко настроить и анализировать, он широко используется для изучения механизмов SNARE-опосредованного слияния 10-14. Тем не менее, он имеет ряд недостатков, таких как низкая чувствительность и низким разрешением времени. Самое главное, как совокупность измерений, она составляет в среднем результаты по всем событиям, делающих дискриминацию между стыковке и фьюжн, а также обнаружение hemifusion промежуточных сложных.

За последнее десятилетие несколько групп, в том числе у нас, разработали новые анализы для мониторинга слитые событий на одном уровне везикул 15-27. Ха и его коллеги использовали V-внедорожники ПРИВЯЗНЫХ на поверхность и контролировать их слияние с бесплатными т-внедорожников 18,19. Липидный смешивание контролировали с помощью FRET между парой липидных переплете флуорофоров EMутопленным в v- и Т-внедорожников, соответственно, с использованием полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопии 18. Позже лаборатория Brunger использовали один вид липидами этикетки вместе с маркером содержание для одновременного определения липидов и содержание смешивания 20,28. Оба липида и маркеры содержание были включены при высоких, самогасящихся концентрации; слияние с немеченых внедорожников привело к флуоресценции dequenching 20,28.

Другие слиты V-внедорожников для плоских двухслойных воссозданных с трет-SNAREs 15-17,21-27,29. Плоская геометрия мишени (трет-SNARE, содержащий) двухслойная лучше имитирует физиологический процесс слияния небольших, высоко загнутыми везикул с плоской мембраной плазмы. Группа Стеинем использовали поры мембраны остовного реконструированные с трет-SNAREs, подвешенные над пористой подложке из нитрида кремния и обнаружено слияние с отдельными клиновых внедорожников с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии 23. Другие Fб клиновые внедорожников в планарный бислоями восстанавливали трет-SNAREs, нанесенный на стеклянную подложку 15-17,21,22,24-27,29. Большим преимуществом использования поддерживаемых бислоя (SBLs) является то, что TIRF микроскопия может быть использована для обнаружения стыковки и фьюжн события с отличным отношением сигнал-шум и без помех со стороны свободных v-внедорожников, хотя использование микрофлюидики также обеспечивает разрешение одного события, используя стандарт дальнего поля эпифлуоресцентной микроскопии 24.

Одной из основных проблем является, влияют ли и как субстрат-двухслойная взаимодействие поддерживается качество двухслойную и процесс сварки. Ранние работы использовали плоских SBLs, непосредственно нанесенных на стеклянную или кварцевую подложку 15-17. Эти SBLs были сделаны с помощью адсорбции, распирает, распространение и слияние T-SUV мембраны на подложке. Вскоре стало ясно, однако, что опуская ключевой компонент трет-силки, SNAP-25, из SBLs, полученных таким образом, привело к v-SUV стыковки и слияния кинетики indistinguisHable от полученных с использованием полного трет-SNAREs 17. Поскольку SNAP-25 абсолютно необходим для синтеза в естественных условиях 30,31, физиологическая значимость этих ранних попыток была поставлена ​​под сомнение. Группа Тамма преодолели эту проблему, используя более эффективный контроль при поддержке формирования двухслойную 21. Он использовал осаждение пленок Ленгмюра-Блоджетт для безбелковом первой листке SBL, с последующим слиянием этого монослоя с Т-21 внедорожников. Это привело к SNAP-25-зависимого синтеза.

