Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.
형태 형성에 대한 대부분의 연구는 특정 유전자와 유전자 경로의 장애에 의해 영향을받는 방법을 해부학 적 특성의 질적 설명에 의존하고 있습니다. 유전자 조작이 표현형 효과의 범위를 생산하고 변형도 제어 그룹 내에서 개인들 사이에서 관찰되지만 정량적 설명은 거의 수행되지 않습니다. 증거를 신흥 형태, 크기 및 세포 소기관의 위치가 세포 기능과 생존에 이전에 과소, 아직 근본적인 역할을한다는 것을 보여줍니다. 여기에서 우리는 초파리 애벌레 신경 근육 접합부 (NMJ)에서 표현형의 정량 분석을 수행하기위한 단계별 지침을 제공합니다. 우리는 바이오 이미징 기술 및 형태 학적 특정 세포 과정에 유전자 돌연변이의 효과를 조사하는 분석과 함께 신뢰할 수있는 여러 면역 조직 화학적 마커를 사용한다. 특히, 형태, 크기 및 (N)의 위치에 영향을 미치는 표현형의 정량 분석에 집중uclei 초파리 유충의 가로 무늬 근육 내. 초파리 애벌레 NMJ 건강과 질환에서 두 구조 및 신경 근육 시스템의 기능을, 기초가되는 분자 메카니즘을 조사하기 위해 유용한 실험적 모델이다. 그러나, 여기에서 설명하는 방법은 다른 시스템으로 확장 될 수있다.
Qualitative analysis restricts the focus of most experimental studies to the examination of genetic manipulations leading to large phenotypic effects or to phenotypes that are not amenable to quantification, e.g., absence/presence. Quantification of phenotypes is not usually performed and variations present within members of a phenotypic group are not taken into consideration. Additionally, without mathematical descriptions of morphologies, it may be difficult to determine whether fine scale phenotypic changes are the result of genetically induced alterations or whether observed changes are simply due to random fluctuations.
We propose that for an accurate and unbiased analysis of phenotypic defects due to gene disruption, quantitative methodologies should accompany more traditional qualitative approaches. Quantitative evaluation of phenotypes is particularly beneficial for structures such as synapses that present a high degree of variability due to their intrinsic morphological and functional plasticity. We have selected examples of quantitative analyses applied to areas of investigation with which we are most familiar, namely the Drosophila larval neuromuscular junctions (NMJs). However, concepts and principles apply equally well to other experimental systems.
The larval NMJ is an excellent model system to study synaptic development and function because of the highly stereotyped nature of its structure. Each hemi-segment of the larval neuromuscular system contains 32 identifiable motor neurons forming synaptic contacts with their postsynaptic target muscle. Every hemi-segment also contains a fixed number of muscles visible as multinucleated fibers attached to the internal surface of the cuticle1. Another advantage of using the larval neuromuscular system is the power and versatility of Drosophila genetics that easily allows the generation of a number of mutant alleles and the possibility to modify gene expression in a time- and tissue-restricted manner. Finally, 75% of the human genes causing a disease have an evolutionarily conserved orthologue in Drosophila2. Indeed, entire genetic pathways are conserved between flies and humans. Because of this, the Drosophila larval neuromuscular system is a very popular experimental model to elucidate the molecular mechanisms underlying a number of human diseases including amyotrophic lateral sclerosis (ALS)1.
Here we show that the availability of several reliable immuno-histochemical markers, combined with bio-imaging techniques and accurate morphometric analyses can describe anatomical traits that are likely to play an important functional role3,4,5. Among the cellular processes that are amenable to quantitative analyses, we focus on changes in shape, size and position of intracellular structures such as the nuclei. All these are processes that we know very little about.
The challenge for molecular geneticists in the coming decades will be to extend our current knowledge by analyzing the effect of genetic mutations that produce very subtle phenotypic defects. Quantitative methodologies that allow researchers to meticulously explore the effects of genetic mutations can provide a more comprehensive understanding of how genotypes relate to phenotypes, especially for poorly understood cellular processes.
