Summary

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

Published: August 24, 2016
doi:

Summary

Burada, tek bir molekül duyarlılık ve ~ 15 msn zaman çözünürlüğü ile polarize TIRFM kullanılarak lipozomlar ve mikroakışkan kanallarda desteklenen iki katmanlı arasındaki tek tuzak aracılı füzyon olayları tespit etmek için bir protokol mevcut. Lipid ve çözünür kargo sürümü aynı anda tespit edilebilir. Lipozom boyutu, lipit yayınım ve füzyon gözenek özellikleri ölçülmüştür.

Abstract

membran füzyon her yerde sürecinde bir füzyon gözenek açılması iki eski ayrı bölmeleri arasında ilk bağlantı kurar. ekzositoz yoluyla nörotransmiter veya hormon salınımı sırasında, füzyon gözenek geçici açık ve kapalı defalarca düzenleyen kargo bırakma kinetiği yapabilirsiniz. Gözenek dinamikleri de vezikül geri dönüşüm modu belirlemek; Geçici, "kiss-ve-run" füzyon geri dönüşümsüz tekrar mühürleme sonuçları, oysa dilatasyon tam erimesine yol açıyor. Daha iyi gözenek dinamikleri yöneten faktörlerin neler olduğunun anlaşılması için, biz tek bir molekülün duyarlılık ve ~ bir biyokimyasal vitro sistemde iyi tanımlanmış 15 msn zaman çözünürlüğü ile polarize toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi kullanılarak membran füzyon izlemek için bir tahlil geliştirdi. Fusion floresan düzlemsel iki tabakalı rulman t-tuzaklarına ile V-Snare proteinler (v-SUV) içeren küçük tek tabakalı veziküller etiketli, yumuşak bir polimer yastık desteklenen (t-SBL, t-desteklenen iki tabakalı) Izlenir. Tahlil SUV sabit bir yoğunluğa tedarik ederken en az numune tüketimini sağlamak mikroakışkan akış kanalları kullanır. füzyon sırasında SBL için SUV lipit etiket transferi üzerine hızlı sinyal geliştirme istismar lipit boya transferi kinetik izlenir. TIRF mikroskopi duyarlılığı lipit yayınım ve SUV boyutu her füzyon olayı için çıkarılabilir hangi tek floresan lipit etiketleri, izleme sağlar. Lipid boya bırakma süreleri kalıcı olarak açık gözenekler aracılığıyla engelsiz geçiş için beklenenden çok daha uzun olabilir. Lipid sürümü geriliği titremesini gözenek nedeniyle bir gözenek "açıklık", gözenek füzyonu sırasında açık kalır zaman kısmını kabul, bir modeli kullanarak, tahmin edilebilir. Bir çözünür işaret lipid ve çözünür kargo sürümü aynı anda izlenmesi için SUV kapsüllü edilebilir. Bu tür ölçümler, bazı gözenekler çözünür kargo bir kısmını kaybettikten sonra yeniden mühürlemek olabilir göstermektedir.

Introduction

Membran füzyon lipidler ve proteinler, sekresyon, gübreleme, gelişme hücre içi kaçakçılığı için gerekli evrensel bir biyolojik süreçtir ve konak organizmalar 1-3 içine virüs girişini sardı. Ekzositoz ile hormonlar ve nöron iletici serbest bırakılması da dahil olmak üzere pek çok hücre içi füzyon reaksiyonları için, iki lipit iki katmanlı sigorta enerji demirli, aynı kökenli çözünür, N-etilmaleimit duyarlı faktörü bağlama proteini reseptörü (SNARE) proteinleri arasında dört sarmal demet oluşumu ile sağlanır vezikül (V-SNARE), sırasıyla, hedef membran (t-SNARE) 4. Sinaptik vezikül ekzositoz en sıkı regüle füzyon reaksiyonudur ve bir aksiyon potansiyeli 1,4,5 geldikten sonra bir milisaniye içinde gerçekleşir. Füzyon gözenek, iki füzyon bölmeleri arasında ilk bağlantı, açık titreşmeye ve yeniden mühürleme ya da geri dönüşümsüz 5-7 genişletmeden önce birden çok kez kapalı olabilir. eski sonuçlargeçici olarak, ikincisi yol açar iken tam füzyon, füzyon "öpücük ve çalıştırın". Bu iki füzyon modları ve gözenek titremesini düzenleyen mekanizmalar arasındaki dengeyi düzenleyen faktörler de 5,8 anlaşılmamıştır.