Для того, чтобы избежать возможных артефактов , связанных с бислой поддерживается непосредственно на стеклянной подложке без необходимости использования методов Ленгмюра-Блоджетт, Karatekin и др. Ввели мягкую, гидратированный поли (этиленгликоль) (ПЭГ) подушку между бислой и подложкой 24. Эта модификация также привело к SNAP-25-зависимого слияния 24. Бислои подкладкой на мягком полимерном слое было известно лучше сохранить трансмембранныйподвижность белка и функции 32, и были использованы в слитых исследованиях с вирусами 33. Кроме того, ПЭГилированные двухслойные , кажется, сохраняют некоторую способность к самовосстановление и являются очень прочными 34,35. Во-первых, часть коммерчески доступных, липидные-сшитый цепей ПЭГ включены в T-SUV мембраны. Когда эти Т-внедорожники лопаются и образуют плоскую бислой на стеклянной подложке, щетка ПЭГ охватывает как листовки плоского бислой. Поскольку образование планарных бислой обусловлена ​​адгезией цепей ПЭГ, окружающих т-внедорожников на гидрофильной поверхности стекла, липосомами разрывной и образование планарных бислой относительно нечувствительны к липидной композиции, используемой. Однако, когда большое количество холестерина включены, увеличивая липких свойства внедорожников, внедорожники не могут лопнуть спонтанно. Если это так, осмотический ионы ударные или двухвалентные могут быть использованы , чтобы помочь образованию двухслойных планарный 25.

Как упоминалось выше, в этом аргах щетка ПЭГ охватывает обе стороны плоской, поддерживается бислой. Щетки перед каналом микрожидкостных потока помогает предотвратить неспецифическую адгезию входящих v-внедорожников, которые также, как правило, покрыты слоем PEG. Формирование V- и T-SNARE комплексов начинается с мембранно-дистальный N-концах и протекает в стадии по отношению к мембране проксимальных доменов 36. Для клиновых внедорожников взаимодействовать с трет-SBL, в v- и трет-SNARE N-концы необходимости выступать над щетками PEG, который, кажется, дело в условиях анализа. Высота щетки может быть адаптирована для изучения отличных SNAREs белков путем варьирования плотности пегилированного липидов и длину 37,38 ПЭГ – цепи. Еще одно преимущество щеток PEG , охватывающих проксимальные поверхности клеевой бислоев, что они имитируют переполненном окружающую среду биологических мембран , которые упакованы с 30000-40000 интегральными мембранными белками на квадратный микрон 39. Так же, как и цепей ПЭГ в этом анализе Республики Корlsive белковый слой, покрывающий биологические мембраны должен быть выдвинут в сторону, чтобы обеспечить контакт между двумя фосфолипидных бислоев для слияния, чтобы произойти.

Микрожидком проточные каналы используются в данном анализе, так как они предлагают уникальные преимущества. Во-первых, Микрожидкостных поток обеспечивает более равномерное осаждение Т-внедорожников для распространения и предохранитель, чтобы сформировать Т-SBL. Во-вторых, малый объем канала (<1 мкл) сводит к минимуму потребление пробы. В-третьих, малые объемы, необходимые позволяют весь эксперимент будет проводиться под постоянным потоком. Flow удаляет слабо, по- видимому , неспецифически, прилипшие V-внедорожники от SBL 16. Он также поддерживает постоянную плотность клиновых внедорожников выше трет-SBL, упрощающих кинетический анализ 17. И, наконец, стыковка везикулы легко отличить от свободных , переносимых потоком 25. В-четвертых, несколько микроканалов могут быть использованы в той же покровным, каждый зондировании другое состояние. Это позволяет проводить сравнение условий Дуринг один и тот же экспериментальный прогон. Аналогичный подход был использован группой ван Oijen изучить слияние между вирусом гриппа и уютными SBLs 33.

В TIRF микроскопии, экспоненциальный распад исчезающего поля (с постоянной распада ~ 100 нм) ограничивает возбуждения флуоресценции тех молекул, которые находятся в непосредственной близости от поверхности раздела стекла и буфера. Это сводит к минимуму вклад флуоресцентных молекул, которые еще дальше, увеличивает отношение сигнал-шум и позволяет одиночной молекулы чувствительности с временем экспозиции кадра 10-40 мс. Затухающих поле также приводит к увеличению сигнала после слияния: в качестве меченого переноса липидов из джипа в SBL, они оказываются, в среднем, в более сильном поле возбуждения. Это увеличение флуоресценции сильнее для больших липосом.

