cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) proviennent de (hemogenic) des cellules endothéliales spécialisées au cours du développement, mais on sait peu sur le processus par lequel certaines cellules endothéliales spécifient pour devenir la formation du sang. Nous démontrons une méthode basée sur la cytométrie de flux permettant l'isolement simultané des cellules endothéliales hemogenic et HSPC de tissus embryonnaires murines.
La spécification des cellules endothéliales hemogenic de l'endothélium vasculaire embryonnaire se produit pendant de brèves périodes de développement dans les tissus distincts, et est nécessaire pour l'émergence de HSPC définitive du sac murine supplémentaire embryonnaire jaune, le placenta, les vaisseaux ombilicaux, et l'aorte-gonades-mésonéphros embryonnaires ( région AGM). La nature transitoire et la petite taille de cette population cellulaire rend son isolement reproductible pour la quantification soigneuse et des applications expérimentales techniquement difficile. Nous avons établi une cellule activé par fluorescence (FACS) protocole à base pour l'isolement simultané des cellules endothéliales hemogenic et HSPC pendant leurs temps de génération de pointe dans le sac vitellin et AGM. Nous démontrons méthodes de dissection du sac vitellin et les tissus AGM à partir d'embryons de souris, et nous présentons optimisés digestion des tissus et de conjugaison d'anticorps conditions pour la survie cellulaire maximale avant l'identification et la récupération via FACS. Représentant FACS anaparcelles de lyse sont présentés qui identifient la cellule endothéliale hemogenic et phénotypes HSPC, et décrivent un dosage à base de méthylcellulose pour évaluer leur sang potentiel de formation à un niveau clonal.
Un système de circulation fonctionnelle requiert le développement parallèle des vaisseaux sanguins et des cellules sanguines. Aux premiers stades du développement de sang (hématopoïèse primitive), l'origine des érythroblastes reste débattue vigoureusement 1. En revanche, à des stades ultérieurs du développement des cellules sanguines (hématopoïèse définitive), il est devenu de plus en plus clair que multi-lignage HSPC proviennent de cellules spécialisées vasculaires endothéliales qui acquièrent hématopoïétiques (cellules hemogenic endothéliales) potentiels dans le sac vitellin, le placenta, et AGM 2-5, ainsi que dans la vitelline et vaisseaux ombilicaux, l'endocarde embryonnaire 6, et la tête vasculature 7. La spécification des cellules endothéliales hemogenic au sein de ces tissus distincts se produit à des stades spécifiques du développement; par exemple, dans la vésicule ombilicale à ~ E8.25 et dans l'assemblée générale annuelle à ~ E10 8-12. Néanmoins, même au cours de ces fenêtres de développement spécifiques, la population de endo hemogeniccellules thelial représente une petite fraction de toutes les cellules endothéliales (1 – 3% du sac vitellin et les cellules endothéliales AGM) 11,12. Le processus de la cellule "spécification" endothéliale hemogenic est critique pour murin, ainsi que l'homme, de l'hématopoïèse. Les cellules hématopoïétiques ont été représentés à bourgeonner à partir de l'endothélium des vaisseaux du sac vitellin et l'aorte d'embryons humains 13 et plusieurs laboratoires ont montré que la production de cellules sanguines à partir de cellules souches pluripotentes humaines exige une cellule endothéliale intermédiaire 14-16. Ainsi, la définition du phénotype des cellules endothéliales murines hemogenic et la compréhension des événements moléculaires qui mènent à leur développement dans ce modèle animal devrait faciliter la poursuite des technologies in vitro pour la production de cellules endothéliales hemogenic à partir de cellules souches pluripotentes humaines. À son tour, le développement éventuel d'une approche pour la production à grande échelle de types de cellules sanguines différenciées de multi-lignée HSPC – se derived à partir de cellules souches pluripotentes humaines par l'intermédiaire d'une cellule endothéliale hemogenic physiologiquement pertinente intermédiaire – aurait un potentiel thérapeutique incroyable pour hématologique, oncologique et la médecine régénérative. Pour atteindre cet objectif, nous avons défini le phénotype des cellules endothéliales hemogenic, à un niveau clonal, dans le jaune murin sac 11 et AGM 12, deux sites majeurs de production HSPC définitive au cours de l' embryogenèse. Comme HSPC dans les adultes de la moelle osseuse 17, les cellules endothéliales hemogenic embryonnaires et HSPC exposition Hoechst propriétés colorant d'efflux et donc apparaître dans la «population de côté» (SP) des cellules sur un terrain FACS 5,11,12 (comme le montre la figure 3). En outre, nous avons également montré que les cellules endothéliales hemogenic expriment des marqueurs des deux endothéliales et les cellules souches (et Flk1 CKIT, respectivement), mais n'expriment le marqueur de lignée hématopoïétique CD45 5,11,12. Ainsi, les cellules endothéliales hemogenic peuvent être identified et isolés par FACS comme cellules Flk1 + / cKit + / CD45- SP, et nous avons montré que ces cellules donnent naissance à des HSPC contenu dans la / cKit + / CD45 + SP fraction Flk1- du sac vitellin et les cellules AGM 5,11,12. Les cellules endothéliales Hemogenic et HSPC peuvent être identifiés et isolés du sac jaune ou tissus AGM récoltées à partir soit des embryons fraîchement euthanasiés, ou à partir d' embryons cultivés pendant 48 heures en culture ex vivo de l' embryon (comme représenté sur la figure 1). La culture ex vivo permet sélective pré-traitement des embryons individuels avec des agents pharmacologiques, et permet également l' expression transitoire de transgènes souhaités ( par exemple, par transduction lentivirale). l'identification FACS des cellules endothéliales et hemogenic HSPC par le procédé décrit ici peut être utilisé comme une mesure quantitative du développement hématopoïétique définitif dans des modèles murins génétiquement modifiés; les cellules peuvent également être récupérées pour des applications expérimentales ultérieures, y compris le sang-foessais rmer, analyse de l'expression, et la transplantation.