Snare proteinler ekzositoz için gerekli olan; sinaptik vezikül füzyon nörotoksin 9 ile tuzaklarına ayrılması üzerine kaldırılmıştır. Küçük tek lamelli vesiküller (SUVler) kullanılarak yığın füzyon deneyleri membran füzyon 10 çalıştırmak için yeterli tuzak, sadece gerekli değildir; ancak şu. Bu toplu deneyde, SUV V-tuzak (V-SUV) ile yeniden flüoresan fosfolipid (N katkılı edildi – (7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-il) -phosphoethanolamine (NBD-PE) ve ( N -. (lisamin rodamin B sülfonil) -phosphoethanolamine (LR-PE) ve V-SUV NBD-PE Başlangıçta floresans Förster rezonans enerji transferi ile söndürüldü t-tuzak (t-SUV) ihtiva eden etiketlenmemiş veziküller ile (FRET ) LR-PE. laboratuvarda gibiELED v SUV etiketsiz t-SUV ile sigorta, şimdi kombine zarında fluorofor yüzey yoğunluğu azalır ve NBD-PE floresan sonuçlanan artış lipit 10 karıştırma ölçüde bildirir. Toplu tahlil kurmak ve analiz etmek kolay olduğu gibi, yaygın tuzak aracılı füzyon 10-14 mekanizmaları incelemek için kullanılır olmuştur. Ancak, bu düşük duyarlılık ve kötü zaman çözünürlüğü gibi çeşitli sınırlamalar vardır. En önemlisi, bir topluluk ölçü olarak, zor hemifusion ara maddelerin yerleştirme ve füzyon arasındaki ayrım, yanı sıra algılama yaparak tüm olaylar üzerinde bu ortalamalara sonuçları.

Bizimki de dahil olmak üzere geçmiş on yılda birkaç grup, üzerinde, tek vezikül düzeyinde 15-27 füzyon olayları izlemek için yeni testlerin geliştirdik. Ha ve arkadaşları bir yüzey üzerine gergin v SUV kullanılan ve ücretsiz t-SUV 18,19 ile füzyon izlenir. Lipid karıştırma lipide bağlı flüoroforların bir çifti arasında FRET kullanılarak izlenmiştir emtoplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi 18 kullanılarak, sırasıyla V- ve t-SUV, içinde yataklı. Daha sonra, Brünger laboratuar lipit içeriği 20,28 karıştırma eş zamanlı saptanması için bir dizin işaretleyici ile birlikte tek bir lipit etiketli türler kullanılabilir. lipit ve içerikleri belirteçleri hem de yüksek, kendini söndürme konsantrasyonlarda dahil edildi; etiketlenmemiş SUV füzyon 20,28 dequenching floresan ile sonuçlanmıştır.

Diğerleri t-tuzaklarına 15-17,21-27,29 ile yeniden düzlemsel bilayers v-SUV kaynaşmış. hedefin (içeren t-Snare) iki tabakalı iyi taklit düz bir plazma zarı ile küçük, son derece kavisli veziküllerin fizyolojik füzyon süreci düzlemsel geometrisi. Steinem grubu gözenekli silisyum nitrür alt-tabaka üzerinde süspansiyon haline t-tuzak ile yeniden gözenek kapsayan membranlar kullanılabilmekte ve konfokal lazer tarama mikroskobu 23 kullanılarak tek tek h-SUV ile füzyon tespit edildi. Diğerleri ft-tuzak ile yeniden düzlemsel iki katmanlı, kullanılmış h-SUV bir cam alt-tabaka 15-17,21,22,24-27,29 desteklenir. Desteklenen bilayers (SBLs) kullanarak büyük avantajı mikroakışkanları kullanarak da kullanarak tek olay çözünürlüğü sağlar, ancak TIRF mikroskopi, mükemmel sinyal-gürültü oranı ile ücretsiz v-SUV müdahalesi olmaksızın yerleştirme ve füzyon olayları tespit etmek için kullanılabilir olmasıdır standart uzak alan Epifloresans mikroskobu 24.

Bir büyük endişe substrat-iki tabakalı etkileşimleri iki tabakalı kalitesi ve füzyon süreci desteklenen etkiler ve nasıl olduğunu. Erken çalışma, doğrudan bir cam veya kuvars alt tabaka 15-17 desteklenen edildi düzlemsel SBLs kullandı. Bu SBLs yayma ve alt-tabaka t-SUV membran füzyonu, patlama, adsorpsiyon ile yapılmıştır. Kısa bir süre sonra önemli bir T-SNARE bileşenini çıkararak SNAP-25'in bu şekilde hazırlandı SBLs V-SUV yerleştirme füzyon kinetiği indistinguis sonuçlandı ki, gerçekleşmiştirtam t-tuzaklarına 17 kullanılarak elde edilenlerden hable. SNAP-25'in kesinlikle vivo 30,31 füzyon için gerekli olduğundan, bu erken girişimleri fizyolojik alaka soru konulmuştur. Tamm grubu daha iyi desteklenen kontrollü iki tabakalı oluşumunu 21 kullanarak bu zorluğu aştı. Bu t-SUV 21 ile bu tek tabakalı füzyonu tarafından takip SBL protein içermeyen ilk broşürü için Langmuir-Blodgett birikimi kullanılır. Bu SNAP-25'in bağımlı füzyon ile sonuçlanmıştır.