Если поляризованный свет используется для генерации эванесцентной поля, дополнительные эффекты способствуют изменения флуоресценции при Тransfer этикеток из внедорожника в SBL. Некоторые липидные красители имеют дипольный ориентированный с предпочтительным средним углом по отношению к бислой, в котором они включены. Это создает разницу в количестве флуоресценции , испускаемой флуорофоров , когда они находятся в SUV по отношению к SBL, так как поляризованный пучок будет возбуждать красители в двух мембран по- разному. Для первого пучка возбуждения будет взаимодействовать с переходной диполей, ориентированных вокруг сферического SUV, в то время как для последних, ориентации диполей будет ограничена плоской геометрией SBL. Например, при использовании S-поляризованный падающий свет (поляризованный по нормали к плоскости падения), возбуждение является более эффективным , когда краситель находится в SBL , чем в SUV для липидного красителя дипольных ориентированной параллельно мембране 29,40 (как , например, из DiI или Оказалась 41-43). Внедорожник , легированного с такой флуорофора тускнеет , когда он доки на SBL (рисунок 7, предст Результаты ив). Как слитый отверстие открывается и соединяет джипа и SBL мембран, флуоресцентные зонды диффундировать в SBL и стать более вероятно, будут возбуждаться S-поляризованный затухающих поле 25,27,29. Следовательно, сигнал флуоресценции интегрированы вокруг зоны сварки резко возрастает во время переноса красителя из джипа в SBL 27 (рисунок 3 и рисунок 7). Дополнительным фактором, который вносит свой вклад в сигнал изменения, которые сопровождают слияние dequenching флуоресцентных меток, поскольку они разбавляются при передаче в SBL. Вклад dequenching, как правило, незначительны по сравнению с исчезающим полем распада и поляризационных эффектов в анализе, описанном здесь, потому что лишь небольшая часть ( Уравнение 1 ) Липидов, помечены.

Увеличение сигнала при слиянии могут быть использованы вывести свойства поры слияния путем сравнения времени,1 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>, необходимое для липидный бежать через поры, которая свободно проницаема для липидов к фактическому времени выпуска, Уравнение 1 , Если два шкалы времени сопоставимы, было бы сделать вывод о том, что пора представляет небольшое сопротивление потоку липидов. Тем не менее, если фактическое время высвобождения значительно больше, чем время для диффузионного ограниченного выпуска, это будет указывать на процесс, такие как поры мерцанием, замедляющие высвобождение липидов. Диффузии ограниченного времени выпуска, Уравнение 1 , Зависит от размера плавящимся липосом и липидный-диффузивности; его оценка требует эти два параметра должны быть определены количественно. Одна молекула чувствительность анализа позволяет липидный коэффициент диффузии измеряется путем отслеживания нескольких одного липидные флуорофоры после их высвобождения в SBL для каждого слитого события 26. Размер каждого сплавленных везикулыможно оценить 27 путем объединения (I) интенсивность одного липидного красителя (II) изменение общей флуоресценции вокруг док – сайта после того, как все флуорофоры переносятся в SBL при слиянии, (III) известной плотности маркировки внедорожника липиды, и (IV), область на липида. Для многих слитых событий, были найдены фактическое время высвобождения липидов, гораздо медленнее , чем ожидалось диффузионной-регулируемого высвобождения 27, как было отмечено ранее в предположении унифицированный размер SUV 44. Предполагая , что замедление высвобождения липидов из – за пор мерцает, количественная модель позволяет оценить "открытость пор", доля времени пор остается открытым во время плавления 27.

