This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.
구조화 된 조명 현미경 (SIM) 광학 수퍼 – 해상도 이미징은 화학적 및 생의학에서 분자 수준에서 프로세스의 시각화를위한 핵심 기술이다. SIM 상용 시스템을 사용할 수 있지만, 사용자 상용 시스템을 능가 할 수있는 실험실에서 설계 시스템, 후자는 일반적으로 이미징 정확도와 속도 측면에서 모두 사용 범용 애플리케이션의 용이성을 위해 설계. 이 문서는 내부 전반사 (TIR) 조명을 사용하고, 100 나노 미터에 이르는 해상도 세 가지 색상에 10 Hz에서 최대에 이미징 할 수있는 SIM 시스템을 구축에 대한 심도있는 가이드를 제공합니다. TIRF 때문에 SIM과의 조합으로, 상기 시스템은 경쟁 기술보다 더 나은 이미지 콘트라스트를 제공한다. 이러한 사양을 달성하기 위해, 몇몇 광학 요소들은 가능한 모든 음원 WAV 대한 조명광의 편광 상태와 공간 구조를 통해 자동 제어를 가능하게하는 데 사용되는elengths. 하드웨어 구현 및 제어에 관한 자세한 사항은 최대 포착 프레임 율을 달성을 중시 여기 광 패턴 생성, 파장, 편광 상태, 및 카메라 제어 간의 동기화를 달성하기 위해 제공된다. 시스템 조정 및 교정을위한 단계별 프로토콜이 제시되고 달성 가능한 해상도 개선 이상적인 테스트 샘플에 대해 검증된다. 비디오 레이트 초 – 해상도 이미징 능력은 살아있는 세포로 설명된다.
지난 반 10 년간 슈퍼 해상도 현미경 성숙과 생물학의 손에 전문 광학 연구소에서 움직였다. 상용 현미경 솔루션은 광 초 해상도를 달성하기위한 세 가지 변형이 존재 : 단일 분자 지역화 현미경 (SMLM)는, 배출 플리 현미경 (STED) 및 구조화 된 조명 현미경 (SIM) -1,2- 자극. SMLM는 광 활성화 현지화 현미경 (PALM)과 확률 적 광 재건 현미경 (STORM)와 같은 쉽게 아래로 20 나노 미터로, 주로 인해 광 설치의 단순함과 높은 공간 해상도의 약속, 가장 인기있는 기술이었다. 단일 분자 지역화 비아 다만 초해 현미경 본질적인 절충 제공 : 공간적 해상도가 달성 따라서 시간적 해상도 제한, 개인 형광 지역화 충분한 수의 누적에 의존한다. 영상 역동적 인 과정하나 적절히 또한 이미지를 재구성하는 시간을 충분히 파악 이벤트 획득 동안 움직임 아티팩트를 방지하기 위해 관심있는 구조의 움직임을 샘플링해야하므로 생균의 에스 따라서 문제가된다. 이러한 요구 사항을 충족하기 위해, 생균 SMLM 시연 크게 여기 전력을 증가시킴으로써 형광 단 photoswitching 속도에서 원하는 증가를 수득했고, 이에 의해 샘플의 생존 시간 및 생물학적 관련성 3 제한 광독성 및 산화 스트레스에 차례로 이끈다.
SIM 및 SMLM 모두 이상 STED의 명확한 장점은 약 60 나노 미터의 예 측면 해결을위한 두꺼운 샘플 슈퍼 해상도와 이미지가 120 μm의 4까지 깊이의 Organotypic 뇌 조각에 달성되었다 수 있다는 것입니다. SMLM 또는 SIM의 하나의 목적 구현과 같은 깊이의 영상은 실현성이지만, 단일 분자 광 시트 또는 격자 광 시트 마이크 중 하나를 가능하게roscopy 5. 지금까지보기 (6)의 작은 필드 촬상 한정 하였지만 비디오 레이트 STED 또한 입증과 시냅스 소포 이동성을 매핑하는 데 사용되어왔다.