Şirketinden Langmuir-Blodgett yöntemleri kullanmaya gerek kalmadan, bir cam alt-tabaka üzerinde desteklenen bir çift-katlı ile bağlantılı potansiyel eserler önlemek için, Karatekin'i ve ark., Çift-katlı ve alt-tabaka 24 ile yumuşak, hidratlanmış poli (etilen glikol) (PEG) yastık kişiye. Bu modifikasyon aynı zamanda SNAP-25'in bağımlı füzyon 24 sonuçlandı. yumuşak bir polimer tabakası üzerinde yastıklı bilayers daha iyi transmembran korumak için malûmProtein hareketlilik ve fonksiyon 32, ve virüsler 33 ile füzyon çalışmalarında kullanılan olmuştu. Buna ek olarak, PEG'lenmiş bilayers-iyileşmek kendini bazı yeteneğini korumak gibi görünüyor ve 34,35 derece sağlamdır. İlk olarak, ticari olarak temin edilebilir, lipid bağlı PEG zincirlerinin bir kısmı, t-SUV zar dahildir. Bu T-SUV patlama ve bir cam alt-tabaka üzerinde düzlemsel bir çift tabakası oluşturur, PEG fırçası düzlemsel iki katmanlı iki broşür içerir. düzlemsel bir iki tabakalı oluşum hidrofilik bir cam yüzeyi üzerine, T-SUV Çevre PEG zincirlerinin yapışma tahrik sayesinde, lipozom patlama ve düzlemsel iki katmanlı oluşum şeklinde kullanılan yağ bileşimine nispeten hassas değildirler. kolesterol büyük miktarlarda dahil edilir, ancak, SUV kohesif özelliklere artan, SUV kendiliğinden patlama olabilir. Bu durumda, ozmotik şok ve çift değerli iyonlar, düzlemsel bir iki tabakalı oluşum 25 yardımcı olarak kullanılabilir.

Bu ap olarak, yukarıda da belirtildiği gibiPEG fırçası düzlemsel her iki tarafını da kapsar yaklasımlarında iki tabakalı desteklenir. mikroakışkan akış kanalı bakan fırçası, genellikle, bir PEG tabakası ile kaplanmış olan gelen V-SUV spesifik olmayan yapışmasını önlemeye yardımcı olur. V- ve t-Snare komplekslerinin oluşumu zara yakın etki 36 doğru kademeli olarak zara-uzak N-termini ve gelirleri başlar. v-SUV t-SBL, V ve tayinin koşulları altında durum gibi görünüyor PEG fırçalar, üzerinde çıkıntı t-tuzak N-termini ihtiyacı ile etkileşim için. Fırça yüksekliği PEG'lenmiş lipidlerin yoğunluğu ve PEG bağ uzunluğunun gösterildiği 37,38 değiştirilerek tuzak dışındaki proteinlerin incelemek için adapte edilebilir. Füzyon iki katmanlı proksimal yüzeyleri kaplayan PEG fırçalar başka yararı da meydanda mikron 39 başına 30,000-40,000 integral membran proteinleri ile paketlenir biyolojik membranların kalabalık ortamı taklit olmasıdır. Sadece bu testte PEG zincirleri gibi, Repubiyolojik zarlardan kapsayan lsive protein tabakası füzyonu meydana gelmesi için, iki fosfolipid ikili tabakalar arasındaki temas sağlamak için bir kenara gerekmektedir.

bunlar özel avantajlar sunar olarak mikroakışkan akış kanalları, bu deneyde kullanılır. İlk olarak, mikro-akışkan akış t-SBL oluşturulması için daha düzgün yayılması için T-SUV çökelmesini ve sigorta sağlar. İkincisi, küçük kanal hacmi (<1 ul) örnek tüketimini en aza indirir. Üçüncü olarak, gerekli küçük hacimler, tüm deney sürekli akışı altında iletilmesine olanak tanımaktadırlar. Akış zayıf kaldırır, muhtemelen non-spesifik, SBL 16 yapıştırılır v-SUV. Ayrıca, kinetik analiz 17 basitleştirilmesi t-SBL Yukarıda h-SUV, sabit bir yoğunluğa tutar. Son olarak, demirledi kesecikler kolaylıkla akışı 25 tarafından taşınan serbest olanlardan ayırt edilir. Dördüncü olarak, çok sayıda mikroakışkan kanal her biri farklı bir durum tarama aynı lamel kullanılabilir. Bu koşullar Duri karşılaştırılmasına olanak sağlarAynı deney çalıştırmak ng. Benzer bir yaklaşım influenza virüsü ve yastıklı SBLs 33 arasında füzyon incelemek için van Oijen grubu tarafından kullanılmaktadır.