Всякий раз, когда практические, важно проверить механизмы слитые с использованием как липидный и растворимые содержимое этикетки. Например, высвобождение липидов может быть тормозится отличных пор мерцанием процессов, таких как ограничение диффузии липидов с помощью силки белков, которые окружают тон пор. Если бы это было так, то выброс содержимого будет предшествовать выпуск липидных меток, при условии, что поры достаточно большой, чтобы позволить прохождение растворимых зондов. Более фундаментальный недостаток в подходе может быть в предположении, что передача меченых липидов в SBL происходит через узкий поры слияния, соединяющей SBL с пузырьком, который в значительной степени сохранил свой предварительно слитый форму. Перенос липидов в SBL может также быть результатом быстрого дилятацией поры слияния с сопутствующим, чрезвычайно быстрым распадом SUV в мембрану SBL, как и предполагалось ранее на основе данных высвобождения липидного только 29. Мониторинг жиро- и содержание выпустить одновременно, было обнаружено , что многие поры закупорить после освобождения всех их липидного метки, но сохранил некоторые из их растворимой груза 27. Это указывает на то, что по крайней мере некоторые липосомы не разрушаются в SBL после слияния, и что передача липидная красителя в SBL происходит через поры слияния. Кроме того, лIPID и содержание релиз произошло одновременно 27, что делает его маловероятным , что замедление высвобождения липидов было связано с затруднением диффузии липидов с помощью SNARE белков , окружающих поры 45.

Протокол слияния SUV-SBL , который не контролировать содержание растворимых релиз ранее опубликованных Karatekin и Ротман 25. Здесь более недавние события включены, а именно одновременный мониторинг липидов и содержание релиз и оценка SUV, липидных и слитый пор свойства 27. Протокол начинается с инструкции по подготовке Микрожидкостных клетки, изготовленные путем соединения поли (диметил силоксан) (PDMS) эластомер блок , содержащий канавки с покровным стеклом 25. Далее, подготовка V-внедорожников с обоими липида и содержание маркеров объясняется. Разделы 4 и 5 содержат инструкции по сборке Микрожидкостных клеток, образуя SBLs на месте и проверки на наличие дефектов и текучестью, введение VŠUVS в клетки потока и обнаружение слитых событий. Раздел 6 содержит инструкции для анализа данных.

Protocol

1. Подготовка PDMS блока, чтобы сформировать канал микрожидком Рисунок 1. микротехнологий шаблона проточной ячейки и подготовки PDMS блока. (А) Конструкция проточной ячейки четырехканальной , который поме?…

Representative Results

Качество SBL Крайне важно, чтобы проверить качество и текучесть SBL до слияния эксперимента. Флуоресценции в нижней части, стеклянной стороне микрожидком канала должен быть однородным, без каких-либо видимых дефектов. Если возд…

Discussion

Успешное осуществление анализа гибридного SUV-SBL, описанного здесь в решающей степени зависит от нескольких ключевых шагов, таких как функционального восстановления белков в липосомы, получение хорошего качества SBLs, и выбирая правильные параметры изображения для обнаружения одиночны?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Vladimir Polejaev (Yale West Campus Imaging Core) for the design and construction of the polarized TIRF microscope, David Baddeley (Yale University) for help with two-color detection instrumentation, and James E. Rothman (Yale University) and Ben O’Shaughnessy (Columbia University) and members of their groups for stimulating discussions. EK is supported by a Kavli Neuroscience Scholar Award from the Kavli Foundation and NIH grant 1R01GM108954.