세포 생물학 및 분자 자기 조립 반응 7에서 응용 프로그램 – 그것은 특정 형광의 광 물리 특성에 의존하지으로 많은 시점에서 높은 시간 해상도를 가진 영상을 필요로 (12), 구조화 조명 현미경 (SIM) 매우 적합 할 수있다 조사. SIM이 고유의 장점에도 불구하고, 지금까지의 사용은 주로 고정 된 세포 또는 천천히 움직이는 프로세스를 이미징 할 국한되었습니다. 이는 시판 SIM 시스템의 제한으로 인해 이러한 상품의 포착 프레임 율이 요구되는 정현파 조명 패턴뿐만 아니라 광학 유지 편광을 생성하기 위해 사용되는 격자의 회전 속도에 의해 제한되었다. 상업 SIM의 최신 세대장비는 빠른 이미징 할 수있다 그러나 그들은 중앙 이미징 시설하지만 모든 엄청나게 비싸다.
이 프로토콜은 살아있는 세포의 기저 표면 얇은 시료와 가까이 빠른 프로세스를 영상화하는가요 SIM 시스템의 구성에 대한 지침을 제공한다. 이 크게 포커스 배경 신호의 출력을 감소 샘플 (13)에없는 깊이 약 150 nm 이하를 관통하는 조명 패턴을 생성하기 위해 전반사 형광 (TIRF)를 이용한다. TIRF와 SIM을 결합의 아이디어는 SIM 자체 (14)만큼이나 오래된하지만 2006 15 전에 실험적으로 실현되지 않았다. 2009 년 튜 불린과 키네신을 시각화하는 11 Hz에서 16 달성 프레임 속도를보고되었다 TIRF-SIM으로 얻어진 생체 내에서 첫 번째 이미지 다이나믹 두 색 TIRF-SIM 시스템 (17, 18)를 제시하고있다. 최근 단색 두 SIM 빔 (S)의 구조 및 사용을위한 지침템은 최대 18 Hz에서 19, 20의 프레임 속도를 특징으로 제시했다.
여기에 제시된 셋업 TIRF-SIM에서 동작 할 수있는 두개의 세 가지 색상, 20 Hz에서 SIM 초 – 해상도 이미징 할 수있다. 전체 시스템은 거꾸로 현미경 프레임 주위 구성 및 압전 구동 Z 스테이지와 전동 XY 번역 단계를 사용합니다. TIRF-SIM에 필요한 사인 여기 패턴을 생성하기 위해 제공되는 시스템은 강유전체의 공간 광 변조기 (SLM)를 사용한다. 이진 격자 패턴이 SLM 상에 표시하고, 생성 된 ± 1 차 회절 여과 중계 대물 렌즈의 TIR 고리에 집중된다. 필요한 위상 변화와 격자의 회전은 표시 SLM 이미지를 변경하여 적용됩니다. 이 프로토콜은, 구축 및 여기 경로를 정렬하는 방법을 설명 방출 경로의 정렬을 자세히 설명하고, 최적의 정렬을 보장하기위한 테스트 샘플을 제공합니다. 또한 해제 편광 제어 및 구성 요소의 동기화 관련 문제 및 고속 TIRF-SIM에 특히 어려움을 스크라이브한다.
디자인 고려 사항 및 제한
이 프로토콜에서 제시된 TIRF-SIM 시스템을 조립하기 전에, 광학 구성 요소의 선택을 결정하는 몇 가지 고려 된 설계 제약이있다. 광학 부품의 모든 약어는 그림 1을 참조하십시오.
공간 광 변조기 (SLM)
이 서브 – 밀리 세컨드 패턴 전환이 가능한 경우 이진 강유전체 SLM이 설정에서 사용된다. 계조 네마의 SLM이 사용될 수 있지만, 이들은 스위칭 시간을 크게 감소 제공. 또는 화소 오프 각 이진 위상 SLM은주기적인 격자 패턴이 격자 상 회절로서 동작 할 SLM에 표시되므로 경우, 입사면의 파면 오프셋 중 하나 π 0 위상을 부여한다.