TIRF mikroskopi, cam tampon arayüzü çok yakın olan bu moleküllere sınırlandırır floresan uyarma (bir çürüme sabit ~ 100 nm) ile yiten alanın üstel çürüme. Bu, daha uzak olan floresan moleküller katkısını en aza indirir sinyal-gürültü oranını artırır ve 10-40 milisaniye çerçeve pozlama süreleri ile tek bir molekül hassasiyeti sağlar. fani alanı da füzyon üzerine bir sinyal artışına neden olur: SBL içine SUV etiketli lipidler transferi gibi, kendilerini bulmak, ortalama olarak, daha güçlü bir uyarım alanında. floresanstaki bu artış daha büyük lipozomlar için kuvvetlidir.

polarize ışık kaybolan alan üretmek için kullanılırsa, ilave özellikler t üzerine floresanstaki değişikliklere katkıdaSBL içine SUV etiket ransfer. Bazı lipid boyalar da gömülü olduğu çift-katlı göre bir tercih edilen ortalama açı ile yönlendirilmiş bir geçiş dipol sahiptir. Polarize ışın farklı iki zarlarında boyalar heyecanlandıracak çünkü bu, onlar SBL karşı SUV olduğunda fluorophores tarafından yayılan floresan miktarında bir fark yaratmaktadır. ikincisi için, dipol yönelimleri düz SBL geometri ile sınırlı olacak, oysa eski için, uyarma kiriş, küresel SUV etrafında odaklı geçiş dipol ile etkileşim olacaktır. Boya zar 29,40 bir lipit, boya geçişi dipol yönelimli paralel SUV daha SBL olduğunda, örneğin, S-polarize (yansıma düzlemine dik polarize) gelen ışık kullanıldığında, uyarım daha etkilidir (örneğin, DII bu veya yaptıkları 41-43 gibi). Böyle bir fluorofor ile katkılı bir SUV loş göründüğünde SBL (Şekil 7, representat üzerine bu rıhtım ) Sonuçları ive. Bir füzyon gözenek açılır ve SUV ve SBL membranlar bağlayan gibi, floresan sondalar SBL nüfuz ve s-polarize kaybolan alanda 25,27,29 tarafından heyecan daha olası hale gelir. Sonuç olarak, füzyon site çevresinde entegre floresans sinyali SBL 27 (Şekil 3 ve Şekil 7) içine SUV boya transferi sırasında büyük oranda artar. SBL aktarılır zaman seyreltilmiş olarak füzyon floresan etiket dequenching olduğunu eşlik değişiklikleri sinyal katkıda ek bir faktör. dequenching katkısı nedeniyle sadece küçük bir kısmı (burada anlatılan deneyde kaybolan alan çürüme ve polarizasyon etkileri ile karşılaştırıldığında genellikle önemsizdir denklem 1 ) Lipidlerin etiketlenmiştir.

füzyon üzerine sinyal artışı zamanı karşılaştırarak füzyon gözenek özelliklerini anlamak için kullanılabilir,1 "src =" / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>, bir lipit fiili bırakma süresi lipidler serbestçe geçirgen bir gözenek yoluyla kaçmak için gerekli olan, denklem 1 . İki zaman ölçekleri karşılaştırılabilir ise, gözenek lipit akışına çok az direnç sunar sonucuna olacaktır. Gerçek serbest bırakma süresi daha uzun difüzyon ile sınırlı serbest bırakılması için zaman önemli ölçüde ise, ancak, bu lipit salgılamayı geciktiren, bu gözenek titremesi gibi bir işlem işaret eder. Difüzyon sınırlı bırakma zamanı, denklem 1 , Fırınlama lipozom ve lipid-yayılma büyüklüğüne bağlıdır; onun tahmini bu iki parametre sayısal gerektirir. Testin tek bir molekülün duyarlılık lipit yayınım her füzyon olayı 26 için SBL onların serbest bırakıldıktan sonra birkaç tek lipit fluorophores takip ölçülebilir sağlar. Her füzyon vezikül büyüklüğü(i) tek bir lipid boyanın yoğunluğu, SUV (ii) tüm flüoroforlar füzyon üzerine SBL aktarılır sonra yerleştirme site çevresinde toplam parlaklıkta meydana gelen değişiklikler (III) bilinen bir etiketleme yoğunluğu birleştirilerek 27 tahmin edilebilir lipitler, ve (iv) lipit alan başına. Üniforma SUV boyutu 44 varsayarak Daha önce de belirtildiği gibi birçok füzyon etkinlikleri için gerçek lipit bırakma süreleri, difüzyon kontrollü salım 27 tarafından beklenenden çok daha yavaş olduğu tespit edildi. Lipid sürümü geriliği varsayarsak titremeyi gözenek nedeniyle, nicel bir model "gözenek açıklık" tahmin edilebilir, zaman kesir gözenek füzyonu 27 boyunca açık kalır.