Materials

Reagents
Milli-Q (MQ) water Millipore
KOH J.T. Baker 3040-05
Ethanol 190 Proof Decon
Isopropanol Fisher Chemical A416P4
HEPES AmericanBio AB00892
Sodium Cholride (KCl) AB01915
Dithiothreitol AB00490
N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) AmericanBio AB00892
EGTA Acros Organics 409911000
Buffers
HEPES-KOH buffer (pH 7.4) 25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCl, 100 μM EGTA, 1 mM DTT
Solvents
Chloroform  J.T. Baker 9180-01 in glass bottle, CAUTION, wear PPE
Methanol J.T. Baker 9070-03 in glass bottle, CAUTION, wear PPE
Liposome preparation 
Gastight Hamilton syringe Hamilton var. sizes only use glass sringe with solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v) http://www.hamiltoncompany.com
Glass tubes Pyrex Vista 11 ml, 16×100 mm screw cap culture tube Pyrex  70825-16 clean thoroughly, rinse with chloroform http://catalog2.corning.com/LifeSciences/
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 16:0-18:1 PC (POPC) Avanti Polar Lipids 850457 Lipids come dissolved in CHCl3 or as lyphilized powder in sealed vials. Aliquot upon opening. Store extra as dried lipid films under inert atmosphere at -20 °C. Keep stocks in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) at -20 °C. let come to RT before opening http://www.avantilipids.com/
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt), 18:1 PS (DOPS) 840035
1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 18:0-20:4 PE (SAPE) 850804
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt), Brain PI(4,5)P2 840046
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt), 18:1 NBD PE 810145
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt), 18:1 PEG2000 PE 880130
cholesterol (ovine wool, >98%) 700000
DiD' oil; DiIC18(5) oil (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate) Molecular Probes D-307 https://www.thermofisher.com/ 
Rotavapor R-210 Buchi R-210 heat bath above Tm of lipids used http://www.buchi.com/
OG n-Octyl-β-D-Glucopyranoside Affymetrix 0311 store at -20°C, let come to RT before opening https://www.anatrace.com/
Shaker – Eppendorf Thermomixer R Eppendorf https://www.eppendorf.com/
Slide-A-Lyze Dialysis Cassettes, 20K MWCO, 3 mL life technologies 66003 https://www.lifetechnologies.com/
Bio-Beads SM-2 Adsorbents Bio-Rad 1523920 http://www.bio-rad.com/
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma-Aldrich D1556 http://www.sigmaaldrich.com/
Ultracentrifugation tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm  Beckman Coulter 41121703 https://www.beckmancoulter.com/
Beckman SW41 Ti rotor
SuflorhodamineB Molecular Probes S-1307 https://www.thermofisher.com/ 
Econo-Column Chromatography Columns, 2.5 × 10 cm Bio-Rad 7372512 http://www.bio-rad.com/
Sepharose CL-4B GE Healthcare 17-0150-01 http://www.gelifesciences.com/
SYPRO Orange Protein Gel Stain Molecular Probes S-6650 5,000X Concentrate in DMSO https://www.lifetechnologies.com/
PDMS block
Sylgard 184 Silicone elastomer kit, PDMS Dow Corning 3097358-1004 http://www.dowcorning.com/
Pyrex glass petri dish, 150 x 20 mm, complete with cover Corning 3160-152 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/
Hole puncher – Reusable Biopsy Punch, 0.75mm World Precision Instruments 504529 http://www.wpi-europe.com/
Manual Hole Punching Machine  SYNEO MHPM-UNV http://www.syneoco.com/
Drill .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN coated round punch CR0350265N20R4 drill diameter: 0.9 mm
Tygon Microbore tubing, 0.25 mm ID, 0.76 mm OD Cole-Parmer 06419-00 0.010" ID, 0.030" OD http://www.coleparmer.com/
Silicone Tubing (0.51 mm ID, 2.1 mm OD 95802-00 0.020" ID, 0.083" OD
Cover glass -  cleanroom cleaned
Schott Nexterion cover slip glass D Schott 1472305 http://www.us.schott.com/
plasma cleaner Harrick PDC-32G http://harrickplasma.com/
pTIRF setup and accessories
IX81 microscope body Olympus IX81 http://www.olympus-lifescience.com/en/
EM CCD camera Andor ixon-ultra-897 http://www.andor.com/
Thermo Plate, heated microscope stage Tokai Hit MATS-U52RA26 http://www.tokaihit.com/
1 ml hamilton glass syringes (4x) Hamilton 81365 http://www.hamiltoncompany.com
syringe pump kd Scientific KDS-230 http://www.kdscientific.com/