Matières animales: Usages et considérations éthiques
Un nombre croissant d'études a établi la contribution importante des cellules endothéliales hemogenic à la formation HSPC pendant la phase de l'hématopoïèse définitive du développement embryonnaire. Pourtant, les conditions physiologiques et des signaux qui favorisent la spécification d'une sous – population de cellules endothéliales vers un destin hemogenic restent mal connus, et donc ne peuvent pas encore être imitées dans un cadre in vitro. En effet, les techniques décrites dans le présent document sont actuellement utilisées par notre laboratoire et d' autres groupes afin d' améliorer la compréhension du domaine du développement hematovascular, telles qu'une approche pour la spécification des cellules ex vivo hemogenic endothéliales et la production HSPC pourrait être développé un jour. Jusqu'à ce moment, cependant, le champ reste dépendant de tissus primaires de type sauvage (et gène) des embryons de souris tiquement modifiés pour obtenir spécifiées cellules endothéliales hemogenic et HSPC pour une étude plus approfondie. Les cellules endothéliales Hemogenic et HSPC peuvent être identifiés de façon fiable et isolés soit E8.5 (10 – 12 paires de somites) jaune sac ou E10.5 (35 – 40 paires de somites) AGM 11,12. En raison de la rareté relative des cellules endothéliales hemogenic (représentant typiquement 1 – 3% du nombre total de cellules endothéliales 11,12 au sein de ces tissus) , la mise en commun des tissus provenant de multiples (~ 8 – 10) littermates dans un seul échantillon est fortement recommandé afin de obtenir suffisamment de cellules pour une expérimentation ultérieure. Vérifier que les cellules endothéliales et hemogenic HSPC ont été identifiés et isolés avec succès peut être réalisée par culture de cellules récupérées dans des conditions qui induisent la différenciation hématopoïétique. Dans ces conditions, les cellules endothéliales et hemogenic HSPC présenteront une différenciation hématopoïétique lignées multiples, ce qui entraîne l'apparition de colonies contenant eryprogéniteurs Throid (BFU-E), granulocytes et de macrophages progéniteurs (CFU-GM), et granulocytes, érythrocytes, macrophage, colonies de mégacaryocytes progénitrices (CFU-GEMM).
Il reste de nombreuses questions sans réponse dans le domaine du développement hematovascular – un domaine qui est encore à ses débuts en raison des difficultés techniques inhérentes à l'étude des populations cellulaires transitoires et petits qui émergent seulement pendant des périodes de développement spécifiques. Les techniques décrites ci-dessus améliorent beaucoup de ces difficultés en permettant l'isolement des cellules, même simples à partir de la cellule endothéliale hemogenic et populations HSPC dans les tissus embryonnaires à des moments critiques du développement en utilisant des réactifs et du matériel qui sont généralement disponibles dans la plupart des laboratoires. Notre protocole permet également l'isolement parallèle de non-hemogenic fractions de cellules endothéliales de la YS et AGM, qui peuvent être utilisées pour des analyses indépendantes, soit en tant que témoins pour la fraction de cellules endothéliales hemogenic dans les analyses ultérieures.