엔트 "> 총 내부 반사 (TIR)TIR을 달성하고 산장을 생산하는 유리 샘플 계면에서의 여기 빔의 입사각이 임계각보다 커야 . 이 소멸 조명 패턴의 필요한 최소 입사각, 따라서 또한 최대 간격 또는 기간을 설정한다. 최대 입사각 (합격 각도)의 정의로부터 계산 될 수있는 대물 렌즈의 개구 수 (NA)에 의해 제한된다 . 이것은 아베 공식에 따라 달성 가능한 최소 간격 패턴을 결정 NA 파장을 연결하는 최저 패턴 간격을 <imgALT = "식"SRC = "/ 파일 / ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg"/>. 실제로, 1.49 NA 오일 침지 TIRF 목적은 약 79 °의 입사각과의 488 nm의 여기 파장을 사용하여 164 nm 인 샘플 최소 패턴주기의 최대 각도를 산출한다. 이들 두 각도는 악기 TIR 조명 (예. TIR 링)과 한 개의 여진 초점을 정확하게 위치해야 달성 정확하게 각 조명 패턴을 생성하기 위해 회전하는 동안, 대물의 뒤쪽 개구의 환을 정의한다.
TIRF-SIM 이미지 재구성 패턴 회전 당 세 개의 위상 시프트의 최소의 인수 따라서 SLM 패턴주기가 3의 배수이어야 요구 (도 1 참조). 예를 들어, 488 nm의 조명 9 픽셀과 640 nm의 조명 12 화소의 기간. 쉬어 된 회절 격자를 이용하여 간격 패턴의 서브 픽셀을 포함 최적화 SLM 패턴 디자인의 포괄적 대하여는,은 SLM 파장이에서, 모든 파장의 TIR 링 내부에 있어야 ± 1 주문 그러나 회절 각도를 두 여자의 초점의 Kner 등. (16)와 루 – 발터 등. (20) 위치의 이전 작업을 참조하십시오 매달린. 표준 SIM 들면, 다색 화상이 가장 긴 파장에 대한 격자주기를 최적화하고 짧은 채널 성능의 손실을 용인함으로써 달성 될 수있다. TIRF-SIM의 경우 그러나, 하나의 파장 최적화하면 다른 파장의 초점은 더 이상 TIR 링 내에 있다는 것을 의미합니다. 초점이 후방 개구와 TIR 링 내부 직경의 95 %로되어 예를 들어, 9 화소의 격자주기를 사용하여, 488 nm의 대한 TIRF를 제공하기에 충분하지만, 640 nm 인이 기간은 외부 초점 위치 할 조리개. 이러한 이유로 다양한 화소 패턴의 간격은 각각의 여기 파장에 사용되어야한다.
TIRF-SIM 여기 경로의 정렬극히 현미경 본체 (도 1에 DM4), 다이크로 익 미러의 위치의 작은 변화에 민감하므로 더 이상 종래 SIM이다. 회전 필터 큐브 터릿의 사용 대신에 사용 된 여기 파장에 대해 특별히 고정 위치에 유지되고 설계된 단일, 멀티 밴드 다이크로 익 미러를 사용하여, 권장되지 않는다. 단지 고품질 이색 거울이 사용되는 것이 필수적이다. 이들은 적어도 3mm의 두께의 기판을 필요로하며, 종종 제조사 별 "이미징 평면"으로 지정된다. 다른 모든 기판 TIRF-SIM에 견딜 수차 및 이미지 저하로 이어집니다.
편광 제어
TIRF-SIM을 달성하기 위하여 그것의 광축에 대하여 상기 대물 퓨필 평면 내의 방위각 편광 유지되도록 조명 패턴과 동 기적으로 상기 여기 광의 편광 상태를 회전하는 것이 필수적이다 (즉,. s 편광). 편광 제어 광학 정렬은 모터 회전 스테이지 (22)에 예를 들어, 사용되는 특정의 광학 소자에 포켈 셀 (21) 또는 반파 장판을 의존 할 것이다. 이 프로토콜에서 사용자 지정 액정 변수 지연 (LCVR)이 사용되는 파장 범위에 걸쳐 전파 (2π) 난연성을 제공하도록 설계되었습니다 488이 빠른 (~ 밀리 초) 전환을 허용하는 nm의 640. 액정 위상차 판을 사용하는 경우는 고품질의 부품을 사용하는 것이 필수적이다 표준 구성 요소는 일반적으로 리드 카메라 노출 시간의 길이에 걸쳐 일정한 난연성을 제공하기에 충분히 안정되지 않는 조명 패턴 및 낮은 변조 콘트라스트에서 모호 . 액정 지연 제는 강하게 온도 의존 및 온도 제어에 내장이 필요합니다.