Referenzen

  1. Sudhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323, 474-477 (2009).
  2. Wickner, W., Schekman, R. Membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 658-664 (2008).
  3. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 690-698 (2008).
  4. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs–engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 631-643 (2006).
  5. Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. The fusion pore. Biochim Biophys Acta. 1641, 167-173 (2003).
  6. Staal, R. G., Mosharov, E. V., Sulzer, D. Dopamine neurons release transmitter via a flickering fusion pore. Nat Neurosci. 7, 341-346 (2004).
  7. Wu, Z., et al. Nanodisc-cell fusion: Control of fusion pore nucleation and lifetimes by SNARE protein transmembrane domains. Sci. Rep. 6, 27287 (2016).
  8. Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Ann Rev Physiol. 75, 393-422 (2013).
  9. Rossetto, O., Pirazzini, M., Montecucco, C. Botulinum neurotoxins: genetic, structural and mechanistic insights. Nature Rev Microbiol. 12, 535-549 (2014).
  10. Weber, T., et al. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  11. Nickel, W., et al. Content mixing and membrane integrity during membrane fusion driven by pairing of isolated v-SNAREs and t-SNAREs. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 12571-12576 (1999).
  12. McNew, J. A., et al. Compartmental specificity of cellular membrane fusion encoded in SNARE proteins. Nature. 407, 153-159 (2000).
  13. Melia, T. J., You, D. Q., Tareste, D. C., Rothman, J. E. Lipidic antagonists to SNARE-mediated fusion. J Biol Chem. 281, 29597-29605 (2006).
  14. Hernandez, J. M., et al. Membrane fusion intermediates via directional and full assembly of the SNARE complex. Science. 336, 1581-1584 (2012).
  15. Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7311-7316 (2004).
  16. Bowen, M. E., Weninger, K., Brunger, A. T., Chu, S. Single molecule observation of liposome-bilayer fusion thermally induced by soluble N-ethyl maleimide sensitive-factor attachment protein receptors (SNAREs). Biophys J. 87, 3569-3584 (2004).
  17. Liu, T., Tucker, W. C., Bhalla, A., Chapman, E. R., Weisshaar, J. C. SNARE-driven, 25-millisecond vesicle fusion in vitro. Biophys J. 89, 2458-2472 (2005).
  18. Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19731-19736 (2006).
  19. Diao, J., et al. A single-vesicle content mixing assay for SNARE-mediated membrane fusion. Nat Commun. 1, 1-6 (2010).
  20. Kyoung, M., et al. In vitro system capable of differentiating fast Ca2+-triggered content mixing from lipid exchange for mechanistic studies of neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E304-E313 (2011).
  21. Domanska, M. K., Kiessling, V., Stein, A., Fasshauer, D., Tamm, L. K. Single vesicle millisecond fusion kinetics reveals number of SNARE complexes optimal for fast SNARE-mediated membrane fusion. J Biol Chem. 284, 32158-32166 (2009).
  22. Kreutzberger, A. J., Kiessling, V., Tamm, L. K. High Cholesterol Obviates a Prolonged Hemifusion Intermediate in Fast SNARE-Mediated Membrane Fusion. Biophys J. 109, 319-329 (2015).
  23. Schwenen, L. L., et al. Resolving single membrane fusion events on planar pore-spanning membranes. Sci Rep. 5, 12006 (2015).
  24. Karatekin, E., et al. A fast, single-vesicle fusion assay mimics physiological SNARE requirements. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3517-3521 (2010).
  25. Karatekin, E., Rothman, J. E. Fusion of single proteoliposomes with planar, cushioned bilayers in microfluidic flow cells. Nat Protoc. 7, 903-920 (2012).
  26. Smith, M. B., et al. Interactive, computer-assisted tracking of speckle trajectories in fluorescence microscopy: application to actin polymerization and membrane fusion. Biophys J. 101, 1794-1804 (2011).
  27. Stratton, B. S., et al. Cholesterol Increases the Openness of SNARE-mediated Flickering Fusion Pores. Biophysical journal. 110, (2016).
  28. Diao, J., et al. Synaptic proteins promote calcium-triggered fast transition from point contact to full fusion. Elife. 1, e00109 (2012).
  29. Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophys J. 99, 4047-4055 (2010).
