Выделение мышиной эмбриональных кроветворных эндотелиальных клеток

Заявление по этике: Протокол приводится ниже был рассмотрен, и в соответствии с руководящими принципами, Institutional Animal Care Йельского университета и использование комитета. 1. Всего Эмбрион Ex V Иво Культура для желтка исследований (Необязательно) Эвтаназии беременных плотин на E7.0 – E7.5, и удаления рогов матки в стерильных условиях, как описано более подробно ниже (шаги 2.4 – 2.7). Отдельные целые эмбрионы (с желтка неповрежденной 12) от окружающих децидуальной и приостановить в 50 мл цельной сыворотки крысы в 50 мл полистирольные пробирки. Газовый эмбрион бутылки в течение 3 мин с 5% CO 2 немедленно , как описано выше 12,18. Повторите этот шаг через 24 часа, если культивирование эмбрионов в течение 24 – 48 часов. Выдержите в прокат 37 ° C культуру до 48 часов. Примечание: Эмбрионы можно лечить экс виво с фармакологическими агентами (например, ингибитор Notch DAP.Т – 12) или растворимые белки (т.е. фибронектин 19) посредством предварительной инкубации эмбрионов в течение до 2 часов в культуральной среде , содержащей такие факторы, или за счет добавления этих факторов в прокатном культуральной среде в течение всего периода экс виво культуры период. Экспрессия гена можно манипулировать в эмбрионах путем предварительной инкубации эмбрионов с оптимальным образом титруют лентивирусов в течение 2 ч 12. Желток мешка сосудистой и развитие гемопоэтических можно наблюдать в режиме реального времени с использованием трансгенных мышей, репортер и методы оптических изображений. 2. Рассечение желтка (YS) или аорто-гонады-мезонефроса (AGM) из эмбрионов мыши Стерилизовать лабораторном столе путем распыления и протирки все поверхности с 70% этанола, чтобы уменьшить загрязнение в последующих клеточных культурах. Поместите впитывающую на лежащей снизу поверхности лабораторного стола. Стерилизовать хирургических инструментов с 70% этанола. Рекомендуемые хирургические инструменты два # 5 прямая силапс, и один 8,5 см прямые ножницы. При работе с эмбрионами из бывшей культуры естественных условиях, тщательно удалить целые эмбрионы из 50 мл пробирки Фалкон и немедленно перейти к шагу 2.8. В противном случае, пропустите этот шаг и перейдите к шагу 2.4. Эвтаназии беременной плотины в соответствующем эмбрионального возраста (E8.5, если уборочных YS; E10.5 если заготовка AGM). Примечание: Описанный метод использует двойной метод эвтаназии подход – смертельная дозировка летучего анестетика с последующим механическим смещением шейных позвонков – минимизировать животных боль и страдания, а также обеспечить минимально инвазивной и гуманного прекращения субъектов животных. Этот комбинированный метод для небольшого грызуна эвтаназии Американской ветеринарной медицинской ассоциации рекомендуется при исполнении квалифицированным и опытным исследователем (АВМА Методические рекомендации по эвтаназии животных: 2013 Edition). Обезболить мышь , используя смертельную дозу изофлуран (> 5% в O 2) в течение 3 – 5 мин. (CAUTION: Isoflurane является токсичным ингаляционное; использовать при химическом вытяжном шкафу с соответствующими средствами индивидуальной защиты органов дыхания оборудования.) После облучения мышей к изофлуран, проверить по крайней мере три признаки анестетика уровня – потеря рефлекса выпрямления, потеря пальца ноги пинч рефлекса и снижению частоты дыхания – обеспечение субъектов достигли глубокого обезболивающий плоскости перед продолжением механической эвтаназии. Цервикально вывихнуть дамбу, чтобы быстро вызвать смерть. Поместите эвтаназии плотины лежа на спине на лежащей снизу и обильно опрыскивать нижнюю часть живота с 70% этанола. Сделайте вертикальный разрез по средней линии нижней части брюшной стенки. Сделайте дополнительные ~ 1 дюйм горизонтальные надрезы расширения вправо и влево от средней точки вертикального разреза, и отсечь брюшной стенки, чтобы полностью раскрыть правый и левый рога матки каждая из которых содержит несколько супоросные эмбрионов. Использование щипцов, удерживая одну из двух рогов маткии использовать ножницы, чтобы отделить его от mesometrium. Поместите расчлененный матка на льду в стерильной Хэнка сбалансированный солевой раствор (HBSS) в