Ne zaman pratik, lipid ve çözünür içeriği etiketleri her ikisini de kullanarak füzyon mekanizmaları test etmek önemlidir. Örneğin, lipit bırakma gibi Snare proteinler Surround ton lipit difüzyon kısıtlanması olarak gözenek titremesi başka süreçler tarafından geciktirilebilir olabilirO gözenek. Bu durumda olsaydı, o zaman, lipit etiket salınmasını önce olur içeriğinin serbest boşluk çözünebilir problar geçişine izin verecek kadar büyük olması gereklidir. yaklaşımı daha temel bir kusur SBL etiketli lipitlerin transferi büyük ölçüde öncesi füzyon şeklini korudu bir kesecik için SBL bağlayan dar bir füzyon gözenek yoluyla gerçekleşir varsayım olabilir. Daha önce lipit bırakma verilerine yalnız 29 dayalı önerdi olarak SBL içine lipid transfer de, bir eşlik eden füzyon gözenek, SBL membran içine SUV son derece hızlı çöküşü hızlı genleşme sonucu olabilir. Her iki lipid İzleme ve içeriği aynı anda bırakın, birçok gözenekler tüm lipit etiketlerini serbest bıraktıktan sonra yeniden mühürlenerek bulundu, ancak kendi çözünür kargo 27 bazı tutuldu. Bu en azından bazı lipozomlar SBL içine lipit boya transferi bir füzyon gözenek yoluyla oluşur birleşmesinden sonra SBL içine çökmeye ve yok olduğunu gösterir. Buna ek olarak, lIPID ve içeriği bırakma lipit sürümü geriliği gözenek 45 çevreleyen Snare protein lipid difüzyon engel teşkil nedeniyle olduğunu olmayan, aynı anda 27 oluştu.

Çözünür içeriği serbest izlemek vermedi bir SUV-SBL füzyon protokol daha önce Karatekin ve Rothman 25 tarafından yayımlandı. Burada, daha son gelişmeler dahil lipid yani eşzamanlı izleme ve içerikleri serbest ve SUV, lipit ve füzyon gözenek özellikleri 27 tahmini vardır. Protokol, bir cam lamel 25 bir poli (dimetil siloksan) yapıştırılması ile yapılan mikro-akışkan hücreleri (PDMS) elastomer blok ihtiva eden oluklar hazırlanması için talimatlar ile başlar. Daha sonra, lipid ve içeriği belirteçlerinin her ikisi de V-SUV hazırlanması açıklanmıştır. Bölümler 4 ve 5, VS giriş, mikroakışkan hücre montaj yerinde SBLs şekillendirme ve kusurları ve akışkanlığı kontrol için yönergeler sağlarakış hücreleri füzyon etkinlikleri algılama içine UV'lerinizi. Bölüm 6 Veri analizi için yönergeler sağlar.

Protocol

Mikroakışkan Kanal Form PDMS Blok 1. Hazırlık Akış hücresi şablonu ve PDMS Blok hazırlanması Şekil 1. Mikro ve (A). 24 x 60 mm cam lamel (alt) uyan bir dört kanallı akış hücresinin tasarımı. Altı denk tasarımların 10 cm'lik bir silikon (üst) uydurmak için düzenlenmiştir. (B) bir delik zımba ya…

Representative Results

SBL Kalite Füzyon deneyi öncesinde SBL kalite ve akışkanlığı kontrol etmek çok önemlidir. mikroakışkan kanal alt cam tarafında floresan belirgin kusurlar olmadan düzgün olmalıdır. Bir hava kabarcığı kanalı olsa geçerse, genellikle SBL görünür izleri bırakır. Böyle büyük ölçekli izleri / kusurları varsa, o kanalı kullanmayın. Bazen SUV alt tabaka üzerine yapışır ama sürekl…