  30. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  31. Washbourne, P., et al. Genetic ablation of the t-SNARE SNAP-25 distinguishes mechanisms of neuroexocytosis. Nat Neurosci. 5, 19-26 (2002).
  32. Diaz, A. J., Albertorio, F., Daniel, S., Cremer, P. S. Double cushions preserve transmembrane protein mobility in supported bilayer systems. Langmuir. 24, 6820-6826 (2008).
  33. Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
  34. Albertorio, F., et al. Fluid and air-stable lipopolymer membranes for biosensor applications. Langmuir. 21, 7476-7482 (2005).
  35. Daniel, S., Albertorio, F., Cremer, P. S. Making lipid membranes rough, tough, and ready to hit the road. Mrs Bulletin. 31, 536-540 (2006).
  36. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337, 1340-1343 (2012).
  37. Kenworthy, A. K., Hristova, K., Needham, D., Mcintosh, T. J. Range and Magnitude of the Steric Pressure between Bilayers Containing Phospholipids with Covalently Attached Poly(Ethylene Glycol). Biophys J. 68, 1921-1936 (1995).
  38. Knoll, W., et al. Solid supported lipid membranes: New concepts for the biomimetic functionalization of solid surfaces. Biointerphases. 3, Fa125-Fa135 (2008).
  39. Quinn, P., Griffiths, G., Warren, G. Density of newly synthesized plasma membrane proteins in intracellular membranes II. Biochemical studies. J Cell Biol. 98, 2142-2147 (1984).
  40. Sund, S. E., Swanson, J. A., Axelrod, D. Cell membrane orientation visualized by polarized total internal reflection fluorescence. Biophys J. 77, 2266-2283 (1999).
  41. Johnson, D. S., Toledo-Crow, R., Mattheyses, A. L., Simon, S. M. Polarization-controlled TIRFM with focal drift and spatial field intensity correction. Biophys J. 106, 1008-1019 (2014).
  42. Anantharam, A., Onoa, B., Edwards, R. H., Holz, R. W., Axelrod, D. Localized topological changes of the plasma membrane upon exocytosis visualized by polarized TIRFM. J Cell Biol. 188, 415-428 (2010).
  43. Axelrod, D. Carbocyanine dye orientation in red cell membrane studied by microscopic fluorescence polarization. Biophys J. 26, 557-573 (1979).
  44. Wang, T., Smith, E. A., Chapman, E. R., Weisshaar, J. C. Lipid mixing and content release in single-vesicle, SNARE-driven fusion assay with 1-5 msec resolution. Biophys J. 96, 4122-4131 (2009).
  45. Chernomordik, L. V., Frolov, V. A., Leikina, E., Bronk, P., Zimmerberg, J. The pathway of membrane fusion catalyzed by influenza hemagglutinin: restriction of lipids, hemifusion, and lipidic fusion pore formation. J Cell Biol. 140, 1369-1382 (1998).
  46. Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127, 831-846 (2006).
  47. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
  48. Scott, B. L., et al. Liposome fusion assay to monitor intracellular membrane fusion machines. Methods Enzymol. 372, 274-300 (2003).
  49. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
  50. Soumpasis, D. M. Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments. Biophys J. 41, 95-97 (1983).
  51. Ohki, S. A mechanism of divalent ion-induced phosphatidylserine membrane fusion. Biochim Biophys Acta. 689, 1-11 (1982).
  52. Berquand, A., et al. Two-step formation of streptavidin-supported lipid bilayers by PEG-triggered vesicle fusion. Fluorescence and atomic force microscopy characterization. Langmuir. 19, 1700-1707 (2003).
  53. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophys J. 47, 105-113 (1985).
  54. Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophys J. 101, L37-L39 (2011).
  55. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Reconstituted syntaxin1a/SNAP25 interacts with negatively charged lipids as measured by lateral diffusion in planar supported bilayers. Biophys J. 81, 266-275 (2001).
  56. Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. Formation of Supported Planar Bilayers by Fusion of Vesicles to Supported Phospholipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 1103, 307-316 (1992).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Nikolaus, J., Karatekin, E. SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy. J. Vis. Exp. (114), e54349, doi:10.3791/54349 (2016).

View Video