Un point clé dans l'isolement des cellules endothéliales hemogenic utilisant cette méthode à base de FACS-multicolor est co spectrale appropriéempensation et dessin précis des portes d'une seule couleur. En tant que tel, il est fortement recommandé que les contrôles de couleur simple unstained et être inclus dans tous les essais expérimentaux, et qu'ils – ainsi que des échantillons traités avec des anticorps de contrôle isotype – être utilisé pour établir d'abord une compensation spectrale appropriée et le dessin des portes. Cependant, la coloration non spécifique est minime par ce protocole, donc les contrôles non colorées et une seule couleur sont suffisantes pour la vérification de routine des portes une fois les paramètres de trieur FACS ont été optimisés.
portes SP inexactement tirées sont une préoccupation particulière à l'approche décrite dans le présent rapport. Des études antérieures ont montré que des cellules souches multipotentes présentent efflux préférentielle de Hoechst rouge 17, formant la base physiologique de leur apparition dans le PS par FACS. Nous avons montré que les cellules endothéliales hemogenic et HSPC se trouvent de même au sein de la fraction de cellules SP 5,11. Des médicaments tels que le canal de calciumhibitor vérapamil bloquer ce comportement colorant Hoechst efflux dans des cellules SP par l'intermédiaire d'un blocage d'une variété de transporteurs transmembranaires multirésistantes de résistance. Dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques, cela se produit principalement par le transporteur ABCG2 / BCRP1 24. Typiquement induit vérapamil> 50% blocage de la SP, cependant, le degré global de Hoechst efflux et son blocage ultérieur par vérapamil vu a été montré pour être affecté par le calendrier de développement, probablement en raison de changer l'expression de types de transporteurs multirésistantes multiple avec différentiel Hoechst la capacité d'efflux, et la sensibilité à Verapamil 5. Ainsi, il est fortement recommandé que le vérapamil-traité Hoechst teinté contrôle négatif être en standard inclus pour assurer gating SP bon: si une porte de SP est bien établi, une réduction notable du nombre de cellules SP doit être détecté dans des échantillons colorés avec Hoechst en la présence de vérapamil.
Nous avons précédemment montré que triéCellules SP du sac E9.5 murin de jaune d'œuf ont ~ 80-90 fois plus grande capacité à générer HSPC dans une culture hématopoïétique à base de méthylcellulose, par rapport à un nombre adapté de E9.5 non fractionnée, non Hoechst colorées des cellules de tissu YS ensemble 5. Une caractérisation plus poussée du PS a montré que dans la vésicule ombilicale de souris pendant hématopoïétique précoce et le développement vasculaire à E8.0, il y a expression appréciable de la VE-cadhérine et Flk-1, mais une faible expression de tige (c-Kit) et des marqueurs hématopoïétiques (CD45). Ainsi, à ce point de temps de développement, primordiale (non hemogenic) CE, définie comme étant Flk-1 + / CD31 + / CD45- des cellules non SP prédominent. Ce profil d'expression des changements que l' expression du marqueur endothélial diminue et CD45 et c-Kit expression augmente, concomitante avec une capacité croissante à générer HSPC in vitro entre E9.5 et E11.5 5. Ceci suggère une activité hématopoïétique de tissu YS est contenu dans le SP, devenant ainsi la plus apparente entre E9.5 et E11.5, et se déclareraitment par une perte temporisée des caractéristiques endothéliales et l'acquisition progressive de la capacité hématopoïétique. En tant que tel, l' expression des transporteurs de multirésistance qui donnent naissance au phénotype SP sont un élément important marqueur phénotypique de l' endothélium hemogenic 5; en fait, les cellules non-SP de l'AGA ne présentent pas de sang potentiel de formation 12. Ainsi, l'isolement réussi de la SP par coloration de Hoechst dans les deux YS et AGA en sorte que les cellules seront triées de hématopoïétique compartiment des cellules souches d'un tissu donné, et après la coloration d'anticorps de cellules au sein de cette fraction permettant la discrimination de l'hemogenic (Flk -1 + / c-kit + / CD45-) versus HSPC (Flk1- / c-kit + / CD45 +) populations 5,11,12. En outre, il a été noté précédemment que CD41 + cellules du SP du sac vitellin et les tissus AGM sont capables de former des colonies de lignées multiples dans de la méthylcellulose culture à base 11,12. Nous définissons les cellules endothéliales hemogenic comme Flk1 + c-Kit + cellules CD45- SPs en utilisant CD45 comme marqueur désigné de la lignée hématopoïétique plutôt que CD41 donné notre constatation que l' expression de Flk1 et CD45 est pratiquement mutuellement exclusifs 5,11. Cela permet à un pur isolement de cellules au sein de la SP qui ont tous deux endothéliale (Flk-1) et la tige caractéristiques (c-Kit) nécessaires à l'endothélium de transition hématopoïétique mais qui n'ont pas encore fait l'objet de ce changement, tel que déterminé par l'absence de CD45 dans ces cellules. Il serait utile d'envisager de sous-fractionnement de la population HSPC, définie comme cellules Flk-1- / c-Kit + / CD45 + / SP, en CSF1R + (de macrophage tissulaire) et Csf1r- (HSC) fraction récemment rapporté par Gomez et ses collègues 25, car cela offrirait une plus grande résolution de la véritable HSPC contre les populations macrophage tissulaire progénitrices, mais cela ne devrait pas affecter l'intégrité de la fraction des cellules endothéliales hemogenic dont l' isolement , nous avons décrit depuis CSF1R est un marqueur de progéniteurs macrophage 26.