Discussion

Burada anlatılan SUV-SBL füzyon deneyinde başarılı bir şekilde uygulanması kaliteli SBLs elde ve tek molekülleri tespit etmek için doğru görüntüleme parametrelerini seçerek, bu tür lipozomlar içine proteinlerin fonksiyonel sulandırma gibi birkaç önemli adımlar, kritik bağlıdır. O başarılı olmak için biraz zaman ve çaba alabilir rağmen tahlil başarıyla uygulandıktan sonra, Giriş bölümünde tartışılan başka in vitro füzyon deneyi bulunmayan füzyon süreci hakkında bilgi b…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Vladimir Polejaev (Yale West Campus Imaging Core) for the design and construction of the polarized TIRF microscope, David Baddeley (Yale University) for help with two-color detection instrumentation, and James E. Rothman (Yale University) and Ben O’Shaughnessy (Columbia University) and members of their groups for stimulating discussions. EK is supported by a Kavli Neuroscience Scholar Award from the Kavli Foundation and NIH grant 1R01GM108954.

Materials

Reagents
Milli-Q (MQ) water Millipore
KOH J.T. Baker 3040-05
Ethanol 190 Proof Decon
Isopropanol Fisher Chemical A416P4
HEPES AmericanBio AB00892
Sodium Cholride (KCl) AB01915
Dithiothreitol AB00490
N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) AmericanBio AB00892
EGTA Acros Organics 409911000
Buffers
HEPES-KOH buffer (pH 7.4) 25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCl, 100 μM EGTA, 1 mM DTT
Solvents
Chloroform  J.T. Baker 9180-01 in glass bottle, CAUTION, wear PPE
Methanol J.T. Baker 9070-03 in glass bottle, CAUTION, wear PPE
Liposome preparation 
Gastight Hamilton syringe Hamilton var. sizes only use glass sringe with solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v) http://www.hamiltoncompany.com
Glass tubes Pyrex Vista 11 ml, 16×100 mm screw cap culture tube Pyrex  70825-16 clean thoroughly, rinse with chloroform http://catalog2.corning.com/LifeSciences/
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 16:0-18:1 PC (POPC) Avanti Polar Lipids 850457 Lipids come dissolved in CHCl3 or as lyphilized powder in sealed vials. Aliquot upon opening. Store extra as dried lipid films under inert atmosphere at -20 °C. Keep stocks in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) at -20 °C. let come to RT before opening http://www.avantilipids.com/
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt), 18:1 PS (DOPS) 840035
1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 18:0-20:4 PE (SAPE) 850804
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt), Brain PI(4,5)P2 840046
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt), 18:1 NBD PE 810145
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt), 18:1 PEG2000 PE 880130
cholesterol (ovine wool, >98%) 700000
DiD' oil; DiIC18(5) oil (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate) Molecular Probes D-307 https://www.thermofisher.com/ 
Rotavapor R-210 Buchi R-210 heat bath above Tm of lipids used http://www.buchi.com/
OG n-Octyl-β-D-Glucopyranoside Affymetrix 0311 store at -20°C, let come to RT before opening https://www.anatrace.com/
Shaker – Eppendorf Thermomixer R Eppendorf https://www.eppendorf.com/
Slide-A-Lyze Dialysis Cassettes, 20K MWCO, 3 mL life technologies 66003 https://www.lifetechnologies.com/
Bio-Beads SM-2 Adsorbents Bio-Rad 1523920 http://www.bio-rad.com/
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma-Aldrich D1556 http://www.sigmaaldrich.com/
Ultracentrifugation tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm  Beckman Coulter 41121703 https://www.beckmancoulter.com/
Beckman SW41 Ti rotor
SuflorhodamineB Molecular Probes S-1307 https://www.thermofisher.com/ 
Econo-Column Chromatography Columns, 2.5 × 10 cm Bio-Rad 7372512 http://www.bio-rad.com/
Sepharose CL-4B GE Healthcare 17-0150-01 http://www.gelifesciences.com/
SYPRO Orange Protein Gel Stain Molecular Probes S-6650 5,000X Concentrate in DMSO https://www.lifetechnologies.com/
PDMS block
Sylgard 184 Silicone elastomer kit, PDMS Dow Corning 3097358-1004 http://www.dowcorning.com/
Pyrex glass petri dish, 150 x 20 mm, complete with cover Corning 3160-152 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/
Hole puncher – Reusable Biopsy Punch, 0.75mm World Precision Instruments 504529 http://www.wpi-europe.com/
Manual Hole Punching Machine  SYNEO MHPM-UNV http://www.syneoco.com/
Drill .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN coated round punch CR0350265N20R4 drill diameter: 0.9 mm
Tygon Microbore tubing, 0.25 mm ID, 0.76 mm OD Cole-Parmer 06419-00 0.010" ID, 0.030" OD http://www.coleparmer.com/
Silicone Tubing (0.51 mm ID, 2.1 mm OD 95802-00 0.020" ID, 0.083" OD
Cover glass -  cleanroom cleaned
Schott Nexterion cover slip glass D Schott 1472305 http://www.us.schott.com/
plasma cleaner Harrick PDC-32G http://harrickplasma.com/
pTIRF setup and accessories
IX81 microscope body Olympus IX81 http://www.olympus-lifescience.com/en/
EM CCD camera Andor ixon-ultra-897 http://www.andor.com/
Thermo Plate, heated microscope stage Tokai Hit MATS-U52RA26 http://www.tokaihit.com/
1 ml hamilton glass syringes (4x) Hamilton 81365 http://www.hamiltoncompany.com
syringe pump kd Scientific KDS-230 http://www.kdscientific.com/