полистироле культуре ткани пластины 60 мм. Повторите эти действия для другого рога матки. Под стандартным светом микроскопом рассекает, используйте пинцет, чтобы отстраниться мышечный слой матки мешочке, чтобы выявить основные плодного яйца и децидуальной. Изолировать YS (рис 2A), осторожно снимая мешка с прилагающегося эмбриона. Удалить YS ткани из собственно эмбриона в эмбриональном происхождении желточных сосудов. Для того, чтобы изолировать AGM, удалите YS и секут эмбрион ниже уровня сердца и конечностями и отбросить грудной клетки и области головы. Далее, секут эмбрион чуть ниже уровня задних конечностей и удалить и выбросить хвост ткани. Удалить задних конечностей и избыток вентральной ткани от оставшейся части, которая содержит AGM (Фигура 2В). Бассейн YS или AGM ткани из нескольких эмбрионов и хранитьна льду в HBSS + (HBSS, с добавлением 10% (об / об) фетальной бычьей сыворотки и 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 0,3 мг / мл L-глутамина) в чистую 1,5 мл трубки. 3. Расщепление первичной ткани в одноклеточной суспензии Центрифужную пробирку, содержащую заготовленные YS или AGM ткани в течение 5 мин при 2000 х г при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют ткани в 1 мл либо 0,05% (для YS) или 0,2% (для AGM) коллагеназы типа II, разбавленным HBSS +. Инкубировать в течение 30 мин на водяной бане при 37 ° С, инвертирование трубку каждые 5 минут, чтобы перемешать. Осторожно механически диссоциируют ткани путем пропускания пробы 10 раз через P1000 пипетки. Если возникли трудности с аспирационной частично переваренной ткани, пипетка отверстие наконечника может быть расширена за счет отрезав ~ 5 мм наконечник с парой ножниц. Центрифуга образец в течение 5 мин при 2000 х г при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют в 1 мл охлажденного льдом HBSS +. Пропустите образец через 70 &# 956; м ячейка ситечко. Граф клеток с помощью ручного или автоматизированного гемоцитометра. Центрифуга образец в течение 5 мин при 2000 х г при 4 ° С. Ресуспендируют образца в DMEM + (4,5 г / л глюкозы Дульбекко в модификации Дульбекко с добавлением 10% (об / об) фетальной бычьей сыворотки и 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, и 0,3 мг / мл L-глутамина) пред- нагревают до 37 ° с, что клетки находятся в конечной концентрации 1 × 10 6 клеток / мл. 4. Обработка клеток с Нуклеиновой Кислоты Dye и мечение флуоресцентно сопряженными АНТИТЕЛ Алиготе , по меньшей мере 100 мкл образца (1 × 10 5 клеток) в свежую 1,5 мл пробирки для инкубации антител. Включите следующую пробу и необходимые контрольные трубки: неокрашенные; только cKit-APC; только CD45-FITC; только CD31-PE; только Flk1-PECy7; Hoechst 33342 только; Hoechst 33342 только + верапамил; Образец (принимает все цвета, не получат верапамил). Используйте минимум 1 × 10 <sup> 5 клеток в 100 мкл для контрольных трубок. Примечание: больший объем клеток, могут быть добавлены в пробирку с пробой при той же концентрации, чтобы иметь максимальный выход отсортированной гемогенного EC и HSPC. Добавить Верапамил разводили в 95% этаноле (обсуждение см для обоснования) к "Hoechst 33342 только + верапамилом" контрольную пробирку до конечной концентрации 50 мкМ. Инкубируйте все пробирки в течение 5 мин при 37 ° С. (ВНИМАНИЕ: Верапамил является мощным кальциевых каналов блокирующий агент и является чрезвычайно токсичным Handle с перчатками.). Добавить Hoechst 33342 в "Hoechst только 33342" контроль, к + верапамила только для управления Hoechst 33342, а к "Sample" трубы до конечной концентрации 5 мкг / мл. Инкубируйте все пробирки в течение 1 ч при 37 ° С, в защищенном от света месте. Аккуратно взболтайте каждые 15 мин. (ВНИМАНИЕ: Hoechst 33342 является токсичным ядерным красителем и должны быть обработаны в перчатках). Центрифуга все SAMPле в течение 5 мин при 2000 х г при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют клеточный осадок при концентрации 1 × 10 5 клеток / мл в холодном HBSS +. Добавить флуоресцентно конъюгированных антител к соответствующим антителом только трубках управления, и к "образец" трубы до конечной концентрации 2 мкг / мл. Инкубировать на льду в течение 30 мин, защищенном от света месте. Центрифуга все пробирки в