과거에는 내 실험 집단 간의 형태 학적 변화는 거의 고려되지 않았다. 그러나, 양적 방법의 응용 프로그램은 이제 형태와 해부학 적 형태의 수학적 설명을 비교 연구의 표준이 계산되고있다. 정량의 사용은 특정 세포 과정에 유전자 조작의 효과를 평가하는 분석, 형태 학적 변화를 감지 할 수있는 능력을 향상에 이러한 변경 사항이 설명되어있는 정확성을 개선 약속을 개최합니다. 또한, 정량적 데이터의 통계 분석은 우리가 표현형 사이 관찰 차이가 중요 여부를 평가 할 수 있습니다.
가로 무늬 근육에서 핵은 별개의 둥근 구조를 나타내고 균등하게 근육 섬유를 따라 배포됩니다. 구축 및 크기, 모양 및 핵의 구조를 유지하는 분자 메커니즘은 알려져 있지 않지만, 이러한 핵 기능은 가능성이 t이다오 근육 기능을 제어에 근본적인 역할을한다. 사실, 여러 근육 병증은 근육 내에서 핵의 형태와 위치를 조절하는 유전자의 돌연변이에 의해 발생합니다. 모양 및 세포 내의 핵의 분포의 기능적 중요성이 근육에 한정되지 않는다. 축적 된 증거 핵 결함 또한 파킨슨 병 18,24 같은 신경 퇴행성 질환과 관련되어 있음을 나타낸다. 또한, 우리는 그 형태, 크기 및 소포체 기능적인 결과를 초래할 수있다 미토콘드리아를 포함하여 다른 세포 소기관의 세포 내 분포를 감사하기 시작했다. 예를 들어, 미토콘드리아 형태의 변화는 이러한 시신경 위축의 유형 1 (OPA1)과 샤르코 – 마리 – 투스 형 2A 신경 병증 (25)과 같은 신경 학적 장애와 관련이있다.
이러한 중요한 과정의 기초가되는 분자 메카니즘을 해명 과정을 돕기 위해, 고해상도 촛점을 결합 제안이미징 소프트웨어 및 형태 학적 데이터와 정량적 유전자 조작 근육 섬유 내의 핵의 형상, 크기 및 위치에 미치는 영향을 평가하기 위해 분석한다. 초파리 애벌레의 신경 근육 시스템의 높은 박힌 자연과 전원과 함께 초파리 유전학의 다양성은 애벌레 NMJ에게 분석이 유형에 적합 실험 모델을합니다. 애벌레 NMJs에서 표현형 분석 NMJs의 번호가 동일한 플라이에서 연구 될 수 있으며, 심지어 같은 식별 NMJ 다른 유전자형 3,4의 플라이 사이에 비교 될 수있는 정확한 형태 학적 분석을 허용하는 하나의 시냅스 해상도로 수행 될 수있다.
초파리 애벌레 NMJ에서 핵의 위치, 모양과 크기의 표현형 특성은 근육 내의 근육과 핵을 강조 항체와 해부 NMJs의 면역 염색을 수행하여 시작합니다. 프로토콜에서 생에 설명의 종이, myonuclei 전체 근육을 얼룩 DVAP하는 특정 핵 인테리어와 함께 항체를 강조 핵 마커, 라민, 핵 봉투의 마커에 대한 클론 항체로 염색 하였다. 이 실험에 사용 된 항체는 라민 친절 폴 피셔 19-22에서 제공되었지만 항 라민 항체의 다른 소스가 사용될 수있다. 또한, 핵막에 대한 특정 항체의 다른 다수 시판되고있다. 근육이 안티 굴지 또는 항 – 튜 불린 항체로 염색하여 시각화 할 수있는 동안 마지막으로, DAPI와 프로피 듐 요오드화 핵 마커,도 사용할 수 있습니다. 이 실험 절차에서 사용되는 것 이외의 항체가 사용되는 경우, 면역 프로토콜 정착 조건으로 새로운 작업 항체 농도가 최적화 될 필요가있는 여분의 단계가 필요할 것이다. 볼륨 렌더링 분석 할 필요 특히이 프로토콜에서 하나의 중요한 단계는 일이다전자 슬라이드의 샘플의 설치. 이 경우, 슬라이드 시험편 으깨되지 않도록 커버 슬립 사이에 스페이서를 포함하는 것이 중요하다. 커버 슬립의 양쪽에 슬라이드 감싸 셀룰로스 테이프의 세 밴드는 스페이서를 만드는 쉬운 방법을 나타냅니다.