Referenzen

  1. Sudhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323, 474-477 (2009).
  2. Wickner, W., Schekman, R. Membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 658-664 (2008).
  3. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 690-698 (2008).
  4. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs–engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 631-643 (2006).
  5. Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. The fusion pore. Biochim Biophys Acta. 1641, 167-173 (2003).
  6. Staal, R. G., Mosharov, E. V., Sulzer, D. Dopamine neurons release transmitter via a flickering fusion pore. Nat Neurosci. 7, 341-346 (2004).
  7. Wu, Z., et al. Nanodisc-cell fusion: Control of fusion pore nucleation and lifetimes by SNARE protein transmembrane domains. Sci. Rep. 6, 27287 (2016).
  8. Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Ann Rev Physiol. 75, 393-422 (2013).
  9. Rossetto, O., Pirazzini, M., Montecucco, C. Botulinum neurotoxins: genetic, structural and mechanistic insights. Nature Rev Microbiol. 12, 535-549 (2014).
  10. Weber, T., et al. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  11. Nickel, W., et al. Content mixing and membrane integrity during membrane fusion driven by pairing of isolated v-SNAREs and t-SNAREs. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 12571-12576 (1999).
  12. McNew, J. A., et al. Compartmental specificity of cellular membrane fusion encoded in SNARE proteins. Nature. 407, 153-159 (2000).
  13. Melia, T. J., You, D. Q., Tareste, D. C., Rothman, J. E. Lipidic antagonists to SNARE-mediated fusion. J Biol Chem. 281, 29597-29605 (2006).
  14. Hernandez, J. M., et al. Membrane fusion intermediates via directional and full assembly of the SNARE complex. Science. 336, 1581-1584 (2012).
  15. Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7311-7316 (2004).
  16. Bowen, M. E., Weninger, K., Brunger, A. T., Chu, S. Single molecule observation of liposome-bilayer fusion thermally induced by soluble N-ethyl maleimide sensitive-factor attachment protein receptors (SNAREs). Biophys J. 87, 3569-3584 (2004).
  17. Liu, T., Tucker, W. C., Bhalla, A., Chapman, E. R., Weisshaar, J. C. SNARE-driven, 25-millisecond vesicle fusion in vitro. Biophys J. 89, 2458-2472 (2005).
  18. Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19731-19736 (2006).
  19. Diao, J., et al. A single-vesicle content mixing assay for SNARE-mediated membrane fusion. Nat Commun. 1, 1-6 (2010).
  20. Kyoung, M., et al. In vitro system capable of differentiating fast Ca2+-triggered content mixing from lipid exchange for mechanistic studies of neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E304-E313 (2011).
  21. Domanska, M. K., Kiessling, V., Stein, A., Fasshauer, D., Tamm, L. K. Single vesicle millisecond fusion kinetics reveals number of SNARE complexes optimal for fast SNARE-mediated membrane fusion. J Biol Chem. 284, 32158-32166 (2009).
  22. Kreutzberger, A. J., Kiessling, V., Tamm, L. K. High Cholesterol Obviates a Prolonged Hemifusion Intermediate in Fast SNARE-Mediated Membrane Fusion. Biophys J. 109, 319-329 (2015).
  23. Schwenen, L. L., et al. Resolving single membrane fusion events on planar pore-spanning membranes. Sci Rep. 5, 12006 (2015).
  24. Karatekin, E., et al. A fast, single-vesicle fusion assay mimics physiological SNARE requirements. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3517-3521 (2010).
  25. Karatekin, E., Rothman, J. E. Fusion of single proteoliposomes with planar, cushioned bilayers in microfluidic flow cells. Nat Protoc. 7, 903-920 (2012).
  26. Smith, M. B., et al. Interactive, computer-assisted tracking of speckle trajectories in fluorescence microscopy: application to actin polymerization and membrane fusion. Biophys J. 101, 1794-1804 (2011).
  27. Stratton, B. S., et al. Cholesterol Increases the Openness of SNARE-mediated Flickering Fusion Pores. Biophysical journal. 110, (2016).
  28. Diao, J., et al. Synaptic proteins promote calcium-triggered fast transition from point contact to full fusion. Elife. 1, e00109 (2012).
  29. Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophys J. 99, 4047-4055 (2010).