течение 5 мин при 2000 мкг при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл охлажденного льдом HBSS. Образцы процедить через сетчатый фильтр колпачок 5 мл полистирола с круглым дном FACS труб и хранить на льду, защищенном от света месте, для немедленного FACS. 5. Идентификация и выделение кроветворных эндотелиальных клеток и HSPC путем FACS Примечание: Этот протокол был оптимизирован с использованием 5-лазерной системы BD FACSAria оснащенный 100 мВт УФ-лазера 355 нм, 200 мВт 405 нм Фиолетовый лазер, 200 мВт 488 нм Синий лазер, 200 мВт 532 нм Зеленый лазер, и 150 мВт 637 нм красныйлазер. Клетки были рассортированы в стерильной PBS в качестве оболочки жидкости и в асептических условиях, а также через сопла 100 мкм со скоростью потока, установленным на давление образца 1 таким образом, что максимум 1500 – 2000 событий приобретаются в секунду, чтобы свести к минимуму клеточный стресс. В соответствии с этими настройками, описанных выше, используйте "незапятнанным" и отдельных трубок управления цветом для оптимизации FACS Клеточный сортер интенсивности лазерного излучения и выполнять многоцветную контроль спектральной компенсации в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте вперед и боковое рассеивание для выполнения живой клетки и дублета дискриминацию от общих событий (см инструкции производителя для получения более подробной информации). Примечание: Этот протокол, как правило, приводит к ~ 70 – 80% жизнеспособных клеток. В случае возникновения проблем с низкой жизнеспособности клеток, убедитесь, что ткани первоначально рассеченные быстро ледяным СМИ, и что все шаги, за исключением тех, в противном случае указания выполняются на льду, с нежным пипеткой, чтобы свести к минимуму сдвиговой и клеточную смерть(См Обсуждение для более подробно о сохранении жизнеспособности клеток). С помощью дифференциального линейного масштаба участок Hoechst Красные против Hoechst голубой флуоресценции для идентификации на стороне населения (SP) события (рис 3А). Используйте контроль "Хехст 33342 только + верапамил" в качестве отрицательного контроля, чтобы убедиться в том, что ворота нарисовано для образца. SP появится в виде плеча слева от не-SP клеток, и будет уменьшена в Верапамил обработанного контроля. Популяция не-СП будет использоваться для идентификации , не гемогенного EC (фигура 3В). Создание дополнительных участков дифференциальной флуоресценции (срубы масштаба осей) и рисовать дочерние ворота из СП для идентификации кроветворных эндотелиальные клетки (рис 3C-E). Примечание: гемогенного эндотелиальные клетки профилированный как клетки Flk1 + / cKit + / CD45- SP (Рисунок 3D), и HSPC являются Flk1- / cKit + / CD45 + SP клетки (рис 3e). Гемогенного эндотелиальной гргезов можно анализировать параллельно с не-кроветворных эндотелиальных клеток, которые определены в данном подходе как CD31 + / CD45- клетках не-SP (фигура 3В). Получение гемогенного клетки эндотелиального или HSPC фракции на метилцеллюлозы, содержащей пластины для кроветворной культуры (см ниже), или в другие буферы для последующей обработки и анализа. 6. гемопоэтических Дифференциация в культуре Добавить 0,5 мл (135 мкл / см 2) на основе метилцеллюлозы кроветворную культуральных сред желаемое количество лунок 24-луночного планшета для культуры ткани при комнатной температуре. Добавить 0,5 мл стерильной воды в неиспользуемые лунки, чтобы минимизировать испарение. Подготовить свежие и держать при комнатной температуре до использования. Сортировка 1 – 10 ячеек для клонального анализа, или до 1000 гемогенного эндотелиальные клетки (Flk1 + / cKit + / клетки CD45- SP) или HSPC (клетки Flk1- / cKit + / CD45 + SP) для расширения объемной и дифференциации непосредственно в каждую лункупластина, содержащая метилцеллюлозы. Образование колоний обнаруживается приблизительно у 10 – 20%. В стерильной капот культуры ткани, используйте кончик P1000 с наконечником подстриженной расширить свое отверстие, аккуратно ресуспендируют каждую лунку посеянных метилцеллюлозы СМИ 2 – 3 раза, следя за тем, чтобы избежать создания пузырьков. Это обеспечивает приостановку отсортированных клеток в полужидком метилцеллюлозы для оптимального роста. Инкубируйте планшет при 37 ° С с 5% CO 