동기화
레이저는 SLM과 동기화해야합니다. 이진 강유전체의 SLM 내부적들로 균형된다상태에와 국가 떨어져 사이의 매혹적인. 화소는 하나 또는 그 오프 상태가 아니라 간 스위칭시기에서와 반파 플레이트 역할을한다. 따라서, 레이저는 의해서만 화소의 중간 상태의 패턴 콘트라스트의 저하를 방지하기 위해 SLM의 인 에이블 신호를 통해 LED의 온 / 오프 상태시에서 스위칭되어야한다. 레이저는 디지털 변조 할 수없는 경우는 음향 광학 변조기 (AOM)은 대안 적으로 고속 셔터로 사용될 수있다.
렌즈의 선택
이러한 제한에 기초하여, 샘플 평면 상에 SLM 평면의 사이즈 축소 요구는 원하는 조명 패턴을 결정할 수있다 생성한다. 이 화상 중계 망원경 여진 집광 렌즈 L5에있는 두 렌즈 L3와 L4의 초점 거리의 계산을 허용한다. 이 시스템에서 100X / 1.49NA 오일 액침 대물 렌즈는 488 nm 내지 640 nm의 여기에 사용되며, 따라서 300 및 140mm의 초점 거리를 사용L3 및 L4, 시료면에서 38 nm 인 SLM의 화소 사이즈에 상당 357X 총 축소율을 부여 L5 300 mm의 대. 렌즈의 조합을 사용하여, SLM은 각각 70 ° 및 67 °의 입사각에 대응하는 488nm의 조명 및 샘플을 172, 229 nm의 패턴 간격을 줄 내지 640 12 화소 9 기간 격자. 유리 물 인터페이스의 임계각 따라서 이들 두 패턴 간격이 두 파장 용 TIRF 여기 있도록 61 °로하고, 파장에 무관하다. 37 ° C에서 동작하는 경우, 또는 교정 용 칼라를 구비 한 대물 렌즈 커버 슬립의 두께의 변화에 의해 도입 된 구면 수차의 보정이 유용하다.
이미지 재건
원시 SIM 데이터를 획득 한 후에는 두 단계에서 슈퍼 – 분해 된 이미지를 생성하기 위해 계산 노력의 문제이다. 우선, 조명 패턴을 결정해야모든 이미지 및 둘째, SIM 스펙트럼의 성분을 분리해야하며 효과적인 OTF 지원 (세트를도 6 참조)를 두배로 적절 재결합.
슈퍼 – 분해 된 주파수 성분이 중첩 요소의 잔여 부분으로 인한 아티팩트를 방지 섞이지 최대한 정확하게 할 필요로 투사 조명 패턴의 정확한 지식이 중요하다. 우리는 조명 패턴이 각각 찾을 수있다 구스타프손 외. 요컨대 23 정규화 이차원 정현파 설명 조명 파라미터들의 세트에 의해 도입 된 절차에 따라, 원시 이미지 데이터로부터 귀납적 파라미터 결정 여기 패턴 :
이에 과 프린지 대비 각각 각각의 이미지 m의 위상을 시작하는 패턴을 설명합니다. 전파 벡터의 성분 과 만 다른 방향으로 변경 패턴 및 캔의 다른 일정하다고 가정. 조악 오버랩을 최적화하도록 상호 상관 된 이미지 중 하나의 서브 픽셀 시프트를 적용하여 정제 원 화상의 스펙트럼의 교차 상관이 수행되는 웨이브 벡터의 요소를 결정한다. 이는 실제 공간 상 구배의 곱셈을 통해 이루어집니다 그 FRE의 서브 픽셀 변화를 유도이는 주파수 – 공간. 실제의 패턴을 추정하기 전에 웨이브 벡터의 양호한 추정을하는 것이 유용하며 이것은 형광 비드 층 묘화에 의해 발견 될 수 있습니다.
시프트 패턴 사이의 위상 단계이므로 즉. 주파수 성분의 분리는 "위상 축"함께 푸리에 변환에 의해 수행 될 수있다. 글로벌 위상 그리고 프린지 대비 다음, 다른 성분의 복소 선형 회귀를 사용하여 결정될 수있다. 각각의 분리 된 성분은 다음 일반화 위너 필터를 사용하여 결합된다. 일반화 된 위너 필터의 두 파라미터 추출 및 구현에 대한 자세한 설명은 우리가 구스타프손에 독자를 참조등. (23)와 동일한 알고리즘이 사용된다.