  30. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  31. Washbourne, P., et al. Genetic ablation of the t-SNARE SNAP-25 distinguishes mechanisms of neuroexocytosis. Nat Neurosci. 5, 19-26 (2002).
  32. Diaz, A. J., Albertorio, F., Daniel, S., Cremer, P. S. Double cushions preserve transmembrane protein mobility in supported bilayer systems. Langmuir. 24, 6820-6826 (2008).
  33. Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
  34. Albertorio, F., et al. Fluid and air-stable lipopolymer membranes for biosensor applications. Langmuir. 21, 7476-7482 (2005).
  35. Daniel, S., Albertorio, F., Cremer, P. S. Making lipid membranes rough, tough, and ready to hit the road. Mrs Bulletin. 31, 536-540 (2006).
  36. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337, 1340-1343 (2012).
  37. Kenworthy, A. K., Hristova, K., Needham, D., Mcintosh, T. J. Range and Magnitude of the Steric Pressure between Bilayers Containing Phospholipids with Covalently Attached Poly(Ethylene Glycol). Biophys J. 68, 1921-1936 (1995).
  38. Knoll, W., et al. Solid supported lipid membranes: New concepts for the biomimetic functionalization of solid surfaces. Biointerphases. 3, Fa125-Fa135 (2008).
  39. Quinn, P., Griffiths, G., Warren, G. Density of newly synthesized plasma membrane proteins in intracellular membranes II. Biochemical studies. J Cell Biol. 98, 2142-2147 (1984).
  40. Sund, S. E., Swanson, J. A., Axelrod, D. Cell membrane orientation visualized by polarized total internal reflection fluorescence. Biophys J. 77, 2266-2283 (1999).
  41. Johnson, D. S., Toledo-Crow, R., Mattheyses, A. L., Simon, S. M. Polarization-controlled TIRFM with focal drift and spatial field intensity correction. Biophys J. 106, 1008-1019 (2014).
  42. Anantharam, A., Onoa, B., Edwards, R. H., Holz, R. W., Axelrod, D. Localized topological changes of the plasma membrane upon exocytosis visualized by polarized TIRFM. J Cell Biol. 188, 415-428 (2010).
  43. Axelrod, D. Carbocyanine dye orientation in red cell membrane studied by microscopic fluorescence polarization. Biophys J. 26, 557-573 (1979).
  44. Wang, T., Smith, E. A., Chapman, E. R., Weisshaar, J. C. Lipid mixing and content release in single-vesicle, SNARE-driven fusion assay with 1-5 msec resolution. Biophys J. 96, 4122-4131 (2009).
  45. Chernomordik, L. V., Frolov, V. A., Leikina, E., Bronk, P., Zimmerberg, J. The pathway of membrane fusion catalyzed by influenza hemagglutinin: restriction of lipids, hemifusion, and lipidic fusion pore formation. J Cell Biol. 140, 1369-1382 (1998).
  46. Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127, 831-846 (2006).
  47. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
  48. Scott, B. L., et al. Liposome fusion assay to monitor intracellular membrane fusion machines. Methods Enzymol. 372, 274-300 (2003).
  49. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
  50. Soumpasis, D. M. Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments. Biophys J. 41, 95-97 (1983).
  51. Ohki, S. A mechanism of divalent ion-induced phosphatidylserine membrane fusion. Biochim Biophys Acta. 689, 1-11 (1982).
  52. Berquand, A., et al. Two-step formation of streptavidin-supported lipid bilayers by PEG-triggered vesicle fusion. Fluorescence and atomic force microscopy characterization. Langmuir. 19, 1700-1707 (2003).
  53. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophys J. 47, 105-113 (1985).
  54. Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophys J. 101, L37-L39 (2011).
  55. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Reconstituted syntaxin1a/SNAP25 interacts with negatively charged lipids as measured by lateral diffusion in planar supported bilayers. Biophys J. 81, 266-275 (2001).
  56. Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. Formation of Supported Planar Bilayers by Fusion of Vesicles to Supported Phospholipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 1103, 307-316 (1992).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Nikolaus, J., Karatekin, E. SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy. J. Vis. Exp. (114), e54349, doi:10.3791/54349 (2016).

View Video