2 в течение до 2 -х недель. Монитор одиночных клеточных культур для формирования дифференцированных гемопоэтических колоний клеток с течением времени (рисунок 4). Оценка лунок для числа и типа дифференцированных гематопоэтических колоний в дни 1, 3, 7 и 14 с помощью метода (ов), описанной ниже в пункте 6.7. Оценка пластины на 1-й день, чтобы подтвердить слитности и жизнеспособность отсортированных клеток. По 3-й день, проверить для раннего формирования прикрепленных кроветворных колоний эндотелиальных клеток с "Брусчаткатон "морфологии (см Голди и др. , 11 и Марсело и др. 12 для представления 3 -й день морфологии). По дням 5 – 7, проверьте для формирования закругленных кластеров HSPC в скважинах, содержащих отсортированный гемогенного EC. HSPC должны соблюдаться рядом с сплющенные гемогенного EC, отображающее "булыжник" морфологии эндотелиальных клеток. Примечание: гемогенного эндотелиальные клетки должны образовывать гемопоэтические колонии (определяемые кроветворной числом колоний), и должны продемонстрировать способность дифференциации нескольких клонов (определяют путем наблюдения нескольких типов колоний из одной клетки). Ранее мы наблюдали , что ~ 20% гемогенного EC или HSPC извлекается FACS выживают с образованием дифференцировки и пролиферации гемопоэтических колоний в метилцеллюлозы 11. Для оценки образования колоний путем фазовой микроскопии: Визуализируйте и подсчета колоний при небольшом увеличении ундэр фазы световой микроскоп, и идентифицировать BFU-E, CFU-GM и CFU-GEMM колоний по морфологии колоний, как описано Голди и др. 11. Для оценки образования колоний по морфологии клеток: Аспирируйте отдельные колонии из метилцеллюлозы поверхности в кончик P1000 с концом обрезается, чтобы расширить отверстие. Это способствует стремление вязкой метилцеллюлозы среды и обеспечивает успешное извлечение колонии. Ресуспендируют выбрал колонии в 200 мл HBSS и вращение на предметное стекло с помощью цитоцентрифуге при 28 мкг в течение 5 мин. Fix слайдов в 100% метанола в течение 5 мин (Внимание: Метанол является токсичным и должен использоваться только в химической капот с соответствующей вентиляцией и средствами индивидуальной защиты). Погрузитесь слайдов в 0,04% Гимза в течение 20 мин (Внимание:. Гимза содержит метанол используется в химической капюшон с соответствующей вентиляцией и человекааль защитное оборудование). Промыть слайды в деионизированной воде. Крепление сползает с покровные и восприятия изображения при большом увеличении в стандартном оптическом микроскопе, сравнивая морфологии клеток в том, что классически наблюдается в кроветворных клеток из костного мозга взрослого, которые культивируют в средах метилцеллюлозы. Для примеров, пожалуйста, смотрите инструкции производителя. Для оценки образования колоний путем экспрессии в клетках кроветворных маркеров линии дифференцировки по FACS: Добавьте 2 мл HBSS в каждую лунку 24-луночного планшета , содержащую колонии культивировали на 0,5 мл метилцеллюлозы (т.е. разбавить коммерчески доступного запаса метилцеллюлозы 1: 4). Пипетировать вверх и вниз, чтобы смешать, и передать свежую трубку (ами). Образец Центрифуга при 2000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С с использованием стандартной настольной микроцентрифуге. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток (а) в 1 мл HBSS +, объединяя образцы, если это желательно. CentrifuОбразец GE при 2000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток (ы) в 400 мкл HBSS +. Аликвоты образцов в четыре 1,5 мл пробирки следующим образом: неокрашенные; только B220-FITC; GR-1-FITC только; только Ter119-FITC. Добавить флуоресцентно-конъюгированного антитела соответствующую пробирку до конечной концентрации 2 мкг / мл. Инкубируют при 37 ° С в течение 15 мин. Образец Центрифуга при 2000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в охлажденном льдом 0,5 мл HBSS. Анализ каждого образца FACS для экспрессии каждого кроветворной клонального маркера: B220 отмечает B-клетки 20; GR-1 марки миелоидных клеток 21; Ter119 отмечает эритроидных клеток 22. Примечание: Дополнительные антитела, нацеленные на другие маркеры гемопоэтические клональные могут быть включены в этот подход, если это желательно.