이와 프로토콜에 설명 된 설치와 같은 맞춤형 TIRF-SIM 시스템은 시판 현미경에 비해 고속으로 다색 초 – 해상도 이미징 할 수있다. 초 – 해상도 기술로서 SIM의 고유 한 이점은 시간적 해상도가 같은 단일 분자 지역화 현미경 (SMLM) 또는 유도 방출 고갈 현미경과 같은 점 주사 방식 (다른 방법에 비해 형광 물질의 광 물리학에 의해 제한되지 않는다는 STED). 여러 가지 빛깔의 영상이 간단하므로이 다른 기술과 달리, SIM은 광전 환성 또는 공핍 형광을 필요로하지 않습니다. 여기에보고이 개선 인자 반대로 SIM 및 다발성 SIM을 절편 광학 비 TIRF-SIM 시스템은 일반적으로 실질적으로 1.7 배 이하의 해상도의 향상을 달성 할 수 있고, 상용 시스템은 또한 시스템보다 종종 느리고 덜 유연 이 프로토콜에 발표했다.
">이 기술을 구현하는 두 가지 주요 어려움은, 우선 광학 정렬 절차 걸리는 수고와 시간을 필요로 대물 후면 개구의 TIR 영역 내의 여섯 SIM 빔의 정확한 위치에 대한 필요성이있다. 둘째, 높은 패턴 콘트라스트를 제조 샘플에서의 편광 회전이 낮은 NA 2D-SIM 시스템의 편광 회전이 직선 편광의 방향의 신중한 선택에 의해 회피 될 수있다. 필수적이지만, 이는 TIRF-SIM (25)에 대해 불가능하게된다. 고속 다색 이미징, 전기 – 광 편광 제어가 필요하고, 이는 시스템의 복잡성과 비용을 증가시킨다.기술의 한계
TIRF-SIM은 종래 TIRF 같은 자연적 생물학적 구조와 산장의 150-200 나노 침투 깊이에 의해 조명 될 수있는 기저 세포 막에있는 프로세스의 관찰에 한정된다. 동안SIM은 종종 STED 또는 SMLM이, 측면 해상도 배로 여전히 기존의 TIRF 현미경에 비해 최소 4 배 5 광자의 필요한 수를 증가 않는 하나 이상의 세포에 덜 photodamaging 것으로 인용된다. 짧은 노출 시간을 갖는 고속 프레임 레이트로 촬상,이 광자의 증가는 증가 된 조명 세기를 이용 필요로한다. 어떤 형광이 고정 또는 저속 이동 샘플, 고휘도 형광 단백질 또는 향상된 광 안정성과 차세대 합성 염료의 SIM 이미징을 위해 사용될 수 있지만 라이브 세포 이미징을 권장합니다.
이 구현은 20 Hz를 초과하는 SIM 프레임 레이트에서 하나의 색상을 묘화 할 수 있지만, 표시 시스템의 다색 화상이 전동 발광 필터 휠의 절환 시간에 의해 제한된다. 인해 sCMOS 카메라 칩의 큰 크기로, 멀티 밴드 방출 필터와 이미지 분할 광학계의 이용이 가능하고 동시에 전을 허용 할더 속도 저하 여러 파장 maging. 또 다른 가능성은 상이한 여기 레이저를 대체하고 여기 광을 거부하는 다중 대역 노치 필터를 사용하는 것이다. 이 구현에서 이진 강유전체 SLM의 사용은 최적이 아니다. 입사광의 대부분은, 공간 마스크에 의해 필터링되는 0 차 반사되어 있으므로 이러한 SLM의 회절 효율은 매우 낮다. 높은 프레임 레이트를 요구하는 애플리케이션을 위해, 촬상 속도를 따라서 레이저 다이오드의 출력 전력에 의해 제한된다. 은 SLM은 멀리 픽셀이 이상적인 반 파장 판을 사용하지 않는 550 nm의 설계 파장과 파장에 대한 편광의 일부 타원율을 소개합니다. 이 추가 LCVR를 사용하여 보상 될 수 있지만, 최적의 해결책은 패턴 발생기로서, 디지털 마이크로 미러 디바이스 (DMD)를 사용할 수있다.