ImageJ에이 2D 이미지에 사용 된 반면, 3D 멀티 채널 이미지의 대부분은이 논문에서 제시된 분석, 때문에 사내 가용성 Imaris을 사용하여 수행 하였다. 그러나, 임의의 다른 유사한 상용 소프트웨어 패키지는 이들 애플리케이션에 사용될 수있다.
공 초점 이미지의 분석에 사용할 수 (예, ImageJ에, CellProfiler, Vaa3D, 얼음, KNIME과 다른 사람에 대한) 여러 오픈 소스 및 상용 소프트웨어 플랫폼이 있습니다. ImageJ에 (26), 피지 (27)로 알려진 NIH 또는 그 이상의 개선 된 버전의 무료 소프트웨어는 전 세계 영상 COMMUNI 사용할 수 가져 오기 필터, 매크로 및 플러그인의 큰 숫자를 가지고타이. 이러한 플러그인 대부분 슬라이스 – 바이 슬라이스 방식의 정보 처리에 초점을 맞추고있다. 멀티 3D 이미지의 시각화 및 분석을 위해 사용할 플러그인이있다. 그러나, 그들은 종종 특정 작업을 위해 설계되었으며, 사용자는 자신의 필요에이 플러그인을 확장하거나 적응해야 할 수도 있습니다. 한편, 상업 플랫폼은 비교적 경험이없는 사용자를 대상으로 종종 놀라운 속도로 화상 처리 작업을 용이하게 사용이 넓은 범위에 집중된다.
이 프로토콜에 설명 된 양적 표현형 분석과 함께 실험 절차는 세포 기관의 형태 및 세포 내에서의 분포를 제어하는 분자 메커니즘을 해명에 도움이됩니다. 그러나,이 접근법은 특정 엔드 포인트에서 이러한 프로세스를 분석 명백한 한계가있다. 형태 및 세포 소기관의 분포를 제어하는 과정은 매우 역동적 될 및뿐만 아니라 다른 세포 타이 사이에서 변화 할 가능성이있다발달 또는 생리적 상태에 따라 같은 셀 내의 PES뿐만 아니라. 이러한 분석의 추가의 구현은 세포 소기관의 형태 및 위치의 변화가 시간에 걸쳐 모니터링 될 수있게 시간 경과 영상으로 표시된다.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Dr. Andrea Chai for her insightful comments on the manuscript. This work was supported by the Wellcome Trust (grant number: Pennetta8920) and by the Motor Neuron Disease Association (grant number: Pennetta6231).
Micro-Forceps 0.3×0.25 mm | Fine Science Tools | 11030-12 | |
Sylgard dissection plates | SIGMA-ALDRICH | 76103 | Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60ºC for at least 24 hours |
Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Microdissection scissors (ultra-fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7 | NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653) | ||
Bouin's Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1) | Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706) | ||
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1xPBS +0.1% Triton | Triton-X100. SIGMA-T8787 | ||
Normal Goat Serum | SIGMA | G9023 | |
Guinea Pig anti-DVAP antibody | Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at !:200 dilution in 5% NGS | ||
Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
Rabbit anti-Lamin antibody | Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS | ||
TO-PRO-3 | Molecular Probes | T3605 | |
Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-295G-A555-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-0358G-Cy3-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
Vectashield mounting medium for fluorescence | Vector laboratories | H-1000 |