Hemogles cellules endothéliales ENIC sont une sous-population rare dans les deux YS et AGM (comprenant: 1 – 3% des cellules endothéliales), et donc un défi majeur dans leur étude est le rendement cellulaire insuffisante pour des applications ultérieures. Ce protocole se traduit généralement par 70-80% des cellules restantes viables au moment du tri, et une sorte de cellule typique hemogenic endothéliales à partir de tissus obtenus à partir de mises en commun plusieurs embryons peut donner seulement quelques centaines de cellules, même dans des conditions optimales avec seulement 10-20% des cellules incorporées dans des colonies produisant de méthylcellulose récupérées. Afin de maximiser le nombre de cellules triées, il est fortement recommandé que les enquêteurs prennent des mesures pour assurer le tissu et la viabilité des cellules à travers toutes les étapes de la procédure: les tissus doivent être disséqués rapidement et mis en commun, et les échantillons doivent être conservés dans la glace chaque fois que possible. Les échantillons doivent être préparées immédiatement avant tri FACS, et triées dans des tubes de collecte contenant le contenu sérique élevé, ou directement dans la culture de la méthylcellulose comme décritd ci-dessus. Si des problèmes de viabilité persistent, les tubes de prélèvement peuvent également être pré-revêtues avec du sérum pour améliorer encore la survie des cellules triées. Si le rendement des cellules endothéliales hemogenic reste faible, de l'os adulte disponibles dans le commerce des perles de fluorophores conjugués moelle osseuse ou peuvent être utilisés pour une compensation spectrale au lieu des commandes de couleur unique dérivées du tissu embryonnaire décrits ici. Si les cellules triées sont destinés à la culture, les cellules endothéliales hemogenic et HSPC doivent être triés directement dans des puits de culture de tissu. Si les cellules triées sont destinées à l'ADN ou le gène analyse de l'expression liée à l'ARN, les cellules endothéliales et non hemogenic hemogenic et HSPC peuvent être triés directement dans les tubes de prélèvement contenant des échantillons de tampon de lyse pour réduire la perte cellulaire.
La technique décrite permet de succès (et simultanée) l'isolement des cellules endothéliales et non hemogenic hemogenic, ainsi que HSPC et de cellules sanguines matures à partir des mêmes fractions des tissus embryonnaires. Cette approche permet en outre study des fondements moléculaires des transitions critiques qui se produisent comme les cellules endothéliales produisent du sang. Enseignements tirés de ces études sur le développement peuvent ensuite être utilisées pour optimiser la génération de cellules endothéliales humaines et de HSPC hemogenic descendance de pluripotentes et potentiellement autologue, des cellules souches pour le traitement des troubles hématopoïétiques courants.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) | Sigma | D5942 | TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling. |
Absorbent bench underpad | Covidien | 7134 | |
#5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
8.5cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | TOXIC inhalant: Use in fume hood. |
100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000u/mL Penicillin, 10,000mg/mL Streptomycin, 29.2mg/mL L-glutamine) | Invitrogen | 10378016 | |
Type II Collagenase | Worthington | LS004174 | |
Falcon 70uM nylon cell strainer | Corning | CLS431751 | |
Anti-Mouse CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | |
Anti-Mouse CD31 – PE | eBioscience | 12-0311-81 | |
Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 561259 | |
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma | 14533 | TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25mg/mL in distilled H2O, store aliquots at -20C until ready for use |
Verapamil Hydrochloride | Sigma | 1711202 | TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling. Prepare stock solution of 5mM (100X) in 95% ethanol. Store at -20C until ready for use |
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
MethoCult GF M3434 | Stem Cell Technologies | 3434 | Thaw and aliquot per manufacturer's instructions |
Modified Giemsa Stain | Sigma | GS500 | TOXIC: Contains Methanol – use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution. |
Cytospin Centrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
Clipped Funnel Starter Kit | Thermo Scientific | 3120110 | Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge |
Anti-Mouse B-220 – FITC | BD Pharmingen | 553088 | |
Anti-Mouse Gr-1-FITC | eBioscience | 11-5931-85 | |
Anti-Mouse Ter-119-FITC | eBioscience | 11-5921-85 | |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 10437-077 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5g/L) | Life Technologies | 11965-092 | |
Hank's Buffered Salt Solution | Life Technologies | 14175-095 | |
Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate | EMD Millipore | PIFB24P05 | |
IgG2A-PE | BD Pharmingen | 553930 | |
IgG2B-FITC | BD Pharmingen | 556923 |