가능한 수정
설치 prese여기 nted 유연하고보다 쉽게 3D-SIM 고속 2D-SIM, SIM 병소 (MSIM) 비선형 SIM (NL-SIM)되도록 다른 영상 방식이 21,34,35 구현 될 수 상용 상품보다 변경된다.
2D-SIM은 빠른 등 주변 소포체로 구조를 이동, 상대적으로 평면 이미징에 적합 할 수있다. 주변 ER 인해 그 평면 구조에 TIRF 산장하지만를 사용하여 조명 할 수있는 것보다 세포 내 깊은 거짓말을하는 것은 무시할 포커스 아웃 배경으로 표준 2D-SIM을 사용하여 몇 군데 할 수 있습니다. 또한, 개선 된 광 단면 재구성 알고리즘의 사용은 빛이 광학적으로 두꺼운 샘플이이기는 축 해상도가 21 배로하지 않아도되는 2D-SIM의 사용을 확장 포커스 아웃 억제.
MSIM에서, 샘플은 여기 초점 (36)의 성긴 격자에 의해 조명된다. 이러한 양상은 SM (단순히 공간 마스크를 제거함으로써 구현 될 수있다) 및 편광판을 교체. 은 SLM 이제 진폭 변조기로 작동합니다. 는 SLM에 표시된 이진 SIM 격자는 이미지 평면의 회절 제한된 초점의 크기와 동일하도록 선택 스폿의 크기와, 스폿의 2 차원 격자에 의해 대체 될 수있다. 도 7a에서, 4 x 4 픽셀 사각형의 격자는 13.62 μm의의 물리적 SLM의 픽셀 크기 주어진 샘플로 축소된다 때 150 × 150 나노 미터의 회절 제한 초점을 생성하는 SLM (삽입)에 표시됩니다. 여기 초점 다음 SLM상의 격자 패턴을 시프트에 의해 번역 될 수 있고,이보기의 전체 필드를 조명하기 위해 여러 번 반복된다. 이미지는 각각의 번역 패턴의 위치를 취득 스택이되어 배까지의 향상된 해상도의 복원 영상을 생성하는 후 처리 감소 등이 해당 위드 이미지에 비해 아웃 오브 포커스획득 시간은 원시 프레임의 다수로 인해 증가하지만 30.이 양상은 표준 SIM은 염색 적혈구 (도 7c)으로 예를 들어 콘트라스트가 낮은 구조에 대해서는 부적합되는 두꺼운 치밀한 샘플을 영상화하는 데 유용 할 수있다 (이 경우 = 168 N에서) 시야 당이 필요합니다.
리 등에 의해 최근에 제시된 마지막 설치 높은 NA 선형 TIRF-SIM 또는 패터닝 활성화 비선형 SIM (PA NL-SIM)를 사용하도록 변경 될 수있다., 초고 1.7 NA 대물 또는 부가를 사용하여 405 나노 미터 photoactivation 레이저 및 SLM 격자 패턴 (35)의주의 최적화.
미래의 응용 프로그램
SIM은 여전히 빠르게 진화하는 기술과 생명 과학의 많은 응용 프로그램은 미래에 활성화됩니다. 기술의 속도, 해상도, 콘트라스트 향상 및 표준 형광체의 m을 사용하는 능력EAN은 bioimaging 위해 SIM 그러한 촛점 넓은 필드 플랫폼과 같은 종래의 수많은 현미경 시스템을 대체하기 위해 설정된다. 상용 SIM 시스템 결정적들이 수정 분야에서 최근 연구 개발을 구현하기 위해 개발 될 융통성 있으며, 그러나, 많은 연구 실험실의 금융 도달 넘어서는 뛰어난 기술 사양 오늘날 이미 사용할 수 있으며. 이들은 또한 필수적인 능력 에지 생명 과학 연구 절삭 종종 심각한 병목 '손 실험에 적용될'으로 부족하다. 여기에 설명 된 시스템은 특히 예를 들면 재료 및 물리학에서 표면 화학을 연구하기 위해, 재구성 이중층 시스템을 시험 관내 연구를 위해, 세포 표면 근처 동적 프로세스를 연구하기에 적합한 것이다. 2D 재료, 및 기타 여러 응용 프로그램.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 레버 흄 신뢰, 공학 및 물리 과학 연구위원회에서 교부금에 의해 지원되었다 [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1] 알츠하이머 리서치 UK [ARUK EG2012A-1]; 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) [089703 / Z / 09 / Z] 의료 연구위원회 [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. 우리는 HEK293 문화의 준비를 위해 각각 LifeAct-GFP의 형질 전환 및 세포질-GFP 세포에 대한 E. Avezov와 M. 루, 감사 및 W. 첸. 우리는 또한 유용한 토론과 제안 현미경의 디자인 지원 K. O'Holleran 감사 및 L. 샤오와 R. Heintzmann.
488 nm laser | Toptica | iBeam SMART | with digital modulation |
561 nm laser | Coherent | OBIS LS | with digital modulation |
640 nm laser | Cobolt | MLD | with digital modulation |
Long-pass dichroic mirrors | Thorlabs | for combining excitation beams | |
Quad band dichroic mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | 3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube |
Quad band dichroic mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | From same batch as above, 25 x 25 mm |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-860 | |
Glan-Taylor calcite polarizers | Thorlabs | GT5-A | For alignment of LCVR |
Glan-Taylor mount | Thorlabs | SM05PM5 | |
Achromatic half wave plate | Thorlabs | AHWP05M-600 | 400 – 800 nm |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1/M | For HWP |
Liquid Crystal Variable Retarder | Meadowlark Optics | SWIFT | Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm. |
LCVR controller | Meadowlark Optics | D3060HV | Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders |
Achromatic quarter wave plate | Meadowlark Optics | AQM-100-0545 | |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1P/M | For QWP |
10 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC080-010-A-ML | For beam expander |
200 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC254-200-A-ML | For beam expander |
Cage XY Translators | Thorlabs | CXY1 | |
Ferroelectric spatial light modulator | Forth Dimension Displays | M0787-00249 | SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1280 x 1024 pixels, with driver board |
SLM mounting frame | Forth Dimension Displays | M0787-10014 | Fixed to custom built aluminium mount |
Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount | Thorlabs | GM200/M | For SLM mounting |
Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform | Thorlabs | XYR1/M | For SLM mounting |
Rail carrier | Newport | M-PRC-3 | For SLM mounting |
Precision Optical Rail | Newport | PRL-6 | For SLM mounting |
300 mm achromatic doublet lens | Qioptiq | G322 273 322 | f = 300 mm, 31.5 mm diameter |
140 mm achromatic doublet lens | Qioptiq | G322 239 322 | f = 140 mm, 31.5 mm diameter |
Precision XY Translation Mounts | Thorlabs | LM2XY | |
Lens Mounting Adapters | Thorlabs | SM2AD32 | For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts |
Translation stages | Comar | 12XT65 | Dovetail, side drive |
XY Translator with Differential Drives | Thorlabs | ST1XY-D/M | for spatial filter |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1/M | for spatial filter |
300 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC508-300-A-ML | Excitation tube lens |
Automated XY stage with Z-piezo top plate | ASI | PZ-2150-XYFT-PZ-IX71 | with MS-2000 controller |
Inverted microscope frame | Olympus | IX-71 | |
Objective lens | Olympus | UAPON100XOTIRF | 100X/1.49NA |
High speed filter wheel | Prior Scientific | HF110A | with Prior ProScan III controller |
Bandpass emission filters | Semrock | FF01-525/30, FF01-676/29 | |
sCMOS camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | |
Stage top incubator | OKO Lab | H301-K-FRAME | For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers |
Stainless steel optical posts | Thorlabs | TR series | for mounting optical components |
Post holders | Thorlabs | PH series | for mounting optical components |
Kinematic mirror mounts | Thorlabs | KM100 | for mounting 1" mirrors |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | |
100 nm fluorescent microspheres | Life Technologies | T-7279 | Tetraspeck |
Rhodamine 6G | Sigma Aldrich | 83697-250MG | |
8 well glass bottom dishes | ibidi | 80827 | with #1.5 coverglass |
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | with #1.5 coverglass |
0.01mm microscope reticle slide | EMS | 68039-22 | |
CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific | C10613 |